Préparation de taches de sang sur du papier filter

VERSION 1 – DATE EFFECTIVE : 01/01/2016 PRÉPARATION DE TACHES DE SANG SUR DU PAPIER FILTRE DIAGNOSTIC MICROSCOPIQUE DU PALUDISME MODES OPÉRATOIRES NORMALISÉS – DMP-MON-10 1. OBJECTIF ET CHAMP D’ACTION Fournir une description détaillée de la procédure à suivre pour la préparation de taches de sang séché sur du papier filtre adapté aux analyses ADN. Cette procédure ne peut être modifiée qu’avec l’approbation du coordonnateur national pour l’assurance de la qualité du diagnostic microscopique du paludisme. Toutes les procédures exposées ici sont obligatoires pour tous les techniciens de la microscopie travaillant dans les laboratoires nationaux de référence, dans les laboratoires des hôpitaux ou dans les laboratoires médicaux de base au sein des établissements sanitaires où sont effectués des examens microscopiques pour le diagnostic du paludisme. 2. HISTORIQUE Les tests à base d’acides nucléiques par réaction en chaîne par polymérase (PCR) sont plus sensibles que les examens microscopiques pour le diagnostic du paludisme, notamment dans des cas d’infections mixtes et de faible parasitémie. Il faudra peut-être analyser certains prélèvements du laboratoire par PCR pour confirmer le(s) espèce(s) et le(s) infection(s) mixte(s). Les taches de sang prélevées sur du papier filtre peuvent également être utilisées pour le génotypage des souches parasitaires, pour distinguer les infections dues à une transmission locale des cas importés dans des milieux où le paludisme a été éliminé. 3. FOURNITURES, MATÉRIEL ET ÉQUIPEMENTS • Du papier filtre (Whatman FTA « analyse transitoire rapide », Whatman 2 ou 3 ou Whatman 903) pour permettre le génotypage et l’analyse sérologique. • Une micropipette de 20 à 200 µl et des embouts jetables. • Des sachets plastiques ziplock, un par patient. • Un dessiccant sans chlorure de cobalt (vous pouvez utiliser le dessiccant restant des pochettes de tests de diagnostic rapide ouvertes récemment, à condition qu’il n’y ait pas d’altération dans la couleur ; dans le cas contraire, achetez du dessiccant dans le commerce). • Du sang veineux frais ou du sang avec de l’anticoagulant (de l’EDTA, du citrate de sodium, du citrate dextrose ou de l’héparine). • Un réfrigérateur à 4 °C (pour les échantillons à examiner dans les 4 semaines). • Un congélateur à –20 °C (pour les échantillons à examiner dans les 3 mois). • Un congélateur à –80 °C (pour les échantillons à examiner dans plus d’un an). 2DMP–MON–10 : PRÉPARATION DE TACHES DE SANG SUR DU PAPIER FILTRE 4. PROCÉDURE SCHÉMA DESCRIPTION DE L’ACTIVITÉ 1. Étiquetez le papier filtre. Voir DMP-MON 06a: Étiquetage des étalements de sang à la recherche du paludisme 2. Si vous utilisez un papier filtre Whatman FTA, prélevez 125 µl de sang avec la pipette et déposez-le au centre du cercle. OU 3. Si vous utilisez des filtres Whatman 2, 3 ou 903, transvasez deux ou trois gouttes de 40 à 50 µl de sang à l’endroit désiré à l’aide de la pipette. 4. Les échantillons sur filtre papier peuvent être stockés immédiatement à température ambiante. 5. Laissez l’échantillon sécher pendant une heure au minimum, à température ambiante, avant de le placer dans un sac ziplock en plastique. 6. Ajoutez du dessiccant dans chaque sachet ziplock contenant des échantillons sur un filtre en papier. 7. Assurez-vous que l’endroit où les échantillons sont conservés soit complètement sec. Contrôlez régulièrement les dessiccants et remplacez-les si nécessaire. 8. Si les échantillons sont traités dans les 4 semaines, gardez-les au réfrigérateur à 4 °C. Si vous souhaitez les conserver plus longtemps, stockez-les à 20 °C ou 80 °C. 1. Étiquetez les filtres papier en indiquant le code du laboratoire, l’identifiant ou le code du patient et la date du prélèvement sanguin (voir DMP-MON 06a : Étiquetage des étalements de sang à la recherche du Plasmodium). Vous pouvez éventuellement décider d’inscrire les initiales du technicien chargé du prélèvement. Voir Figure 1. 2. Si vous utilisez des filtres Whatman FTA, prélevez 125 µl de sang (par cercle de 2,54 cm) du tube de prélèvement à l’aide de la pipette et déposez-le en un cercle concentrique sur la zone imprimée en forme de cercle du papier filtre, en formant au moins deux zones concentriques par patient. Évitez de former une flaque avec l’échantillon liquide, cela créerait une surcharge de produit chimique sur le papier filtre. Ne frottez pas ou n’étalez pas non plus le sang sur le filtre. 3. Si vous utilisez des filtres Whatman 2, 3 ou 903, prélevez 40 à 50 µl de sang du tube de prélèvement à l’aide de la pipette et déposez- le à l’endroit indiqué pour les taches. Préparez deux ou trois taches de sang par patient. Voir Figure 2 et Figure 3. 4. Les échantillons sur filtre papier peuvent être stockés immédiatement à température ambiante. 5. Si vous comptez examiner l’échantillon peu de temps après l’avoir déposé sur le filtre papier, laissez-le sécher pendant une heure au minimum, à température ambiante, avant de le placer dans un sachet ziplock en plastique. Ne chauffez par l’échantillon pour réduire le temps de séchage. Les taches de sang séchées présenteront une teinte plus foncée que les taches fraîches. 6. Ajoutez du dessiccant dans chaque sachet ziplock contenant des échantillons sur un filtre en papier. Conservez et transportez les échantillons séchés à température ambiante et avec le dessiccant. 7. Veillez à conserver les prélèvements complètement au sec (contrôlez régulièrement les dessiccants pour voir si leur couleur s’altère, ce qui pourrait indiquer une exposition à de l’humidité, et changez les si nécessaire). 8. Si les échantillons sont examinés sur une période de quatre semaines, gardez-les au réfrigérateur à une température de 4 °C. Si vous souhaitez les conserver plus longtemps, stockez-les à une température de 20 °C ou 80 °C. 3DMP–MON–10 : PRÉPARATION DE TACHES DE SANG SUR DU PAPIER FILTRE Figure 1. Taches de sang séché sur des papiers filtre Whatman FTA NRL-001 9/01/2016 2,54 cm Lot No.FT6263507Whatman® Figure 2. Taches de sang séchées sur du papier filtre Whatman 2 ou 3, coupé en un morceau de 2,54 x 6,35 cm et agrafé ou attaché à un morceau de papier rigide de 2,54 x 6,35 cm Papier filtre comportant deux ou trois taches de sang (intérieur du papier) Papier rigide (vu de devant, fait office d'enveloppe et permet d'étiqueter le papier filtre comportant l'échantillon de sang) Rabbatez les bords Pl ie z i ci Pl ie z i ciNRL-001 19/01/2016 4DMP–MON–10 : PRÉPARATION DE TACHES DE SANG SUR DU PAPIER FILTRE Figure 3. Taches de sang séchées sur du papier filtre Whatman 903 5. REMARQUES • Portez des gants pour ne pas contaminer le filtre papier. • Les précautions universelles doivent être observées – y compris pour ce qui est de l’utilisation d’équipements de protection individuelle adéquats comme les blouses de laboratoire. • Conservez les échantillons au réfrigérateur à une température de 4 °C lorsque l’examen (par exemple le génotypage et la sérologie) n’a pas lieu immédiatement après le prélèvement de l’échantillon, mais dans un délai de quatre semaines. • Conservez les échantillons au congélateur à une température de –20 °C lorsqu’ils sont examinés dans un délai de trois mois. • Conservez les échantillons au congélateur à une température de –80 °C lorsqu’ils sont examinés dans un délai plus long, par exemple de plus d’une année. 6. RÉFÉRENCES WHO. National malaria slide bank standard operating procedures. Geneva; 2015 (en cours). 7. HISTORIQUE DU DOCUMENT Date (mois/année) Version Commentaires Personne responsable (Nom, prénom) Janvier 2016 1 Examiné et finalisé par des experts, édité et mis en page Gonzales, Glenda Fonctionnaire technique, WPRO WHO/HTM/GMP/MM/SOP/2016.10 © Organisation mondiale de la Santé 2016. Tous droits réservés.