Prélèvement d'échantillons sanguins par ponction veineuse et préparation d'étalements de sang à partir de sang veineux collecté dans des tubes contenant un anticoagulant

VERSION 1 – DATE EFFECTIVE : 01/01/2016 PRÉLÈVEMENT D’ÉCHANTILLONS SANGUINS PAR PONCTION VEINEUSE ET PRÉPARATION D’ÉTALEMENTS DE SANG À PARTIR DE SANG VEINEUX COLLECTÉ DANS DES TUBES CONTENANT UN ANTICOAGULANT DIAGNOSTIC MICROSCOPIQUE DU PALUDISME MODES OPÉRATOIRES NORMALISÉS – DMP-MON-05B 1. OBJECTIF ET CHAMP D’ACTION Fournir une description détaillée de la procédure à suivre pour le prélèvement d’échantillons sanguins par ponction veineuse et la préparation de frottis et de gouttes épaisses à partir de sang veineux collecté dans des tubes contenant un anticoagulant. Cette procédure ne peut être modifiée qu’avec l’approbation du coordonnateur national pour l’assurance de la qualité du diagnostic microscopique du paludisme. Toutes les procédures exposées ici sont obligatoires pour tous les techniciens de la microscopie travaillant dans les laboratoires nationaux de référence, dans les laboratoires des hôpitaux ou dans les laboratoires médicaux de base au sein des établissements sanitaires où sont effectués des examens microscopiques pour le diagnostic du paludisme. 2. HISTORIQUE Dans certains établissements sanitaires, les échantillons de sang veineux sont collectés pour effectuer plusieurs analyses, dont le diagnostic microscopique du paludisme. On prélève des volumes de sang veineux plus abondants que pour le sang prélevé au bout du doigt. Les prélèvements de sang veineux sont stockés dans des tubes contenant un anticoagulant (de préférence de l’acide éthylène diamine tétra- acétique [EDTA]). Les échantillons de sang veineux traités à l’aide de l’EDTA peuvent être utilisés dans la préparation de frottis et de gouttes épaisses pour le diagnostic du paludisme. Les procédures à suivre sont abordées dans ce document. 3. FOURNITURES, MATÉRIEL ET ÉQUIPEMENTS • Des lames de verre propres de 25 × 75 mm, avec une extrémité en verre dépoli permettant l’étiquetage, de préférence comportant des bords rodés et de bonne qualité (voir DMP-MON-01 : Nettoyage et stockage des lames de microscope). • Une seringue par patient, avec une aiguille (de calibre 21 ou 23). • Un tube à vide (tube électronique) par patient de 4 à 5 ml, contenant un anticoagulant tel que l’EDTA. • De l’alcool éthylique à 70 % ou des tampons d’alcool. • Du coton hydrophile (tampon d’ouate ou de gaze, coton-tige). • Des gants de protection en latex (sans talc). • Un garrot. 2DMP–MON–05B : PRÉLÈVEMENT D’ÉCHANTILLONS SANGUINS PAR PONCTION VEINEUSE ET PRÉPARATION D’ÉTALEMENTS DE SANG À PARTIR DE SANG VEINEUX COLLECTÉ DANS DES TUBES CONTENANT UN ANTICOAGULANT • Un contenant biorisque ou tout autre collecteur d’aiguilles résistant aux perforations (voir DMP- MON 13 : Gestion des déchets issus de tests de diagnostic du paludisme). • Un conteneur pour déchets infectieux (voir DMP-MON 13 : Gestion des déchets issus de tests de diagnostic du paludisme). • Une micropipette. • Un embout de pipette. • Un gabarit pour la préparation d’un frottis. • Un râtelier de séchage. • Des formulaires d’enregistrement (c’est-à-dire un registre pour le paludisme). • Un crayon à mine ou un stylo indélébile. 4. CONSIGNES DE SÉCURITÉ • Pour votre sécurité et afin d’éviter les traces de graisse sur la lame pouvant entraver la préparation du frottis, enfilez des gants de protection en latex avant de prélever des échantillons sanguins et lorsque vous manipulez les lames. Portez des gants de protection pour manipuler du sang et retirez-les avant de quitter la zone où vous travaillez ou lorsque vous prenez des notes. • Utilisez toujours une nouvelle seringue et une nouvelle aiguille pour chaque patient. • Évitez de vous mettre du sang, séché ou frais, sur les doigts ou les mains. • Mettez un pansement étanche sur les coupures ou les écorchures de la main. • Évitez de vous piquer accidentellement en manipulant des instruments tranchants qui ont été en contact avec du sang. • Lavez-vous soigneusement les mains à l’eau et au savon dès que vous avez fini un travail. • Si vous avez du sang sur la peau, essuyez-le rapidement avec un coton-tige imbibé d’alcool. Lavez ensuite dès que possible la zone touchée à l’eau et au savon. 3DMP–MON–05B : PRÉLÈVEMENT D’ÉCHANTILLONS SANGUINS PAR PONCTION VEINEUSE ET PRÉPARATION D’ÉTALEMENTS DE SANG À PARTIR DE SANG VEINEUX COLLECTÉ DANS DES TUBES CONTENANT UN ANTICOAGULANT 5. PROCÉDURE SCHÉMA DESCRIPTION DE L’ACTIVITÉ 4.1. Prélèvement d’échantillons sanguins par ponction veineuse 1. Étiquetez le tube en indiquant « EDTA », conformément au DMP-MON 6a : étiquetage des étalements de sang à la recherche du paludisme. 2-3. Posez un garrot autour du haut du bras du patient et cherchez une grosse veine peu mobile. 4-5. Désinfectez le site de l’injection avec de l’alcool et laissez sécher à l’air. 6. Insérez l’aiguille (fixée à une seringue ou un tube Vacutainer) et prélevez progressivement le sang. 7. Défaites le garrot, retirez l’aiguille et appuyez fermement sur le site de la ponction avec du coton hydrophile sec. 7. Défaites le garrot, retirez l’aiguille et appuyez fermement sur le site de la ponction avec du coton hydrophile sec. 8. Transvasez le sang dans le tube contenant l’EDTA et mélangez délicatement en retournant le tube six fois. 4.1. Prélèvement d’échantillons sanguins par ponction veineuse 1. Étiquetez un tube contenant de l’EDTA avec le nom du patient, la date et l’heure du prélèvement. Voir DMP-MON-06a : Étiquetage des étalements de sang à la recherche du paludisme. 2. Posez un garrot autour du haut du bras du patient pour pouvoir distinguer ou sentir les veines. Demandez au patient de serrer le poing pour faire ressortir les veines. 3. De l’index, cherchez une veine assez grosse et stable. 4. Désinfectez le site avec un tampon d’alcool ou un coton imbibé d’alcool éthylique ou isopropylique à 70 %. Ne touchez plus la zone désinfectée. 5. Laissez sécher à l’air pendant 30 secondes pour vous assurer de ne pas contaminer l’échantillon sanguin avec de l’alcool, ce qui peut provoquer une hémolyse. 6. Insérez une aiguille de phlébotomie stérile, à usage unique (fixée à une seringue ou un tube Vacutainer) dans la veine, biseau vers le haut. Prélevez progressivement >2 ml à 4 ml de sang. Note : Les anticoagulants peuvent interférer avec l’adhésion du sang à la lame et avec le colorant de Giemsa, en particulier si la proportion du sang par rapport à l’anticoagulant n’est pas optimale. Par conséquent, le volume de sang dans un tube de 5 ml devrait être >2 ml. 7. Lorsque vous avez prélevé une quantité de sang suffisante, défaites le garrot et demandez au patient de défaire son poing. Retirez l’aiguille et appuyez fermement sur le site de la ponction veineuse avec du coton hydrophile sec. Demandez au patient de continuer à appuyer sur le site de la ponction, en gardant le bras levé, jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de saignement. 8. Transvasez le sang dans le tube contenant l’EDTA et mélangez délicatement en retournant le tube six fois. Ne secouez pas le tube. 4DMP–MON–05B : PRÉLÈVEMENT D’ÉCHANTILLONS SANGUINS PAR PONCTION VEINEUSE ET PRÉPARATION D’ÉTALEMENTS DE SANG À PARTIR DE SANG VEINEUX COLLECTÉ DANS DES TUBES CONTENANT UN ANTICOAGULANT SCHÉMA DESCRIPTION DE L’ACTIVITÉ 4.2. Préparation de gouttes épaisses et de frottis minces 1. Mélangez délicatement le sang dans un tube contenant de l’EDTA avant de l’utiliser. 2. Placez une lame de microscope propre et étiquetée sur le gabarit de préparation de la lame pour le paludisme (voir Figure 1) 3. À l’aide d’une micropipette à embout, déposez 6 µl de sang sur le cercle plus grand de la lame et préparez la goutte épaisse. 4. À l’aide d’une micropipette à embout, déposez encore 2 µl de sang sur le petit cercle de la lame et préparez le frottis mince. 5-7. En utilisant une lame propre pour étaler les gouttes, préparez le frottis mince en poussant la goutte de sang vers l’avant dans un mouvement doux et continu. 8. Laissez sécher à l’horizontale. Si vous désirez un séchage rapide des lames, vous pouvez utiliser une plaque chauffante. 4.2. Préparation de gouttes épaisses et de frottis minces 1. Mélangez délicatement le prélèvement de sang veineux dans un tube à vide contenant de l’EDTA. 2. Placez une lame de microscope propre et étiquetée sur un gabarit normalisé de préparation de la lame pour le frottis et la goutte épaisse (1,2 cm ou 12 mm de diamètre) (voir Figure 1). 3. À l’aide d’une micropipette à embout, déposez 6 µl de sang sur le cercle plus grand de la lame. Remuez le sang avec le bout de la micropipette pour former un cercle d’environ 1 cm de diamètre et préparez la goutte épaisse ; il suffit de frotter le sang trois ou six fois avec le bout de la micropipette. 4. Prélevez 2 µl supplémentaires de sang à l’aide d’une micropipette à embout et déposez le sang sur le petit cercle du gabarit de la lame. 5. Pour préparer le frottis, placez le bord d’une lame propre servant à répartir la goutte à 45° devant la goutte de sang prévue pour le frottis mince. 6. Tirez délicatement la lame servant à l’étalement de la goutte vers l’arrière jusqu’à ce qu’elle touche la goutte de sang et que celle-ci se répartisse le long du bord de la lame d’étalement. 7. Poussez rapidement la deuxième lame vers l’avant (éloignez-la du centre) avec un mouvement continu, sans à-coups, jusqu’à ce que la deuxième lame ait permis un étalement en forme de « plume », qui servira pour le frottis. 8. Séchez les lames que vous avez préparées à l’horizontale. Le sang traité à l’EDTA a tendance à mal adhérer à la lame. Si vous désirez un séchage rapide des lames, séchez les étalements avec de l’air chaud provenant d’un sèchecheveux, à une distance raisonnable. Il faut toutefois éviter de placer les lames trop près du sèche- cheveux, faute de quoi la chaleur risque de fixer les étalements de sang. 5DMP–MON–05B : PRÉLÈVEMENT D’ÉCHANTILLONS SANGUINS PAR PONCTION VEINEUSE ET PRÉPARATION D’ÉTALEMENTS DE SANG À PARTIR DE SANG VEINEUX COLLECTÉ DANS DES TUBES CONTENANT UN ANTICOAGULANT 6. REMARQUES • Le sang collecté dans des tubes contenant de l’EDTA ne doit pas être conservé plus de quatre heures avant la préparation des frottis et des gouttes épaisses, sans quoi l’anticoagulant risque d’altérer la morphologie du parasite. • Si vous prélevez du sang veineux ailleurs que dans le laboratoire où les frottis et les gouttes épaisses seront préparés, l’échantillon doit être acheminé sans délai (dans l’heure, idéalement) au laboratoire, sans refroidissement ni réfrigération. • Les gouttes épaisses devraient sécher à l’horizontale et être protégées des mouches et de la saleté. • La goutte épaisse peut se fixer spontanément en cas d’exposition à une chaleur élevée et devrait donc être colorée immédiatement. • On peut sécher la goutte épaisse en douceur en utilisant un sèche-cheveux à air chaud ou toute autre méthode de séchage, pour autant que l’étalement ne se fixe pas spontanément avec la chaleur, ce qui peut survenir rapidement. Ne remettez un sèche-cheveux qu’aux techniciens sachant utiliser cette méthode. • N’utilisez pas de stylo à bille ou de stylo à encre gel pour étiqueter les lames, car l’encre se répandra sur la lame au moment de la fixation. • Quand la préparation est correcte, il reste très peu de sang sur la lame qui a servi à faire les étalements. Celle-ci peut donc être utilisée pour recueillir le sang du patient suivant et y faire la goutte épaisse et le frottis avec une nouvelle lame propre tirée du paquet. 7. MODES OPÉRATOIRES NORMALISÉS CONNEXES DMP-MON-01 : Nettoyage et stockage des lames de microscope DMP-MON-06a : Étiquetage des étalements de sang à la recherche du paludisme DMP-MON-13 : Gestion des déchets issus de tests de diagnostic du paludisme 8. RÉFÉRENCES OMS. Manuel sur l’assurance de la qualité pour le diagnostic microscopique du paludisme. Version 2. Genève, 2015. 9. HISTORIQUE DU DOCUMENT Date (mois/année) Version Commentaires Personne responsable (Nom, prénom) Janvier 2016 1 Examiné et finalisé par des experts, édité et mis en page Gonzales, Glenda Fonctionnaire technique, WPRO Figure 1. Gabarit pour la préparation d’étalements de sang WHO/HTM/GMP/MM/SOP/2016.05b © Organisation mondiale de la Santé 2016. Tous droits réservés.