Epreuves sérologiques dans le paludisme

Memoranda Epreuves serologiques dans le paludisme * Le principal objet de cet article est l'e'valuation critique de diverses epreuves se'ro- logiques surtout du point de vue de leur intgrift pour l'e'tude epidemiologique du paludisme. Maintes epreuves ont ete' utilise'es dans le passe, mais le present memorandum ne traitera que des me'thodes modernes largement utilise'es, c'est-a-dire l'immunofluorescence indirecte (IF), I'hemagglutination passive (IHA) et la diffusion en milieu gelifie. Les trois immunoglobulines qui interviennent le plus souvent dans ces epreuves sont les IgG, les IgM, et, a un moindre degre', les IgA. BESOIN DtPREUVES SIROLOGIQUES DANS LE PALUDISME A l'heure actuelle, il est souvent difficile de deter- miner exactement la prevalence du paludisme sans connaitre en detail les indices serologiques. I1 est donc n6cessaire d'etablir une meilleure classification de l'endemicite, fond6e sur des indices qui facilite- raient la detection des changements de cette end6mi- cite dans le temps et la d6termination du rang de priorite a accorder au paludisme dans la planifica- tion sanitaire. La ou cette parasitose est endemique ou bien I'a ete, la serologie peut etre particulierement utile aux fins suivantes: 1) Etablissement d'indices relatifs a l'end6micit6 du paludisme, notamment la pr6valence selon l'es- p6ce, et en particulier les indices par age. 2) Evaluation des modifications de la transmis- sion, generalement pendant ou apr6s l'eradication du paludisme ou des op6rations de lutte antipalu- dique. 3) Etude epid6miologique specifique du palu- disme, par exemple d6limitation des secteurs impa- ludes, determination de I'altitude limite du palu- disme, de meme qu'identification et surveillance des foyers de la maladie. 4) Identification des regions ou des individus exi- geant des mesures antipaludiques, en particulier pendant les derni6res phases des programmes de lutte contre le paludisme. * Ce m6morandum a Wt6 pr6par6 par les signataires dont les noms figurent A la page 305. Il est possible d'en obtenir des tires k part sur demande adress6e A: Recherche et Documentation technique, Division du Paludisme et autres Maladies parasitaires, Organisation mondiale de la Sante, 1211 Geneve 27, Suisse. La version anglaise de ce document a ete publi6e dans Bull. Org. mond. Santg, 1974, 50, 527-5#5. Pour que leur utilite soit maximale, les donnees s6rologiques et parasitologiques devront etre recueil- lies et evaluees en meme temps. La ofi le paludisme n'est pas endemique, on peut utiliser la serologie aux fins suivantes: a) Detection des cas et parfois identification de 1'espece de Plasmodium responsable de l'infection. b) Choix des donneurs de sang. c) Exclusion du diagnostic de paludisme chez les malades pr6sentant des symptomes tels que: fievre d'origine inconnue, hepatosplenomegalie, anemie ou un syndrome nephrotique. COLLECTE DES tCHANTILLONS DE SERUM ET DE PLASMA Pour les 6preuves etudi6es ici, on peut utiliser aussi bien le serum que le plasma. Dans les nom- breux cas ofi la ponction veineuse est deconseillee, on peut pratiquer une piqfure au bout du doigt et recueillir le sang dans un tube capillaire avec de l'h6parine. On admet en general que, dans la mesure du possible, il est preferable d'utiliser la methode des tubes capillaires pour la collecte et le transport des echantillons, mais dans certaines conditions, la seule technique applicable est celle du papier filtre. Tubes capillaires Nettoyer le doigt avec un tampon imbibe d'alcool et laisser s6cher pour eviter 1'hemolyse de l'echantil- lon. Piquer le bout du doigt a l'aide d'un vaccino- style 'a usage unique et essuyer la premiere goutte de sang; puis remplir un ou plusieurs tubes capillaires heparines et etiquetes (d'au moins 1,1 mm de dia- metre interne et 75 mm de longueur) contenant de pr6f6rence du thiomersal sec. Sceller ensuite les tubes 3269 sY 299 - MEMORANDA capillaires a une extremite, soit avec de la plasticine, soit par la chaleur. Centrifuger ces tubes dans les heures qui suivent a l'aide d'une centrifugeuse elec- trique ou par un autre moyen efficace. Sectionner ensuite les tubes capillaires au niveau de l'interface plasma/globules. Le segment contenant le plasma sera scelle 'a nouveau aux deux extremites avec de la plasticine, et conserve. Papier filtre Dans certaines conditions particulieres sur le ter- rain, les echantillons de sang recueillis dans des tubes capillaires peuvent etre absorbes sur du papier filtre, a partir duquel on extraira le serum avant l'examen serologique. II est necessaire d'absorber sur le papier filtre des quantites de sang mesur6es avec precision (par exemple grace aux tubes capillaires). Les papiers filtres ainsi impregnes doivent etre tenus a l'abri des agents fixateurs et seches le plus tot possible, a des temperatures ne depassant pas 56°C. On sait que les echantillons de sang desseches sur papiers filtres supportent, sans perte de seroreactivite, les tempera- tures habituelles dans les regions subtropicales pen- dant au moins une quinzaine de jours, mais il est conseille de placer les specimens le plus tot possible a -20°C (l'experience a montr6 qu'ils se conservent a cette temperature pendant au moins un an). Pour les 6preuves d'immunofluorescence, on uti- lise l'eluat. Lorsqu'il s'agit d'6chantillons de sang de 70 V.], comme ceux qu'on recueille avec les tubes capillaires 'a hematocrite habituels, placer chaque papier filtre dans 0,7 ml de solution tampon 'a pH 7,2, et l'y laisser jusqu'au lendemain 'a une temperature de 4°C. Cela correspond a une dilution ai 1/20 pour un h6matocrite evalue at 50%. Meme lorsque les valeurs de l'hematocrite sont tres faibles, la surestimation du titre n'est pas importante. D'apr6s des etudes recentes, l'absorption du sang sur papier filtre pourrait detruire la reactivite des anticorps de la fraction IgM. Dans le cas oLu ces anticorps peuvent jouer un role, les etudes sero- epidemiologiques doivent donc etre effectuees sur des echantillons de plasma frais. La presence d'h- moglobine dans l'eluat de plasma obtenu 'a partir des echantillons sur papier ifiltre reduit la fluorescence, d'oii la necessite d'utiliser au moins deux dilutions. CONSERVATION DU SERUM Aucune etude specifique de la stabilite des anti- corps antipaludiques dans le serum humain pendant la conservation ne semble avoir ete rapport6e, mais de l'experience generale il ressort que: 1) II serait preferable d'effectuer les epreuves sur du serum frais. 2) I1 faut 6viter la croissance bact6rienne. On peut obtenir ce resultat en manipulant le s6rum de ma- niere a emp&her une contamination importante et en ajoutant de l'azoture de sodium ou du thiomersal a l'echantillon de sang ou de s6rum. 3) Le serum doit etre gard6 au froid, et pour une conservation de longue duree, il doit etre congel6 (.a -70°C plutot qu'i -20°C). 4) La decong6lation et la recong6lation peuvent etre nuisibles. II faut donc effectuer toutes les epreuves simultanement sur un lot de s6rum decon- gele ou bien congeler s6par6ment des fractions qui seront decongel6es au fur et a mesure des besoins pour les epreuves effectuees 'a des moments diffe- rents. 5) Les anticorps IgM ou anticorps <precoces ) peuvent perdre de leur activit6 lors de la conservation. 6) La lyophilisation, effectuee dans des conditions soigneusement control6es comme pour la prepara- tion des etalons biologiques, semble etre une bonne methode pour preserver les propri6t6s du serum; cependant elle ne peut connaitre une application generalisee. 7) L'efficacite d'une methode de conservation doit etre evalu6e par comparaison des propriet6s du serum avant et apres conservation, ou bien apres conservation dans des conditions differentes; des epreuves normalis6es seront utilisees 'a cette fin. IMMUNOFLUORESCENCE INDIRECTE Antige?ne L'antigene est constitue d'etalements epais ou minces, effectues sur des lames de verre, avec du sang provenant d'hommes ou d'animaux impaludes. Sur le plan pratique, les frottis epais sont prfe- rables. Les preparations d'antigene doivent si pos- sible contenir des schizontes 'a maturite dont la presence donne 'a l'epreuve une sensibilite maximale. Pour la d6tection des anticorps, il faut utiliser les antigenes homologues, sauf pour le cas des anticorps contre Plasmodium malariae qu'on peut deceler soit avec l'esp6ce homologue, soit avec P. brasilianum. Un antigene correspondant it plusieurs especes assure une sensibilite maximale, mais cet antigEne est tr6s difficile 'a preparer. On peut obtenir un antigene P. falciparum conve- 300 iPREUVES SIROLOGIQUES DANS LE PALUDISME 301 nable par culture in vitro de sang humain fortement infect&.a I1 est plus difficile d'obtenir des antigenes conve- nables de P. vivax et P. malariae a partir de mat6riel humain, car, dans ces infections, la densite parasi- taire est souvent trop faible. On peut faire des preparations d'antigenes a partir de souches deja adapt6es de P. falciparum, P. vivax ou P. malariae chez des Aotus trivirgatus (singes nyctipitheques) splenectomis6s, en particulier chez la sous-espece A. t. griseimembra de Colombie. Les A. t. trivirgatus de Colombie et du Perou ne per- mettent le developpement que d'un nombre plus restreint de souches. Faute d'antigenes homologues, P. fieldi provenant de singes rhesus splenectomises et infectes constitue probablement le meileur antigene de remplacement polyvalent. On peut utiliser P. cynomolgi (toujours chez le singe rhesus) comme meilleur antigene apres la souche homologue, dans le cas de P. vivax. On considere que les autres especes de Plasmodium ne se pretent pas a cet usage. On infecte les singes avec l'espece voulue de plasmodium puis, lorsque la parasitemie atteint une densite telle que 1 a 5% des erythrocytes sont infect6s de schizontes, on preleve du sang chez l'animal sur un anticoagulant. Ce sang est centrifuge a 1500 g pendant 10 minutes, le surnageant est 6limine et les globules rouges remis en suspension dans du solute tamponne au phosphate. On repete trois fois la centrifugation et le lavage. Les erythro- cytes sont alors mis en suspension a 2-4% dans du solute tamponne au phosphate. I1 est preferable de proceder a la preparation des lames d'antigene le jour meme ou le sang a et6 recueilli. En effet, la conservation du sang total avant son utilisation comme antigEne entraine une perte d'activite. Avant de preparer des lots importants d'antigene, il est conseille d'effectuer une epreuve IF sur quelques lames, avec un serum temoin negatif et un autre positif. Si cette epreuve preliminaire est satis- faisante, on peut preparer, en grande quantite, des frottis epais avec 1 a 16 gouttes par lame. Les lames d'antigene sont alors s6ch6es a l'air, puis plac6es dans un dessiccateur (chlorure de calcium, silicagel, ou autre d6shydratant) pendant au moins 3 heures, avant d'etre envelopp&es une a une dans un papier absorbant. On enferme ensuite hermetiquement de petits paquets de lames dans des sacs ou une feuille a Bull. Org. mond. Santi, 47: 357-373 (1972). de matiere plastique et on les conserve a basse temperature. I1 a ete d6montr6 que les lames d'antigene peuvent se conserver d'une maniere satisfaisante pendant plusieurs annees A -70°C et, d'apres les donnees actuelles, la conservation en milieu sec a -20°C serait satisfaisante pendant au moins 6 mois. Enfin, a condition qu'elles restent a l'abri de toute humidite, les lames se conservent a la temperature ambiante pendant plusieurs semaines, ce qui facilite le trans- port. Conjugue La sensibilite et la specificite de l'epreuve IF dependent dans une large mesure du conjugue et de la dilution a laquelle on l'utilise. On peut employer des immuns6rums conjugues diriges contre l'en- semble des immunoglobulines ou contre des immu- noglobulines particulieres. On ne connait encore aucun parametre biologique ou chimique constituant un indicateur satisfaisant de l'activite de ces anti- serums. I1 faut evaluer les conjugues dans des 6preuves IF pour le paludisme, par comparaison avec un des reactifs de r6f6rence.a Le facteur rhumatoide (autoanticorps de la classe des IgM reagissant avec l'IgG) peut se combiner avec l'anticorps IgG fix6 a l'antigene parasitaire et donner ainsi une reaction faussement positive dans 1'epreuve IF relative aux anticorps IgM. Aucune m6thode simple ne permet de separer cette activit6 de celle de l'anticorps IgM specifique du paludisme. On doit donc consid6rer comme suspect tout serum presentant une reaction positive en ce qui concerne le facteur rhumatoide. Methode d'execution de l'e'preuve On trouvera a l'annexe 1 la description d'une methode permettant d'executer l'epreuve IF et d'en lire les resultats. Normalisation Pour que les epreuves IF du paludisme, effec- tuees dans divers endroits et A des moments diffe- rents, puissent etre comparables, il est indispensable de proceder a des &changes des antiserums et des antig6nes de reference et de definir les differents conjugu6s utilises par rapport a des conjugues de reference 6tablis. a On peut obtenir des renseignements concernant les conjugues fluoresc6ine-anticorps anti-IgG humaine, en s'adressant a: Secretariat of the Standardization Committee, International Union of Immunological Societies, c/o Well- come Research Laboratories, Langley Court, Beckenham, Kent, Angleterre. MEMORANDA Avantages de 1'epreuve 1) La preparation de lots comparables d'antigene est relativement simple. 2) On utilise comme antigene le globule infecte entier, identifiable par sa morphologie. 3) Maintes etudes ont montre que l'epreuve peut traduire le contact d'un individu ou d'une collecti- vit6 avec le paludisme. 4) Les resultats de l'epreuve peuvent permettre de reveler des differences dans l'end6micit6 palustre entre des localites et de detecter la transmission. 5) La sensibilite de l'epreuve est suffisante. 6) Pour des titres eleves, l'epreuve est 'a peu pres toujours specifique du paludisme, et peut parfois meme fournir des indications sur la pr6valence par espece. 7) Tout laboratoire equipe pour effectuer des epreuves IF pour d'autres maladies peut pratiquer cette epreuve pour le paludisme, s'il dispose de 1'antigene. Inconvenients a) A l'heure actuelle, la lecture des resultats est subjective. b) Les porteurs de plasmodiums peuvent parfois donner des reactions negatives. Ce phenomene a ete observe en particulier chez les enfants. c) La necessite d'un materiel et d'un personnel specialises fait que seuls les grands laboratoires peuvent pratiquer cette epreuve. d) Quelques centres seulement peuvent fournir les antiggenes dont la conservation exige un important volume de refrigeration. e) Le transport de l'antigene peut poser certains problemes. EPREUVE D HEMAGGLUTINATION INDIRECTE OU PASSIVE Antigene L'antigene est un extrait soluble d'6rythrocytes massivement infectes de parasites au stade de schizontes. Pour P. falciparum, on a obtenu un antigene satisfaisant a partir du sang de singes nyctipitheques infectes experimentalement, et 'a par- tir de placentas humains fortement infectes. Les pr6parations antigeniques provenant de singes rhe- sus infectes par divers Plasmodium simiens ont en general donne de moins bons resultats. Methode d'execution de l'epreuve On trouvera 'a 'annexe 2 la description d'une methode permettant d'executer l'epreuve IHA. Avantages de l'e'preuve 1) Cette epreuve est facile a realiser et n'exige ni materiel special, ni personnel hautement qualifie. 2) La sensibilite et la reproductibilit6 sont satisfai- santes; on observe de rares r6actions faussement positives. 3) I1 est aise d'effectuer cette epreuve sur un nombre 6leve de serums. 4) Les reactifs necessaires peuvent etre prepares dans un laboratoire central et utilis6s dans maintes regions, ce qui assure une bonne comparabilite. 5) Le test convient parfaitement a l'utilisation sur le terrain et permet de prendre des mesures en fonction des resultats le jour meme oCu les serums sont recueillis. 6) Tous les r6actifs peuvent etre conserves dans un espace reduit et facilement transportes. Inconve'nients a) Les porteurs de parasites du paludisme, en particulier les enfants ou les individus eprouves au cours de l'atteinte initiale, peuvent presenter des reactions negatives a cette epreuve. b) De faibles variations dans la m6thode d'execu- tion de l'6preuve peuvent modifier completement les resultats. L'extrait utilise contient un grand nombre d'antigenes diff6rents de nature physico-chimique inconnue, et des variations ou des modifications de la technique peuvent entrainer l'absorption preferen- tielle de certains antigenes sur le globule rouge. c) II existe actuellement des differences impor- tantes, d'un laboratoire a l'autre, dans la prepara- tion des r6actifs, ainsi que dans l'execution et la lecture des epreuves. d) Seuls quelques centres peuvent fournir les anti- genes. tPREUVE DE DIFFUSION EN MILIEU GELIFII Cette epreuve met en jeu la diffusion en gel de g6lose d'antigenes solubles du paludisme en pr6sence de serums contenant des anticorps. Lorsqu'un anti- gene rencontre l'anticorps precipitant homologue, il se produit une immunoprecipitation formant un arc. Jusqu'a present, les etudes sur l'utilisation de ces 302 IPREUVES SEROLOGIQUES DANS LE PALUDISME techniques dans le paludisme ont porte sur les infections 'a P. falciparum et des antigenes prepares uniquement 'a partir des formes erythrocytaires asexuees de ce parasite. L'annexe 3 fournit une m6thode d'ex6cution et d'interpretation de I'epreuve, ainsi que des details sur la conservation de 1'antigene. Anticorps deceles par la diffusion en milieu gelifie dans des etudes de populations effectuees dans des regions d'endemie elevee La prevalence des pr6cipitines seriques d6celees par des extraits antig6niques non chauffes est tres proche de celle des anticorps d6cel6s par la technique IF. Elle est 6lev6e chez le nouveau-n6, diminue ensuite dans les premieres semaines de la vie, puis augmente lentement, pour atteindre des taux eleves, et approcher de 100% vers la 5e ann&e. Ces taux se maintiennent ensuite pendant toute la vie. Le nombre d'arcs tend aussi 'a augmenter avec l'age. Les antigenes palustres presents dans les extraits aqueux ont ete class6s grosso modo en fonction de leur sensibilit6 'a la chaleur. Les antigenes L (labiles) sont d6truits par chauffage 'a 56°C pendant 30 mi- nutes; ils ont ete subdivis6s en sous-groupes (par exemple La', La' et Lb). Les antigenes R (resistants) restent actifs apr&s un chauffage a 56°C, mais sont d6truits en 5 minutes ai 100°C; ce groupe a aussi ete subdivise (par exemple R' et R2). Les antigenes S (solubles) resistent i l'6bullition pendant 5 minutes; ils ont et6 6galement subdivises en sous-groupes (SI, S2, etc.). On a d6nombr6 jusqu'a present environ 30 antigenes diff6rents lies au paludisme 'a falci- parum. L'utilisation d'extraits antig6niques chauffes a montr6 que les anticorps correspondant 'a des groupes differents d'antigenes n'ont pas les memes types de distribution. Par exemple, la pr6valence des anticorps La tend it suivre de tres pres celle des precipitines d6cel6es par les extraits antigeniques complets non chauff6s; par contre, la distribution des anticorps contre les antigenes R et S s'est revel6e de types plus limit6s. Normalisation de l'epreuve Cette normalisation souleve maints problemes, car il peut y avoir des difltrences consid6rables dans le nombre et le type des anticorps de chaque serum et des antig6nes de chaque extrait provenant de difft- rents lots de sang infect6. II semble donc que la normalisation exige tout d'abord l'isolement et la purification des divers antig6nes, puis leur conserva- tion dans des conditions satisfaisantes. En attendant, il faut tenter de preparer des echantillons de sang infecte contenant approximativement le meme nombre de parasites 'a un stade de maturite iden- tique. Avantages de l'epreuve 1) Elle n'exige qu'un materiel simple. 2) Les gels colores et seches permettent une con- servation durable des resultats. 3) Il est aise de rechercher quotidiennement la pr6sence ou l'absence de precipitines dans un nombre 6leve d'immuns6rums. 4) Elle permet d'6tablir l'identite des anticorps presents dans les serums tout comme celle des differents antigenes dans les extraits de sang infecte. 5) Cette epreuve peut servir La l'analyse des anti- genes et des anticorps dans des systemes complexes. Ainsi, comme les antigenes presents dans un extrait aqueux de sang infecte peuvent, les uns etre detruits par le chauffage La certaines temperatures, et les autres y resister, l'utilisation d'extraits chauff6s et non chauffes peut permettre de classer les anticorps pr6sents dans le s6rum. 6) On a egalement utilise cette epreuve pour dece- ler la pr6sence d'antigenes paludeens solubles dans du s6rum de sujet impalud6. Inconve'nients a) Les placentas convenant La la preparation de l'antigene sont rares. b) La d6termination du titre des anticorps est une operation de longue duree et augrnente consid6rable- ment la consommation d'antigene. c) L'immunopr6cipitation est une methode relati- vement peu sensible pour la detection des anticorps; elle peut donc donner de mauvais resultats dans les r6gions de faible end6micit6 palustre oiu les concer.- trations seriques d'anticorps specifiques sont basses. d) On a constat6 que l'epreuve donnait des resul- tats n6gatifs en presence d'une parasitemie av6r6e chez les jeunes enfants. NOUVELLES APREUVES ET AM#LIORATIONS DES TECHNIQUES BIEN CONNUES Evaluation quantitative et automatisation des methodes d'immunofluorescence D'apres des etudes preliminaires, l'utilisation d'un systeme optique La fibres pour l'evaluation quantita- tive des epreuves d'immunofluorescence concernant 303 MEMORANDA le paludisme permettrait d'eliminer certains des inconv6nients inherents 'a la lecture subjective des resultats. Ce systeme permet de compenser bon nombre de variables liees aux facteurs techniques, mais pour l'instant, il ne se pr8te pas au depistage de routine. On procede actuellement 'a la mise au point d'autres dispositifs fluorometriques, mais ils n'ont pas encore ete utilises dans des etudes sur le palu- disme. On peut employer des lasers 'a impulsions pour exciter la fluorescence, ce qui reduit la vitesse de degradation des preparations fluorescentes. On elabore aussi des methodes de mesure continue de l'immunofluorescence en vue d'une application 'a des systemes en mouvement. Techniques des anticorps marques par des enzymes I1 existe dans le commerce des conjugues anti- corps-enzyme (peroxydase ou phosphatase) qui peuvent 8tre utilises a la place des conjugues de fluorochromes. Le siege de la reaction des conjugues est ainsi rendu visible au microscope classique. Appliquees au paludisme, ces techniques ne se sont montrees utiles jusqu'ici que pour l'etude immuno- chimique des tissus. I1 semble cependant qu'on puisse esperer l'elaboration d'une 6preuve serolo- gique applicable en pratique et utilisant le meme genre de conjugues avec des antigenes solubles dans un titrage faisant intervenir un immunoadsorbant lie i l'enzyme. Les r6sultats de cette epreuve se liraient au colorimetre. Techniques de dosage radio-immunologique Ces techniques sont ia l'etude. Precipitation en milieu gelifie D'apres des etudes preliminaires, il semble que l'6lectrophorese ia contre-courant puisse etre une technique serologique utile dans le paludisme. Elle parait manquer de sensibilite, mais sa rapidite et le fait qu'elle serait sp6cifique d'espece sont des 616- ments prometteurs. Des techniques d'immuno-6lec- trophorese ia champs crois6s ont ete utilis6es avec succes pour analyser des syst6mes a antig6nes et anticorps multiples. L'emploi de m6thodes de diffusion diff6rentielle de la lumiere, et de syst6mes optiques ia fibres peut etre utile en mati6re d'6valuation qualitative et quantita- tive des 6preuves de pr6cipitation en milieu g6lifie. CONCLUSIONS 1) La constitution de serums de r6f6rence pour le paludisme est un facteur important et il convient que ces s6rums soient distribues. Le British National Institute for Biological Standards and Controls, qui les conserve ia l'heure actuelle, est dispose ia faciliter la mise en application de cette proposition. 2) En ce qui concerne l'6preuve IF pour le paludisme, il est recommand6 a) d'adopter 1: 20 comme dilution initiale de serum; b) d'envisager la possibilit6 de n'utiliser, pour le d6pistage ia grande echelle, que deux dilutions de serum, ia savoir 1: 20 et 1: 80. 3) II faut proc6der ia la pr6paration d'un lot de r6f6rence de r6actifs IHA et it son 6valuation dans des laboratoires diff6rents. 4) Il est urgent d'effectuer des 6tudes compara- tives sur les diverses 6preuves s6rologiques dans des regions ou l'endemie palustre est plus ou moins 6levee. 5) 11 est n6cessaire d'6tudier les effets des m6- thodes de collecte, de transport, de conservation et de traitement des echantillons de s6rum sur la s6rolo- gie du paludisme, et en particulier sur l'activit6 des IgM. 6) Il serait interessant de poursuivre un nombre restreint d'6tudes critiques sur la relation entre les taux s6riques d'anticorps antipaludiques d6cel6s par les diff6rentes techniques et la concentration des autres composantes du s6rum. 7) I1 convient d'6tudier la possibilit6 de constituer des pr6parations de r6f6rence convenables pour les antig6nes. 8) I1 faudrait faire des recherches en vue d'isoler, de purifier et d'identifier les antig6nes. 9) I1 est n6cessaire de mettre au point des tech- niques permettant de produire des antigenes a partir de sangs pr6sentant une faible densit6 de parasites. 10) I1 faut tenter d'6laborer des m6thodes de conservation et de transport des antigenes palustres a des temp6ratures autres que -70°C. 11) L'approvisionnement en Aotus trivirgatus, et en particulier A. t. griseimembra, 6tant limit6, il est souhaitable que les laboratoires s'entendent en vue de l'utilisation de ces animaux. I1 faut continuer a encourager la recherche et l'6tude d'autres primates susceptibles de servir d'hotes aux parasites du palu- disme humain. II convient d'examiner si l'elevage de ces animaux en captivit6 est r6alisable. 12) Outre ceux de P. falciparum, il est n6cessaire d'etudier les antig6nes des parasites du paludisme des primates, en particulier par les techniques de 304 EPREUVES SEROLOGIQUES DANS LE PALUDISME precipitation en milieu gelifie, afin de determiner les aspects lies a la specificite d'espece. 13) Il faut examiner d'autres techniques, notam- ment les methodes serologiques de diagnostic des parasitemies infracliniques. * P. Ambroise-Thomas, Laboratoire de Parasitologie et de Pathologie exotique, Faculte de Medecine et de Phar- macie, Centre Hospitalier Universitaire, 38700 - La Tronche, France P. Bertagna, Recherche et Documentation technique, Division du Paludisme et autres Maladies parasitaires, Organisation mondiale de la Sante, Geneve, Suisse W. E. Collins, Unit on Primate Malaria, Laboratory of Parasitic Diseases, National Institutes of Health, Cham- blee, Ga., Etats-Unis d'Amerique T. Godal, Immunologie, Division des Maladies non transmissibles, Organisation mondiale de la Sante, Geneve, Suisse G. Gramiccia, Evaluation et Formation professionnelle, Division du Paludisme et autres Maladies parasitaires, Organisation mondiale de la Sante, Geneve, Suisse J. Haworth, Recherche et Documentation technique, Division du Paludisme et autres Maladies parasitaires, Organisation mondiale de la Sante, Geneve, Suisse N. Kent, Methodologie epidemiologique et Pathologie clinique, Division du Paludisme et autres Maladies parasitaires, Organisation mondiale de la Sante, Geneve, Suisse I. A. McGregor, Head, Laboratory for Tropical Com- munity Studies, National Institute for Medical Re- search, Mill Hill, Londres, Angleterre J. H. E. Th. Meuwissen, Centre Regional OMS de Rfe- rence pour la Serologie du Paludisme, Laboratoire de Parasitologie m6dicale, Universite de Nimegue, Pays- Bas D. S. Rowe, Centre OMS de Recherche et de Formation en Immunologie, Lausanne, Suisse A. Voller, Laboratoire collaborateur de l'OMS pour la mise au point des techniques s6rologiques en Paludo- logie, Nuffield Institute of Comparative Medicine, Zoological Society of London and London School of Hygiene and Tropical Medicine, Londres, Angleterre W. Wemsdorfer, Recherche et Documentation tech- nique, Division du Paludisme et autres Maladies parasi- taires, Organisation mondiale de la Sante, Geneve, Suisse A. I. 0. Williams, Department of Chemical Pathology, University of Ibadan, Nigeria REMERCIEMENTS Les signataires tiennent A remercier le Dr A. Voller, qui a reuni la documentation et revise le manuscrit termine, ainsi que le Dr T. Illeni, Departement de Biotechnologie bacteriologique, Institut Karolinska, Stockholm, Suede, qui a fourni des renseignements sur certaines des epreuves nouvelles. Annexe 1 ItPREUVE D'IMMUNOFLUORESCENCE INDIRECTE Methode d'execution de l'epreuve Retirer les paquets de lames d'antigene du congelateur et les laisser se r6chauffer jusqu'a la temperature du laboratoire dans un dessiccateur ou dans leur emballage de plastique avant de les retirer du papier qui les enve- loppe. On evite ainsi la d6t6rioration de l'antigene par h6molyse. Faire des dilutions en serie dans du solute tamponne au phosphate (pH 7,2) avec les echantillons de plasma ou de serum A 6prouver, la dilution de depart etant en general de 1: 20. Ajouter alors des quantit6s connues de dilu- tions de s6rum A chaque goutte d'antigene. Soumettre alors les lames aux operations suivantes a des tempe- ratures comprises entre 20°C et 37°C: 1) Incuber avec les dilutions de serum dans une chambre humide pendant 30 minutes. 2) Laver avec du solute tamponne au phosphate, renouvele a trois reprises, en agitant, pendant 5 minutes a chaque fois. 3) Eliminer l'exces de solute et secher les lames sauf les gouttes d'antigene. 4) Appliquer le conjugu6 dilue d'antiglobuline mar- quee A la fluoresceine et incuber en chambre humide pendant 30 minutes. 5) Laver comme en 2). 6) Monter les lames avec les lamelles dans une solu- tion A 10% de glycerol dans du solute tamponne au 305 MEMORANDA phosphate (ou avec un liquide de montage du commerce, en particulier s'il faut obtenir des preparations perma- nentes). 7) Examiner au microscope A fluorescence. Systemes optiques Divers systemes optiques se sont averes satisfaisants et sont utilis6s, mais il est encore difficile d'evaluer les avantages relatifs de chacun d'eux. L'introduction de reactifs de reference devrait permettre de resoudre cette question. Lecture de l'e'preuve Le point final du titrage IF est la derniere dilution de serum qui donne aux schizontes une fluorescence plus intense que celle qu'on observe en presence de s6rum temoin negatif. II est necessaire de v6rifier quotidiennement la sensi- bilite et la sp6cificite de l'6preuve grAce A des serums temoins positifs et negatifs. ,exe 2 tPREUVE D'H1tMAGGLUTINATION INDIRECTE Antigene On opere sur du sang d6fibrine ou du sang recueilli sur un anticoagulant, obtenu A partir de singes ou de placentas humains infectes. Centrifuger, puis 6liminer le surnageant et conserver les 6rythrocytes; laver ensuite ces derniers dans du solut6 tamponn6 au phosphate (pH 7,2) et les remettre en suspension au volume initial du sang. Pour eliminer les leucocytes, ajouter A la suspen- sion globulaire un volume egal de dextrane de poids moleculaire eleve A 3% dans du solute tamponne au phosphate, et laisser sedimenter les erythrocytes pendant 1 heure. Eliminer le surnageant qui contient les leuco- cytes. Remettre les erythrocytes agreges en suspension dans du solute tamponn6 au phosphate, au volume initial. Repeter le traitement au dextrane, puis remettre le culot d'erythrocytes en suspension dans du solute tam- ponn6 au phosphate et centrifuger A I 100 g pendant 5 minutes A 4°C. Remettre en suspension et centrifuger A deux reprises encore. Conserver les erythrocytes agreges en fractions de 0,1 ml dans des flacons A bouchon de caoutchouc, a la temp6rature de -70°C. Pr6parer les antigenes temoins de la meme faqon A partir de globules rouges non infectes. S'il s'agit d'ery- throcytes simiens, ils seront pr6lev6s de pref6rence chez le meme animal avant infection. Le jour de l'epreuve, retirer une ampoule du refrige- rateur et ajouter 0,9 ml de solute tamponne au phosphate (pH 5,5) aux globules contenus dans cette ampoule. Des- int6grer les erythrocytes en suspension par les ultra-sons ou, A d6faut, par congelation et decongelation. Centri- fuger alors la suspension A 8 500 g pendant 15 minutes a 4°C, et utiliser le sumageant non dilue' comme antigene. Preparation des e'rythrocytes sensibilises Fixation des Jrythrocytes. Le sang de mouton est recueilli dans une solution d'Alsever et conserv6 A 4°C pendant 8 jours au maximum. (Au cours des operations suivantes, maintenir la sterilit6 de toutes les solutions, qu'on gardera a une temperature de 4°C.) Sedimenter les globules rouges par centrifugation et les laver 3 fois dans un solut6 tamponn6 au phosphate, sterile. Prendre une solution commerciale stabilis6e de glutarald6hyde A 25% conserv6e au refrigerateur A 4°C, et la diluer A 1% avec un tampon contenant 1 volume de solut6 tamponn6 au phosphate 0,15 M (pH 8,2) + 9 volumes de chlorure de sodium 0,15 M + 5 volumes d'eau dis- till6e. Melanger les erythrocytes de mouton avec le glu- tarald6hyde dilu6 jusqu'A obtention d'une suspension a 1 A 2 %, qu'on incubera ensuite A 4°C pendant 30 minutes en agitant par intermittence. S6dimenter les 6rythrocytes par centrifugation A 400 g pendant 5 minutes A la temp6- rature ambiante; les remettre en suspension A 20%, puis les laver 5 fois avec du solut6 tamponn6 au phosphate (pH 7,2) puis 5 fois i 1'eau distill6e. Pr6parer alors une suspension d'erythrocytes fix6s A 30% dans de l'eau dis- till6e et la conserver en fractions de 1 ml A 4°C. Traitement a l'acide tannique des e'rythrocytes fixes. Lorsque les globules rouges de mouton fix6s, pr6par6s selon la m6thode ci-dessus, sont destin6s A 8tre sensibi- lises, le surnageant est elimin6 par decantation. Dans chaque ampoule, ajouter 1 ml de solut6 tam- ponn6 au phosphate (pH 7,2) aux 6rythrocytes qui y sont contenus et agiter mecaniquement. Ajouter encore 8 ml de solute et centrifuger la suspension A 400 g pendant 5 minutes. Repeter cette op6ration. Remettre alors 0,3 ml de culot globulaire en suspension dans 9,7 ml de solution d'acide tannique (a 1: 40 000 dans du solut6 tamponn6 au phosphate pH 7,2) puis incuber A 4°C pendant 15 minutes. Centrifuger la sus- pension a 400 g pendant 5 minutes et 6liminer le sur- nageant. Remettre les globules en suspension dans du solut6 tamponn6 au phosphate (pH 7,2) et centrifuger A nouveau. Finalement, remettre les 6rythrocytes en suspen- sion dans 9,7 ml du solut6 salin. Methode de titrage de l'antigene. On divise la suspen- sion globulaire en 5 fractions qu'on centrifuge. Laver alors les erythrocytes dans du solute tamponn6 au phos- phate (pH 5,5) et centrifuger A nouveau puis eliminer 306 tPREUVES SIROLOGIQUES DANS LE PALUDISME le surnageant. Dans chacun des 5 tubes ajouter du solut6 tamponn6 au phosphate (pH 5,5) pour obtenir un volume total de 0,9 ml de suspension contenant respectivement 0, 60, 100, 200 et 300 ,lA d'antigene. Incuber les tubes bou- ches au bain-marie a 37°C pendant 30 minutes. Centrifuger les tubes et remettre les globules en sus- pension dans du solut6 tamponne au phosphate (pH 7,2) contenant 1% de s6rum inactive de lapin (comme diluant). S6dimenter les 6rythrocytes par centrifugation, les remet- tre en suspension, les laver dans le meme diluant puis les centrifuger A nouveau. Ajouter dans chaque tube, comme diluant, 4 ml de solut6 tamponn6 au phosphate (pH 7,2). Sur une fraction de 0,5 ml provenant d'un tube, d6terminer l'h6matocrite de la suspension. Mettre alors les globules contenus dans chaque tube en sus- pension a 1,3% exactement dans le meme diluant. Pratiquer a l'aide du meme diluant 5 s6ries de dilu- tions de 2 en 2 dans le systeme Microtiter, avec un s6rum t6moin n6gatif et trois s6rums t6moins positifs, dans l'in- tervalle 1: 40 a 1: 5 120. Il est indispensable d'utiliser soit des plaques de type U permanentes en Lucite (Cooke), soit des plaques A usage unique du type U 6 (Linbro). D6poser des volumes de 0,025 ml de chacun des lots de globules sensibilis6s dans une des series de s6rums dilu6s et dans une cupule t6moin contenant uniquement le diluant. Les plaques Microtiter sont imm6diatement plac6es sur un agitateur m6canique pendant 2 minutes. Lire les r6ac- tions d'h6magglutination apres incubation A la tempera- ture ambiante pendant 1 heure, puis conserver les plaques jusqu'au lendemain au r6frig6rateur. La quantit6 optimale d'antigene sensibilisant est la plus petite quantit6 produisant le plus haut titre d'h6mag- glutination avec les s6rums t6moins positifs, alors que la r6action est n6gative dans le cas des globules sensi- bilis6s en pr6sence de s6rums de r6f6rence n6gatifs, et dans celui des globules non sensibilis6s en pr6sence de serums ou du diluant seul. On considere qu'une reaction d'hemagglutination est negative lorsque la cupule pr6sente un culot d'6rythro- cytes sediment6s, et le point final de la r6action est celui oA un aspect en anneau remplace le culot. Sensibilisation. Les globules destin6s A servir dans l'epreuve proprement dite seront sensibilis6s avec la quan- tite optimale d'antigene, telle qu'elle aura et6 d6termin6e par l'6preuve de titrage de l'antigene. On procede de cette maniere aussi bien pour les globules d'6preuve (c'est-a-dire ceux qui sont sensibilis6s avec l'antigene du paludisme) que pour les globules destin6s a la pr6para- tion t6moin (c'est-A-dire les globules sensibilis6s par un antigene t6moin provenant d'6rythrocytes non infect6s). Lyophilisation des Jrythrocytes d'Ypreuve et des Jrythro- cytes timoins Lorsqu'ils ne sont pas utilises imm6diatement, les glo- bules sensibilis6s en suspension a 5-20% dans du diluant peuvent etre lyophilis6s. Ajouter 0,5 ml d'une solution de Tween 80 A 12,5% dans du solute tamponn6 au phos- phate (pH 7,2) par 3 ml de globules rouges agr6g6s pr6sents dans la suspension. Dans des ampoules de Pyrex de 5 ml, preparer des fractions de 1 ml de la suspension et les lyophiliser pendant 18 heures environ. Les ampoules seront scellees sous vide ou apres avoir ete remplies d'azote gazeux sec. La preparation lyophilis6e reste stable pendant plus d'un an A la temperature ambiante, meme dans les pays tropicaux. Avant d'utiliser les globules d'6preuve et les globules t6moins conserves A l'etat lyo- philis6, il faut reconstituer la suspension en ajoutant du diluant au contenu des ampoules. Pour que la recons- titution soit optimale, melanger soigneusement le contenu des ampoules afin d'eviter toute formation de mousse, ce qui aurait un effet defavorable sur la qualite des 6ry- throcytes. Tout d'abord, on n'ajoutera que la moitie du diluant aux globules temoins lyophilises, car ces globules doivent servir en premier lieu pour l'absorption. Examen des Jchantillons par l'epreuve IHA Dans l'epreuve proprement dite, la premiere etape est une absorption destin6e A 6liminer l'activite agglutinante non specifique des 6chantillons de plasma A 6tudier. Dans la premiere cupule de chaque rang6e de la plaque Micro- titer, on m6lange deux gouttes (c'est-A-dire 0,05 ml) des echantillons de plasma ou de serum dilues a 1: 10 avec un volume egal de suspension globulaire temoin deux fois plus concentr6e, c'est-a-dire A 2,6%. Lorsque la premiere rang6e de cupules de la plaque Microtiter est seule rem- plie, agiter m6caniquement les suspensions globulaires pendant 2 minutes et les incuber A temperature ambiante pendant 1 heure. A la fin de cette incubation, les globules temoins se seront d6poses au fond de la cupule. Prelever alors 0,025 ml du surnageant (c'est-a-dire de l'echantillon absorbe dilu6 a 1: 20) A partir de la premiere cupule pour effectuer une nouvelle dilution en serie de 2 en 2 dans le diluant. Utiliser ces dilutions des 6chantillons pour les m6langer avec la suspension A 1,3 % de globules d'epreuve. Un autre volume de 0,025 ml de l'6chantillon absorbe sera dilue en s6rie A 1: 40 et 1: 80 pour recevoir ulterieurement 0,025 ml de suspension a 1,3 % de glo- bules t6moins afin de v6rifier s'il n'y a pas persistance de facteurs agglutinants non sp6cifiques dans l'&ehantillon apres absorption. Chaque plaque comportera encore d'autres cupules t6moins: ainsi 0,025 ml de suspension d'6rythrocytes t6moins [et 0,025 ml Id'6rythrocytes d'6preuve seront ajout6s respectivement A differentes cupules contenant seulement 0,025 ml de diluant. Agiter m6caniquement les plaques pendant 2 minutes et les incuber comme pour le titrage de l'antigene. Pour determiner le titre de l'anticorps sp6cifique des s6rums impalud6s dans les cupules oh l'on a m6lange les dilutions des 6chantillons avec les globules d'epreuve, il est indis- pensable que, dans toutes les cupules t6moins, la s6di- mentation traduise une r6action negative. 307 308 MEMORANDA Annexe 3 tPREUVE DE DIFFUSION EN MILIEU GILIFIJ Methode d'execution de l'cepreuve Une double diffusion par la methode d'Ouchterlony peut etre effectu6e en gelose Noble I 1,5% dans du tampon au phosphate 0,3 M (pH 8,0) ou du tampon au barbital 0,05 M (pH 8,6) sur lames pour microscope. Les gels prepares avec du tampon au barbital ont ten- dance a donner une meilleure r6solution des reactions de pr6cipitation complexes. On a observe que des reser- voirs de 2 mm de diametre disposes a une distance de 5 mm (d'un centre a l'autre) sont satisfaisants. L'antigene est extrait du sang infecte par des methodes de desintegration telles que la cong6lation et decongela- tion, et l'action des ultra-sons ou celle de la pression, avec une presse de Hughes ou un appareil similaire. II faut que la parasitemie soit importante (environ 50% d'6rythrocytes infectes) et que la plupart des parasites soient des schizontes arrives a maturite ou presque. Centrifuger les extraits a 28 000 g au minimum, pendant 20 minutes, et utiliser le surnageant clair comme antigene. Les formes erythrocytaires asexuees miures de P. falci- parum etant rares dans le sang peripherique des sujets impaludes, on se procurera du sang infecte de maniere satisfaisante a) 'a partir de placentas humains infectes et b) par culture in vitro, dans des milieux de marque deposee, jusqu'a maturite du parasite, en partant de sang infecte de trophozoites obtenu chez des sujets impalud6s.a Dans tous les cas, on peut augmenter la densite des schi- zontes du sang infecte par centrifugation lente (a 400 g) pendant 15 minutes et en recueillant la couche couleur chocolat, riche en schizontes, qui se forme au-dessous de la couche leucocytaire (buffy coat). I1 n'est pas souhai- table que les erythrocytes soient hemolyses avant l'extrac- tion de l'antigene. Faire diffuser l'antigene et les immunserums dans des milieux gelifies It temperature control6e (en general 4°C) pendant 48 heures dans une chambre humide, laver ensuite les lames pendant 48 heures au maximum dans une solution de chlorure de sodium 'a 1% contenant environ 0,01 M d'azoture de sodium, renouvelee au moins a Bull. Organ. mond. Sante, 47: 357 (1972). deux fois; on evitera soigneusement de soulever ou de briser le gel. Apres lavage, on peut examiner les gels humides par transillumination pour rechercher la pr6- sence de precipitines. Rincer alors les lames A l'eau dis- tillee pendant 1 heure, puis appliquer une bande humide de papier filtre sans peluchage, pour recouvrir la surface du gel, et laisser la lame secher lentement A la tempera- ture ambiante (en general pendant 16 A 24 heures). On peut ensuite colorer les lames avec un colorant appro- prie, par exemple le bleu noir naphtol. Pour rechercher les reactions de precipitation, examiner les lames colorees tant macroscopiquement qu'A I'aide d'une loupe (x8 a x 10) avec un bon 6clairage, sur fond blanc. Comme dans les autres epreuves immunologiques, il faut inclure des serums temoins positifs et negatifs dans les systemes d'epreuve. Mode d'interpretation 1) La methode la plus simple consiste A enregistrer les resultats negatifs et positifs. 2) On peut compter le nombre d'arcs presents entre les divers serums et le reservoir d'antigene. 3) On peut determiner le titre de l'anticorps en diluant les serums d'epreuve de maniere convenable. Conservation de l'antigene Quoique l'on puisse, semble-t-il, conserver les extraits aqueux d'antigene A -70°C pendant de nombreuses semaines sans deterioration notable de l'activit6 anti- genique, il vaut sans doute mieux conserver le sang infecte a - 70°C et en d6sintegrer une fraction au moment ou l'on a besoin d'extraits antigeniques. On a conserv6 ainsi du sang infecte lyophilis6 pendant 5 ans sans deteriora- tion apparente. A la temp6rature du laboratoire, le sang infecte lyophilise semble se conserver de maniere satis- faisante pendant au moins 1 mois. Quant aux extraits prepares A partir du sang infecte, leur activite diminue lentement lors de la conservation a - 20°C et rapidement A 4°C. En general, les antigenes du groupe labile sont les premiers a perdre leur activite.