L’épidémiologie moléculaire de la méningite à méningocoque au Mali : isolement d’un nouveau variant (P1.y) de la protéine de classe 1

Epidemiologie moleculaire de la meningite a meningocoque au Mali: isolement d'un nouveau variant (P1my) de la proteine de classe 1 B. Koumare,1 M. Achtman,2 F. Bougoudogo,1 M. Cisse,2 & J.F. Wang2 Notre 6tude a port6 sur 570 souches de Neisseriaceae isol6es au Mali entre 1989 et 1994. Parmi ces souches, 396 proviennent de prelevements de liquide c6phalo-rachidien (LCR) et 174 de pr6lIvements de gorge. Le s6rogroupe C repr6sente 55% de ces souches. Nous avons pu d6terminer la formule antig6nique des souches par ELISA, 6lectrophorese en SDS-PAGE, transfert sur membrane de nitrocellulose puis oimmunoblotting', a I'aide d'anticorps monoclonaux produits a l'lnstitut Max Planck. Ainsi nous avons trouv6 que pour le s6rogroupe A, le type de prot6ine de classe 1 existant est le P1.7pour les souches isol6es avant 1994 et le P1.9 pour les souches isol6es en 1994. P1.7 d6finit le clone IV- 1 et P1.9 le clone I- 1 responsable de l'6pid6mie de 1994. Toutes les souches de s6rogroupe C isol6es du LCR et la majorit6 des souches provenant de la gorge possedent un nouveau type de la prot6ine de classe 1 auquel nous avons donn6 le nom P1.y. Le P1.y est caract6ristique des souches maliennes du serogroupe C; il est rare ou absent dans les souches provenant d'autres pays comme les Etats-Unis d'Amerique, le Ghana, le Burkina Faso et l'Italie. La s6quence nucl6otidique du gene codant pour le variant P1.y et la s6quence d'aminoacides qui en r6sulte ont 6t6 d6termin6es par Maiden au National Institute for Biological Standards and Control au Royaume-Uni. Pays faisant partie de la ceinture meningitique decrite par Lapeyssonnie en 1963 (1), le Mali a connu de 1939 a 1994 sept grandes epidemies toutes dues 'a Neisseria meningitidis du serogroupe A (2). Cependant, de 1988 a 1993, le serogroupe C a supplante le serogroupe A (3) et a ete 'a l'origine de bouff6es epidemiques localisees dans le pays. A partir de 1994, le serogroupe A a de nouveau supplante le serogroupe C, causant une epidemie de f6vrier 'a avril 1994. Les souches de N. meningitidis peuvent etre caracterisees par leur formule antigenique basee sur l'identification du polysaccharide capsulaire et des proteines de membrane externe (PME) de classe 1 et de classe 2/3 (4). Les specificites antigeniques du polysaccharide capsulaire permettent de definir les serogroupes (A, B, C, X, Y, W135, 29E), les proteines de classe 2/3 definissent les serotypes, et la proteine de classe 1 les sous-types (P1.1, P1.2, etc.). Avec l'analyse des isoenzymes de la membrane interne et des sous-types de la proteine de classe 1, Olyhoek et al. (5) ont decrit des clones dans le serogroupe A. Ainsi chaque epidemie de meningite I Institut national de Recherche en Sant6 publique, Service de Bact6riologie-Virologie, BP 1771 Bamako (Mali). (Tir6s a part.) 2 Institut Max Planck de Gen6tique moleculaire, Berlin (Allemagne). Tir6 & part NO. 5713 'a N. meningitidis a pu etre caracterisee par le clone qui en a ete responsable. Par ailleurs, la proteine de classe 1 provoque l'apparition d'anticorps protecteurs chez l'animal et est consideree comme un vaccin potentiel; cet effet protecteur est specifique du sous-type (6-8). Afin de caracteriser les souches maliennes dans le contexte de l'epidemie actuelle sevissant en Afrique (9) et de contribuer aux efforts de recherche de nouveaux types de vaccins, nous avons entrepris d'etudier la structure antigenique de 570 souches de Neisseriaceae isolees au Mali entre 1989 et 1994. Materiels et methodes 570 souches de Neisseriaceae sont l'objet de ce travail. Parmi elles, 396 provenaient de prel6vements de liquide c6phalorachidien (LCR) chez des malades atteints de meningite et 174 de prelevements de gorge faits dans l'entourage immediat des malades (familles ou ecoles). Apres etude cytologique (numeration des cellules, formule leucocytaire) les prelevements de LCR ont ete ensemences sur gelose au sang cuit additionnee d'Isovitalex et incubes 'a 37 °C sous CO2 pendant 24 heures. Les colonies apparues au bout de ce temps ont ete identifiees par leurs caracteres morphologiques, biochimiques (oxydase +, caracteres sur galerie Bulletin de lOrganisation mondiale de la Sante, 1996, 74 (4): 375-379 © Organisation mondiale de la Sante 1996 375 B. Koumare et al. Rapid NH de Biotech) et antigdniques (agglutina- tion sur lame avec les serums antipolysaccharides A, B, C, X, Y, Z, W135, 29E). L'extraction des proteines de membrane externe des bacteries a ensuite ete faite apres broyage par les ultrasons et centrifugation a 7000tr/ min pendant 6 minutes, puis 'a 14000tr/min pendant 15 minutes. Le culot contenant les proteines de membrane externe a ete dissous dans un solvant special: le LUG (un melange de tris (hydroxy- methane) aminomethane, dodecylsulfate de sodium, glycerol, betamercaptoethanol et de bleu de bromothymol). La solution obtenue a ete soumise 'a une electrophorese en SDS PAGE et les gels obtenus colores au bleu de Coomassie ou utilises pour un transfert sur feuille de nitrocellulose en vue de la realisation du <<Western-blot>>. La technique ELISA et le <<Western-blot>> ont ete pratiques a l'aide d'anticorps monoclonaux de souris produits 'a partir de nos souches 'a l'Institut Max Planck et de tous les anticorps monoclonaux diriges contre les sous-types de proteine de classe 1 et figurant dans la collection de J. Poolman, W. Zollinger, J. Heckels et M. Achtman (10). La sequence nucleotidique du gene codant pour le variant P1.y et la sequence d'aminoacides qui en resulte ont ete determinees par Maiden au National Institute for Biological Standards and Control au Royaume Uni (resultats non encore publies). Resultats Etude bacteriologique des souches L'identification bacteriologique des differentes souches a donne les resultats suivants (tableau 1): on note une predominance du serogroupe C dans notre echantillon (55%). Pour la premiere fois au Mali, nous avons isole le meningocoque de serogroupe X dans le LCR et dans la gorge, et le meningocoque de serogroupe 29E dans la gorge. De nombreuses autres especes de Neisseria et de Kingella existent 'a l'etat de portage commensal dans la gorge; elles representent dans cette etude 61% des souches isolees 'a ce niveau. Elles peuvent cependant excep- tionnellement provoquer des infections (meningites, infections bronchiques). II est interessant de noter I'isolement de Neisseria gonorrhoeae dans les prelevements de gorge; ce r'sultat doit inciter 'a la prudence lors de la recherche de porteurs rhinopharynges de Neisseria meningitidis. Etude des proteines de membrane externe Elle a ete realisee uniquement sur les menin- gocoques de serogroupe A (141 souches), C (315 souches) et X (4 souches). SDS PAGE. Toutes les souches de meningocoque de serogroupe A et C possedent les proteines de classe 1 et 5. Par contre la proteine de classe 2 a ete retrouvee uniquement chez les meningocoques de serogroupe C et la proteine de classe 3 chez les souches de serogroupe A. En effet ces 2 proteines sont mutuellement exclusives; celle de classe 2 definit le serotype 2 et celle de classe 3 le serotype 4. Whole Cell ELISA et Western-blot (Fig. 1). L'iden- tification des proteines de membrane externe (PME) a l'aide des anticorps monoclonaux existants et de ceux fabriques a partir des souches maliennes a donne les r6sultats suivants: Parmi les souches de meningocoque de sero- groupe A (138 isolees du LCR et 3 de la gorge), 39 ont la formule antigenique suivante: A: 4: P1.7, ce qui signifie qu'elles sont du serotype 4 (presence de la proteine de classe 3) du sero-sous-type P1.7; les 102 autres, isolees lors de l'epidemie de 1994 ont la formule suivante: A: 4: P1.9. Les 257 souches de meningocoque C provenant du LCR sont de serotype 2a (presence de la variante Tableau 1: Identification des souches de Neisseriaceae isolees au Mali de 1989 a 1994 Neisseria meningitidis: sdrogroupe Pelevement de A C X 29E Autresa Total LCR 138 257 1 396 Gorge 3 58 3 4 106 174 Total 141 315 4 4 106 570 a Autres s6rogroupes de Neisseria meningitidis (1 1), Neisseria gonorrhoeae (10), Neisseria lactamica (63), Neisseria cinerea (4), Neisseria sicca (4), Kingella kingae (14). WHO Bulletin OMS. Vol 74 1996376 Epidemiologie moleculaire de la meningite a meningocoque au Mali Fig. 1. Resultat du "(Western-Blotb sur 10 souches de meningocoque C (lignes 1 a 4 et 7 a 12) et 2 souches de meningocoque A (lignes 5 et 6). L'anticorps monoclonal fabrique a partir de la proteine P1.y des souches C marque uniquement la bande P1 des souches C et non celle des souches A. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 N. ::¢ ...., . , .............. ::'."V lt: ' .' !.+ ,$ ......s P1 - a de la prot6ine de classe 2), ne reagissent qu'avec les anticorps monoclonaux produits a partir de nos souches, mais avec aucun des anticorps mono- clonaux diriges contre les 14 variants connus de la proteine de classe 1. Cela signifie que nos souches possedent un variant non encore decrit de la prot6ine de classe 1. A ce variant, nous avons donne le nom de Pl.y. Nos souches correspondent donc a la formule antig6nique C: 2a: P1.y. Parmi les 58 souches de meningocoque C isolees de la gorge, 47 repondent a la formule antigenique C:2a:P1.y. Les 11 autres souches se repartissent de la facon suivante:C:2a:Pl.1 (1 souche), C:15:P1.16 (3 souches), C:4:P1.7 (4 souches), C:4:P1.5 (2 souches), C:15:P1.7 (1 souche). Les 4 souches de meningocoque X ont la formule antig6nique X: 15. Recherche de P1.y chez des souches d'autres provenances En etudiant des souches de meningocoque de sero- type 2a provenant d'autres pays (offertes par W. Zollinger et C. Broome [11]) et en les comparant a celles de notre pays, nous avons obtenu les resultats suivants (tableau 2): le variant P1.y est pr6sent dans toutes les souches de s6rogroupe C isol6es au Mali; il est rare ou absent dans les souches provenant d'ailleurs. Discussion Nos r6sultats ont montr6 une nette pr6dominance du meningocoque de serogroupe C parmi les souches Tableau 2: Recherche du nouveau variant P1.y chez des souches de Neisseiria meningitidis du Mali et d'autres pays Serogroupe Sero sous-type Nombre de Pays souches C B Serotype 2a P1.2 P1.y Mali 257 257 257 257 Italie 1 1 1 1 Etats-Unis 22 12 10 22 21 4 Ghana-Bqrkina 8 8 8 8 Faso Autres 19 19 1 5 WHO Bulletin OMS. Vol 74 1996 377 B. Koumare et al. isolees au Mali de 1989 a 1994. De 1988 'a 1994, il a supplante le serogroupe A au Mali (3), oiu il a ete a l'origine de toutes les bouff6es epidemiques survenues pendant cette periode (1990, 1991 et 1993). Meyran et al. (12) ont egalement constate depuis 1991 en France une augmentation de la frequence du serogroupe C en milieu militaire. L'etude des PME nous a permis de preciser la formule antigenique de nos souches. Ainsi les 39 souches de serogroupe A recueillies de 1988 'a 1993 avaient la meme formule antig6nique soit A :4: P1.7. Le sous-type P1.7 les classe dans le clone IV.1, ce qui les distingue des souches de meningocoque 6tudiees en France par Riou et al. (13) qui sont du sous-type P1.9, caracteristique du clone 111.1. Les souches de serogroupe A isolees au Mali en 1994 sont du sous- type P1-9. Le clone VI-1 etait depuis 25 ans resident habituel de la ceinture de la meningite. II a ete responsable d'une grande epidemie dans cette zone entre 1981 et 1984 (9) et depuis lors existe 'a l'etat endemique. Les epidemies actuelles sont plutot dues au clone III.1 importe 'a La Mecque en 1987 par les pelerins venant de Chine et du Nepal oiu ce clone est apparu en 1982 (9). Par le retour des pelerins, le clone 111-1 a ete introduit au Soudan et au Tchad, causant en 1988 de grandes epidemies atteignant l'Ethiopie et le Kenya en 1988 et 1989 (9). Le meme clone a e introduit en Egypte, aux Etats-Unis et en Grande-Bretagne sans causer d'epidemies. Le Mali a ete atteint en 1994. Les 257 souches de meningocoque de sero- groupe C isolees du LCR et 47 souches sur les 58 isolees des prelevements de gorge ont la meme formule antigenique soit C:2a:Pl.y. Elles portent donc le nouveau variant de la prot6ine de classe 1 caracteristique des souches maliennes. Aucune des souches etudiees en France par Riou et al. en 1992 ne possede Pl.y (13). Les sequences nucleotidiques des genes codant pour 11 variants de la proteine de classe 1 ont e determinees par Barlow et al. (14), Mc Guiness et al. (18) et Maiden et al. (15). Celle du variant Pl.y vient d'&re determinee par Maiden et al. (resultats non encore publies). Les sequences d'aminoacides qu'ils en ont deduites ont montre les differences antigeniques entre variants. Les etudes ont egale- ment permis de proposer une structure secondaire sous forme d'une proteine transmembranaire comportant des regions conservees au nombre de 9 (CR1 -a CR9) et des regions variables au nombre de 3 (VR1, VR2 et VR3) (15-17). Les 3 regions vari- ables sont exposees 'a la surface de la cellule, representent environ 10% de la sequence du gene, et contiennent les epitopes specifiques des differents variants. Mc Guiness et al. (18) ont montre que le maximum de variation du gene se situait au niveau de VR1 et de VR2 et ont localise les epitopes de P1.7 et P1.16 respectivement sur VR1 et VR2. Maiden a localise l'epitope Pl.y sur VR2. L'etude detaillee des differents variants de la proteine de classe 1 permettra de comprendre davantage les bases moleculaires de la variabilite antigenique de cette proteine en vue de surmonter les difficultes liees a son utilisation dans le diagnostic et la prevention des infections 'a meningocoque. Conclusion Notre etude vient de confirmer la preponderance du serogroupe C parmi les souches de meningocoque isol6es au Mali de 1989 'a 1994 et de preciser la formule antigenique des souches etudiees. La mise en evidence d'un nouveau variant de la proteine de classe 1 specifique des souches maliennes de meningocoque de serogroupe C augmente ainsi le nombre de variants connus jusqu'a ce jour pour cette proteine, interessante par ses possibilites d'emploi comme vaccin potentiel. Summary Molecular epidemiology of meningitis due to Neisseria meningitidis in Mali: isolation of a new variant (P1.y) of the class 1 protein The study deals with 570 strains of Neisseriaceae isolated between 1989 and 1994 in Mali: 396 of the strains were isolated from samples of cerebrospinal fluid and 174 from the throat. Serogroup C ac- counted for 55% of all strains. Antigenic structure was determined by ELISA, SDS-PAGE and transfer to nitrocellulose membrane for immunoblotting with monoclonal antibodies produced at the Max Planck Institute for Molecular Genetics. For serogroup A, the class 1 protein types found were P1.7 for strains isolated prior to 1994 and P1.9 for strains isolated in 1994. P1.7 is specific to clone IV-1 and P1.9 to clone 111-1, which was responsible for the 1994 epidemic. All strains of serogroup C isolated from fluid CSF and most strains isolated from the throat exhibit a new type of class 1 protein which the authors have designated P1.y. P1.y is characteristic of Malian strains of serogroup C; it is rare or absent in strains from other countries (Burkina Faso, Ghana, Italy, USA). The nucleotide sequence of the gene express- ing P1.y and the corresponding amino acid se- WHO Bulletin OMS. Vol 74 1996378 Epidemiologie moleculaire de la meningite a meningocoque au Mali quence were determined at the National Institute for Biological Standards and Control, England. Bibliographie 1. Lapeyssonnie L. La meningite cerebrospinale en Afrique. Bulletin de l'Organisation mondiale de la Sant6, 1963, 28 (suppl.): 3-114. 2. Traore I. Approche epid6miologique de la m6ningite c6r6brospinale (bilan de 5 ann6es d'observation 1985-1989) au lazaret des roches de Bamako. These-de medecine, 1989, n° 15, Bamako (Mali). 3. Koumare B et al. Aspects bacteriologiques des meningites purulentes dans le district de Bamako. A propos de 1541 souches bacteriennes recueillies de 1979 a 1991. Bulletin de la Soci6te de Pathologie exotique, 1993, 86: 136-140. 4. Frasch CE, Zollinger WD, Poolman JT. Serotype antigens of Neisseria meningitidis and a proposed scheme for designation of serotypes. Reviews of in- fectious diseases, 1 985, 7: 504-51 0. 5. Olyhoek T, Crowe BA, Achtman M. Clonal popula- tion structure of Neisseria meningitidis serogroup A isolated from epidemics and pandemics between 1915 and 1983. Reviews of infectious diseases, 1987, 9: 665-692. 6. Poolman JT. Vaccine development against me- ningococci. Medecine et maladies infectieuses, 1991, 21: 209-211. 7. Poolman JT et al. Comparison of meningococcal outer membrane protein vaccines, solubilized with detergent or C polysaccharide. Antonie Van Leeuwenhoek, 1987, 53: 413-419. 8. Saukkonnen K et al. Comparative evaluation of po- tentiel components for Group B meningococcal vac- cine by passive protection in the infant rat in vitro bacterial assay. Vaccine, 1989, 7: 325-328. 9. Achtman M. Molecular epidemiology of epidemic bacterial meningitis. Reviews ofmedical microbiology, 1990, 1: 29-38. 10. Wang JF et al. Clonal and antigenic analyses of Neisseria meningitidis bacteria belonging to the ET 37 complex isolated from Mali and elsewhere. In: Achtman M et al. Neisseriae. Berlin, de Gruyter, 141- 146, 1990. 11. Achtman M et al. A comparison of the variable anti- gens expressed by clone IV-1 and subgroup IlIl of Neisseria meningitidis serogroup A. Journal of infec- tious diseases, 1992, 165: 53-68. 12. Meyran M, Desfontaine M, Laroche R. Me- ningococcies en milieu militaire: emergence du serogroupe C. Vaccination antimeningococcique A + C systematique des l'incorporation. Mede- cine et maladies infectieuses, 1992, 22, HS: 18- 19. 13. Riou JY, Guibourdenche M. Meningococcies: epidemiologie 1987-1992. Donnees actuelles. M6de- cine et maladies infectieuses, 1992, 22, HS: 10- 17. 14. Barlow A, Heckels JE, Clarke IN. The class 1 outer membrane protein of Neisseria meningitidis: gene sequence and structural and immunological similari- ties to gonococcal porins. Molecular microbiology, 1989, 3:131-139. 15. Maiden MCJ et al. Comparison of the class 1 outer membrane proteins of eight serological reference strains of Neisseria meningitidis. Molecular micro- biology, 1991, 5: 727-736. 16. Sucker J et al. The use of PCR to study class 1 outer membrane protein of Neisseria meningitidis. In: Achtman M et al. Neisseriae. Berlin, de Gruyter, 289- 294, 1990. 17. Van Der Ley P, Poolman J. The class 1 outer mem- brane protein of Neisseria meningitidis: prediction of topology and construction of a multivalent vaccine strain. In: Achtman M et al. Neisseriae. Berlin, de Gruyter, 295-300, 1990. 18. McGuiness BT et al. Deduced amino acid se- quences of class 1 protein (Por A) from three strains of Neisseria meningitidis. Joumal of experimental medicine, 1990, 171: 1871-1882. WHO Bulletin OMS. Vol 74 1996 379