VERSION 1 – EFFECTIVE DATE: 01/01/2016 PREPARATION OF GIEMSA STOCK SOLUTION MALARIA MICROSCOPY STANDARD OPERATING PROCEDURE – MM-SOP-02 1. PURPOSE AND SCOPE To detail the procedure for preparing a stock solution of Giemsa stain for routine staining of malaria thick and thin blood films. This procedure is to be modified only with the approval of the national coordinator for quality assurance of malaria microscopy. All procedures specified herein are mandatory for all malaria microscopists working in national reference laboratories, in hospital laboratories or in basic health laboratories in health facilities performing malaria microscopy. 2. BACKGROUND Giemsa is the most commonly used stain for staining blood films for malaria diagnosis. It is available commercially as a ready-to-use product, but the quality varies according to the source. To ensure a consistently high-quality stain and a standardized product, it can be prepared by the reference laboratory of the national malaria programme and distributed to hospital or basic health laboratories in health facilities performing malaria microscopy. When simple rules are followed in the production of Giemsa stock, the stain produced at national or provincial level may be superior to that available commercially. 3. SUPPLIES, MATERIALS AND EQUIPMENT To make 500 mL of Giemsa stain, the material required is: • Giemsa powder or stain, 3.8 g (preferably Biological Stain Commission grade, to ensure a very good product of standard quality; • absolute methanol, pure, high-grade, acetone-free, 250 mL; • glycerol, high-grade, pure, 250 mL; • methanol-cleaned solid glass beads, 3–5 mm in diameter, 50–100 pieces; • a spatula or measuring spoon; • weighing paper; • a graduated cylinder; • a glass or plastic funnel; • a screw-capped, dark or amber glass bottle, clean and dry, 500-mL capacity (If not available, a chemically clean, dry, clear hard glass or polyethylene bottle of suitable size may be used, but should be wrapped in dark paper); • an analytical balance capable of weighing to 0.01 g; and • a shaker, if available. 4. SAFETY PRECAUTIONS • Methanol and Giemsa stain are inflammable and highly toxic if inhaled or swallowed. Avoid contact and inhalation. When they are not in use, they should be stored in a locked cupboard or cabinet. • Universal precautions – including use of relevant personal protective equipment such as gloves, safety glasses and a laboratory coat or gown – must be practised. See MM-SOP-11: General safety procedures in the malaria microscopy laboratory. 2MM–SOP–02: PREPARATION OF GIEMSA STOCK SOLUTION 5. PROCEDURE FLOW CHART DESCRIPTION OF ACTIVITY 1. Place about 50 beads in a bottle. 2. Weigh 3.8 g Giemsa powder and pour into bottle. 3. Gently pour in about 100 mL of methanol. 4. Tighten the screw cap on the bottle, and shake in a circular motion for 2–3 min. 5. Add 250 mL glycerol to the mixture, and shake for 3–5 min. 6. Add the remaining 150 mL of methanol. 7. Tighten the screw cap on the bottle. 8. Continue shaking for 2–3 min, six times on the first day. 9. Shake every day for at least 7 days. 10. Label the bottle clearly, and document in the quality control log book. 11. Tighten the screw-cap on the bottle, and store it in a cool place away from direct sunlight. 1. Place about 50 methanol-cleaned glass beads into a dark or amber bottle. 2. Weigh 3.8 g of Giemsa stain powder on an analytical balance, and pour it into the bottle containing the beads through a funnel. 3. Gently pour in about 100 mL of methanol, ensuring that all dry stain is washed into the bottle. 4. Tighten the screw cap on the bottle. and shake it in a circular motion for 2–3 minutes to start dissolving the stain crystals. 5. Add 250 mL glycerol to the mixture through the funnel, and shake again for 3–5 minutes. 6. Add the remaining 150 mL of methanol to the mixture through the funnel, ensuring that the last of the methanol washes the last of the glycerol from the funnel into the stain mixture. 7. Tighten the screw-cap on the bottle. 8. Continue shaking for 2–3 minutes each about six times on the first day. 9. Shake every day for 2–3 minutes each about six times for at least 7 days. A shaker maybe used, if available. 10. Label the bottle clearly with the batch number, the name of the person who prepared the stock, date of preparation and date of expiry, and document in the quality control log-book. Giemsa stock solution Batch No.: 2015-01 Prepared by: First name Last name Date prepared: 17 Aug 2015 Expiry date: 17 Aug 2017 #2015-01 indicates the year prepared and the stock number. 11. Tighten the screw-cap on the bottle to prevent absorption of water vapour from the air, and store in a cool place away from direct sunlight. 3MM–SOP–02: PREPARATION OF GIEMSA STOCK SOLUTION 6. PROCEDURE NOTES • The bottle should be tightly capped at all times to prevent absorption of water vapour and to avoid evaporation and oxidation of the stain by high humidity. If the bottle is tightly stoppered and free of moisture, the Giemsa stain is stable at room temperature for longer. • Store in a dark glass bottle in a cool, dry, shady place, away from direct sunlight. If a clear stock bottle is used, wrap it in thick dark paper to avoid light penetration. • Do NOT shake the stock Giemsa bottle for at least 24 hours before use to avoid re-suspending the precipitates, which will settle on blood films during staining and obscure important details during microscopy. • Do NOT contaminate the stock Giemsa solution with water; even the smallest amount of water will cause the stain to deteriorate, making staining progressively ineffective. • For daily requirements, measure and filter small amounts of stain into a tightly capped bottle (about 25–50 mL), so that the stock solution is less likely to be contaminated. • Do NOT put or use a wet or soiled pipette into the stock Giemsa solution. • Do NOT return unused or leftover stain to the stock bottle or to the bottle containing the working solution; stain that is out of the bottle must be used quickly or discarded. 7. QUALITY CONTROL AND DOCUMENTATION • Perform a quality control check: · for every new batch or lot of stock solution prepared, · before using it as a working solution during Giemsa staining, · before sending it to laboratories for use and · in the field, after receiving if from a national reference laboratory. • Record information in the quality control logbook. See MM-SOP 3c, Quality control of Giemsa stock solution and buffered water, for routine staining of malaria blood films. 8. RELATED SOPs MM-SOP 3c: Quality control of Giemsa stock solution and buffered water MM-SOP-04: Preparation of Giemsa working solution 9. REFERENCES Storey J. Standard operating procedures for Giemsa malaria microscopy. 2012 (unpublished). WHO. Basic malaria microscopy. Part 1. Learner’s guide. Geneva; 2010. Centers for Disease Control and Prevention. Laboratory diagnosis of malaria. Staining for malaria parasites. Atlanta, Georgia; 2013 (http://www.cdc.gov/dpdx/resources/pdf/benchAids/malaria/malaria_ staining_benchaid.pdf, accessed 14 December 2015). 10. Document history Date (mmm/yyyy) Version Comments Responsible person (First name, last name) Jan 2016 1 Reviewed and finalized by experts, edited and formatted Glenda Gonzales, Technical Officer, WPRO WHO/HTM/GMP/MM/SOP/2016.02 © World Health Organization 2016. All rights reserved.
الإصدارة 1 - تاريخ بدء النفاذ: 1 كانون الثاني/ يناير 6102 تحضير المحلول الخام لصبغة الجيمسا الإجراءات التشغيلية المعيارية للفحص المجهري للملاريا - 20-POS-MM الغرض والنطاق. عــرض تفاصيــل إجــراءات تحضيــر كمية كبيــرة (خــام) مــن محلــول صبــغ الجيمســا المســتخدم في الصبــغ الروتيني لشــرائح الــدم المســتخدمة في تشــخيص الملاريــا ســواء الســميكة أوالرقيقة. يحظــر إجــراء أي تعديــل في هــذه الإجــراءات دون موافقة المنســق الوطنــي المعنــي بضمان جــودة الفحــص لتشــخيص الملاريــا. ينبغي علــى كل من يجري الفحــص المجهري لتشــخيص الملاريا الالتــزام بجميع الإجــراءات المذكورة بهذه الوثيقة، ســواء مــن العاملــن بالمختبرات المرجعيــة الوطنية أو مختبرات المستشــفيات أو مختبــرات الصحــة العموميــة بالمرافق الصحيــة التي تجــري الفحص المجهــري لتشــخيص الملاريا. معلومات أساسية. تعد الجيمســا أشــهر الصبغات المســتخدمة في صبغ شــرائح الدم بغرض تشــخيص الملاريا. وهي متاحة تجارًيــا في صورة منتج جاهز للاســتخدام، ولكــن تختلف جودتهــا بحســب المــورد. لضمــان دوام الحصــول على صبغــة ذات جــودة عاليــة ومنتــج يتماشــى مــع المعايير القياســية، يتــم تحضير الصبغة في مختبرات مرجعيــة تتبع برنامج الملاريــا الوطني، وتــوزع على المستشــفيات أو مختبرات الصحــة العمومية بالمرافق الصحيــة التي تجري الفحــص المجهــري لتشــخيص الملاريا. فعنــد اتبــاع قواعد بســيطة أثنــاء إنتــاج المحلــول الخام للجيمســا، قــد تتفوق هــذه الصبغــة المصنوعــة على المســتوى الوطنــي أو المحلي علــى تلك المتاحــة تجاريا.ً اللوازم والمواد والمعدات . فيما يلي اللوازم المطلوبة لإعداد 005 ملليلتر من صبغة الجيمسا، مطلوب المواد الآتية: 8.3 غــرام من مســحوق أو صبغة الجيمســا (يُفضــل نوعية تابعــة للجنة الصبغــة البيولوجيــة لضمان الحصــول على منتجــات جيدة ذات جودة قياســية. 052 ملليلتر ميثانول صرف نقي ذات جودة عالية، وخال من الأسيتون 052 ملليلتر من الجلسرين النقي ذات الجودة العالية خرز زجاجي مصمت مطهر بالميثانول، قطره 3-5 ملليمتر، حوالي 05-001 خرزة ملوق أو ملعقة قياس ورق للوزن أسطوانة/مخبار مدرج قمع زجاجي أو بلاستيكي قنينة مــن الزجــاج بغطــاء، لونهــا داكــن أو كهرمانيــة اللــون، نظيفــة وجافــة، ســعتها 005 ملليلتــر (إذا لم تتوفــر، يجــوز اســتخدام قنينة شــفافة من البولي إيثيلــن أو الزجــاج الصلــد، ذات حجم مناســب، علــى أن تكــون جافة ونظيفــة مــن الناحيــة الكيميائية، ومغلفــة بورق داكــن اللون). ميزان تحليلي تصل قدرة قياسه إلى 10.0 غرام رجاج، في حالة توافره احتياطات السلامة. يصنــف الميثانول والجيمســا ضمــن المــواد القابلة للاشــتعال. وهــي تنطوي علــى درجة عاليــة من الســمية في حالــة استنشــاقها أو بلعها، ومن ثم ينبغــي تجنــب ملامســتها أو استنشــاقها. وفي حالة عــدم الاســتخدام، يجــب تخزينها في مــكان أو خزانــة مغلقة. تدابير عامــة - من بينها اســتخدام معــدات الحماية الشــخصية مثل القفــازات والنظــارات الواقية والــرداء الخاص بالمختبــر (أو معطف المختبر). 20-POS-MM: تحضير المحلول الخام لصبغة الجيمسا 2 الإجراءات. وصف النشاطالرسم التخطيطي 1. ضع حوالي 05 خرزة في القنينة. 2. زن حوالي 8.3 غرام من الجيمسا واسكبها في القنينة. 3. اسكب برفق حوالي 001 ملليلتر من الميثانول. 4. اغلق القنينة بإحكام، ورجها في حركة دائرية لمدة 2-3 دقائق. 5. أضف 052 ملليلتر من الجلسرين إلى الخليط، ورجه لمدة 3-5 دقائق. 6. أضف 051 ملليلتر المتبقية من الميثانول. 7. اغلق القنينة بإحكام. 8. استمر في الرج 2-3 دقائق، ست مرات في اليوم الأول. 9. رج الخليط يومًيا لمدة سبعة أيام على الأقل. 01. ضع ملصق التوصيف على القنينة، ودونها في سجل مراقبة الجودة. 11. تأكد من غلق القنينة بإحكام، وخزنها في مكان بارد بعيًدا عن التعرض المباشر لأشعة الشمس. ضــع حوالــي 05 خــرزة زجاجيــة مطهــرة بالميثانــول في قنينة . 1 داكنــة أو كهرمانيــة اللــون. زن 8.3 مــن بــودرة الجيمســا باســتخدام الميــزان التحليلــي، . 2 ثــم اســكبها في القنينــة التــي تحتــوي على الخــرز باســتخدام ا لقمع . اســكب برفــق حوالــي 001 ملليلتــر مــن الميثانــول، مــع ضمان . 3 تدفــق كميــة الصبغــة الجافــة بأكملهــا داخــل القنينة. اغلــق القنينــة بإحــكام، ورجهــا في حركــة دائريــة لمــدة 2-3 . 4 دقائــق حتــى تبــدأ بلــورات الصبغــة في التحلــل. أضــف 052 ملليلتــر مــن الجلســرين إلــى الخليط باســتخدام . 5 القمــع، ثــم رج الخليط مــرة أخــرى لمــدة 3-5 دقائق. أضف الكميــة المتبقية من الميثانــول (051 ملليلتر) باســتخدام . 6 القمــع، مــع ضمــان تدفــق كميــة الجلســرين بأكملهــا إلــى الخليــط بالقنينــة. احكم غلق القنينة.. 7 اســتمر في الرج لمــدة 2-3 دقائــق، تُكرر ســت مــرات في اليوم . 8 الأول. رج الخليــط يومًيــا لمــدة 2-3 دقائق، ســت مــرات، علــى مدار . 9 ســبعة أيام، ويمكــن اســتخدام رجــاج إن وجد. ميــز القنينــة بملصــق التوســيم الــذي يوضــح رقــم الفئــة/. 01 المجموعة واســم الشــخص الذي أعــد المحلول الخــام، وتاريخ التحضيــر، وتاريــخ انتهــاء الصلاحيــة، ودون ذلــك بســجل مراقبــة الجــودة. محلول مخزون جيمسا رقم الفئة/المجموعة: 5102-10 إعداد: الاسم ولقب العائلة تاريخ التحضير: 71 آب/أغسطس 5102 تاريخ انتهاء الصلاحية: 71 آب/أغسطس 7102 # 5102-10 يشير إلى سنة التحضير، ورقم المحلول الخام احكــم غلــق القنينــة لمنــع امتصــاص بخــار المــاء مــن الجــو، . 11 وخزنهــا في مــكان بــارد بعيــًدا عــن التعــرض المباشــر لأشــعة الشــمس. 20-POS-MM: تحضير المحلول الخام لصبغة الجيمسا 3 ملاحظات تتعلق بالإجراءات. يجب إحكام غلــق القنينــة في جميع الأوقــات لمنع امتصــاص بخار المــاء، وتجنــب تبخر الصبغــة وأكســدتها بفعــل الرطوبة العاليــة. وكلما كانــت القنينــة مغلقة بإحــكام وخالية مــن الرطوبــة، ظلت صبغة الجيمســا محتفظــة بحالتهــا في درجة حــرارة الغرفــة العادية لمــدة أطول. خزن الصبغــة في قنينة مــن الزجاج الداكن في مــكان بارد وجاف ومغطى دون التعرض المباشــر لأشــعة الشــمس. وإذا تم اســتخدام قنينة شــفافة، قم بتغطيتها بورق ســميك داكن اللون لتجنب تســرب الضــوء إليها. لا ترج قنينة محلول الجيمســا لمدة 42 ســاعة علــى الأقل قبل الاســتخدام لتجنب إعادة الرواســب الراكدة، التي ستترســب على شــريحة الدم خلال عملية الصبــغ، وتحجب رؤيــة تفاصيل مهمة خــلال عملية الفحــص المجهري. لا تلــوث محلول الجيمســا الخام بالماء؛ فسيتســبب أي قــدر من المــاء حتــى وإن كان قليًلا، في تدهــور حالــة الصبغة، مما ســيجعل عملية الصبــغ غير فاعلــة بالتدريج. بالنســبة للاحتياج اليومي، قــم بقياس كميات صغيرة مــن الصبغة وتصفيتهــا في قنينة محكمة الغلــق (حوالي 52-05 ملليلتــر) حتى تقلل من نســبة تعرض المحلول الخــام للتلوث. لا تضع أو تستخدم ماصة مبللة أو متسخة بمحلول مخزون الجيمسا. لا تعيد كميــة غيــر مســتخدمة أو متبقيــة مــن الصبغة إلــى قنينــة المحلول الخــام أو قنينــة محلــول الاســتخدام؛ فــأي كمية مــن الصبغة خرجت مــن القنينــة لا بــد من اســتخدامها علــى وجــه الســرعة أو التخلــص منها. مراقبة الجودة والتوثيق. قم بإجراء فحص مراقبة الجودة: لكل تشغيلة أو كمية جديدة ُتحضر من المحلول الخام، قبل استخدام المحلول الخام، كمحلول الاستخدام، أثناء عملية الصبغ، قبل إرساله إلى المختبرات للاستخدام، في العمل الميداني، بعد استلامه من المختبر المرجعي الوطني. دون النتائــج في ســجل مراقبة الجــودة، انظر الوثيقــة c3 POS-MM، بعنــوان مراقبة الجــودة الخاصة بمخــزون محلول الجيمســا والماء متعــادل الحموضة، المســتخدم في الصبــغ الروتيني لشــرائح الدم مــن أجل تشــخيص الملاريا. وثائق تتناول إجراءات التشغيل المعيارية ذات صلة . c3 POS-MM: مراقبة جودة محلول الجيمسا الخام والماء متعادل الحموضة 40-POS-MM: تحضير المحلول المستخدم الخاص بصيغة الجيمسا المراجع. ستوري جى، إجراءات التشغيل الموحدة الخاصة بعملية الفحص المجهري لتشخيص الملاريا، 2102 (لم يتم النشر). منظمة الصحة العالمية، أساسيات الفحص المجهري للملاريا، الجزء الأول، الدليل التعليمي، جنيف، 0102. مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها التشخيص المخبري للملاريا، صبغ طفيليات الملاريا، أتلانتا، جورجيا، 3102. fdp.diahcneb_gniniats_airalam/airalam/sdiAhcneb/fdp/secruoser/xdpd/vog.cdc.www//:ptth، تم الاطــلاع في 41 كانــون الأول/ديسمبر 5102. تاريخ الوثيقة. التاريخ (الشهر/السنة) التعليقاتالإصدار الشخص المسؤول (الاسم الأول، الاسم الأخير) كانون الثاني/ 1يناير 6102 قام الخبراء بمراجعتها وصياغتها في صورتها النهائية، التحرير والصياغة غليندا غونزاليس، الموظف التقني، مكتب منظمة الصحة العالمية الإقليمي لغرب المحيط الهادئ 20.6102/POS/MM/PMG/MTH/OHW © منظمة الصحة العالمية 6102. جميع الحقوق محفوظة.