Valeur et limites de l'antigène Plasmodium gallinaceum pour le sérodiagnostic du plaudisme humain par immunofluorescence indirecte

856 BRIEF COMMUNICATIONS/NOTES Valeur et limites de I'antigene Plasmodium gallinaceum pour le serodiagnostic du paludisme humain par immunofluorescence indirecte * P. AMBROISE-THOMAS,l C. C. DRAPER,2 T. KIEN TRUONG,3 & A. GOULLIER4 Pour le serodiagnostic des paludismes humains, les meilleurs r6sultats sont evidemment obtenus en employant des plasmodiums parasites de l'homme qui constituent des antigenes specifiques. L'obtention reguliere de tels plasmodiums se heurte malheureusement 'a de nombreux problemes pratiques. Differents chercheurs ont donc tente d'uti- liser des especes plasmodiales qui peuvent etre plus facilement entretenues au laboratoire. Tous les essais realises avec les parasites des ron- geurs (Plasmodium berghei notamment) se sont prati- quement soldes par des echecs. En revanche, les opinions sont plus contradictoires en ce qui concerne P. gallinaceum. D'apres certains auteurs en effet, ce parasite constituerait un antigene assez satisfaisant pour le diagnostic serologique des paludismes humains. C'est ce qu'ont notamment signale Lippincott et al. (1945) par la technique de fixation du complement, Todorovic et al. (1967) par des tests d'agglutination et surtout Kielmann et al. (1968 a, b; 1970 a, b) en immuno-fluorescence indirecte. Au contraire, Ingram et al. (1961) et Voller (1962) n'ont pas observe de reactions croisees entre ce plasmodium et les especes parasites des primates. Pour tenter de clarifier cette situation discordante, nous avons 6tudi6 en immunofluorescence indirecte 183 serums en utilisant comme antigene P. galli- naceum et P. cynomolgi bastianellii; 90 de ces serums ont en outre W e'tudies face a l'antigene P. falci- parum. Materiel et methodes Antigenes. Pour la preparation de nos antig6nes, nous avons utilise: * Travail effectu6 avec l'aide financiere de l'Organisation mondiale de la Sante. 1 Professeur agr6ge, Laboratoire de Parasitologie et Pathologie exotique, Facult6 de Medecine de Grenoble, 38 La Tronche, France. ' Senior Lecturer, London School of Hygiene and Tropical Medicine, Keppel Street, Londres, Angleterre. 3 Assistant au Laboratoire de Parasitologie, Facult6 de Medecine et de Pharmacie, Universit6 de Lyon, France. ' Assistante de Parasitologie, Centre hospitalier universi- taire. Grenoble. deux souches differentes de P. gallinaceum (Insti- tut tropical suisse de Bale et Institut Pasteur de Paris) entretenues chez le poulet par injection de sang parasit6. Au cours d'essais preliminaires, nous avons employ6 des sangs d'animaux in- fectes depuis 6 a 15 jours (parasitemie variant de 10 a 80 %). Pour tout le reste de l'etude, nous avons employ6 des sangs recueillis 8 a 9 jours apres l'inoculation et contenant environ 20% d'hematies parasitees; une souche de P. cynomolgi bastianellii entretenue sur des Macaca mulatta (rhesus) splenectomises et inocules par injection de sang parasite. Lors du prelevement, effectue apres 7 'a 10 jours, la parasit6mie etait de 10% environ; - enfin, une souche de P. falciparum entretenue sur des Aotus trivirgatus splenectomises. La para- sitemie au moment du prelevement etait de 10% environ. A l'aide de ces differents sangs parasites, nous avons prepare des lots d'antigenes constitues soit par des etalements minces, soit encore par des gouttes epaisses suivant la technique de Sulzer & Wilson (1967). Jusqu'au moment de leur emploi, ces prepara- tions antigeniques ont ete conservees au congelateur a -700C. Antiserums. Neuf des 183 serums etudies ont ete preleves chez des animaux d'experience. II s'agit de serums de chimpanzes impaludes avec des plas- modiums humains et d'un pool de serums de souris blanches hyperimmunis6es contre P. berghei yoelii. Les 174 autres serums etaient d'origine humaine. Ils correspondaient: a- des sujets sains n'ayant jamais effectue de sejours outre-mer et ne presentant aucun ante- cedent palustre (sujets temoins); a- des sujets suspects de paludisme ou d'antece- dents palustres; enfin, a des malades presentant un paludisme confirme. Ces differents serums ont tous ete conserves au congelateur a - 70°C. Ils avaient 6te au prealable 286Sc ANTIGENE P. GALLINACEUM POUR LE DIAGNOSTIC DU PALUDISME HUMAIN repartis dans une serie de petits tubes, de maniere a ce que chacun des echantillons ne soit soumis qu'a une seule decongelation. Pour les reactions avec les antigenes P. cynomolgi bastianellii et P. gallinaceum, chaque serum a ete etudie aux dilutions 1/20, 1/40, 1/80, etc. Par contre, les reactions d'immunofluorescence avec l'antigene P. falciparuim ont ete effectuees aux dilutions 1/16, 1/32, 1/64, etc. Tous ces tests ont ete faits suivant la methode du double anonymat, soit a l'interieur d'un laboratoire, soit meme dans deux laboratoires differents (Londres, Grenoble ou Lyon). Technique. Les reactions d'immunofluorescence ont ete effectuees suivant les modalites precedemment decrites (Ambroise-Thomas, 1969). Si on excepte la contre-coloration par le Bleu d'Evans que nous n'avons pas utilisee c'est d'ailleurs exactement la technique employee par Kielmann et ses colla- borateurs. R&sultats et commentaires Influence de la souche utilise'e, de la date du pre- lvement et de la parasitemie sur la valeur antigenique de P. gallinaceum. Trente serums humains positifs ont ete etudies au cours de plusieurs series de reac- tions d'immunofluorescence indirecte, avec differents lots d'antigene P. gallinaceum. Pour la preparation de ces antigenes, nous avons fait successivement varier les facteurs suivants: la souche de P. gallinaceum (Institut tropical suisse de Bale ou Institut Pasteur de Paris); la date de prelevement des sangs parasites (entre le 6e et le 15e jour); enfin, la parasitemie (entre 10 et 80%). Dans tous les cas, les titres d'anticorps fluorescents sont demeures sensiblement constants, les variations enregistrees n'excedant jamais un degre de la gamme de dilution. Nos observations correspondent donc exactement a celles de Kielmann et al. (1970 a, b) et il ne semble pas que l'activite antigenique de P. gallinaceum soit le fait d'une souche particuliere. L'anciennete de l'infection et le niveau de la parasitemie au moment ou sont effectues les prelevements ne paraissent pas non plus modifier sensiblement la reactivite anti- genique de P. gallinaceum, au moins dans la mesure ou ces prelevements sont realis's pendant la phase aigue de la maladie experimentale. Contro6les de spe'cificite'. Nous avons etudie 40 serums humains preleves chez des sujets pour lesquels l'existence d'antecedents palustres pouvait etre ex- clue. Face aux trois especes plasmodiales servant d'antigenes (P. gallinaceum, P. cynomolgi bastianellii ou P. falciparum) la grande majorite de ces serums a donne des resultats negatifs des la premiere dilu- tion. Dans deux cas, nous avons cependant observe de faibles fluorescences aux dilutions 1/16 et 1/20 face aux antigenes P. Jalciparum ou P. cynomolg! bastianellii. L'un de ces serums a egalement e trouve faiblement positif a 1/20 avec l'antigene P. gallinaceum (tableau 1). Par ailleurs, un pool d'immunserums de souris blanches anti-P. berghei yoelii a ete incorpore dans Tableau 1. S6rums t6moins Nombre de s6rums pr6sentant un titre (inverse) Antigene Nature des d'anticorps fluorescents de Totals6rurns 0 16 20 32 40 H a 38 2 NP b S c 1 0 NP H 38 NP 2 S 0 NP 0 H 39 NP S 0 NP 0 NP 40 0 NP 1 NP 0 40 NP 1 1 NP 0 40 NP 0 1 14 P. falciparum P. cynomolgi bastianelli P. gallinaceum a H = s6rum humain t6moin n6gatif. b NP = test non pratiqu6. c S = pool d'hyperimmuns s6rums de souris anti-P. bergheiyoelii. 857 858 BRIEF COMMUNICATIONS/NOTES Tableau 2. S6rums de chimpanz6s impalud6s exp6rimentalement Type et anciennet6 de l'infection Inverses des titres d'anticorps Singe _________________ Traite- fluorescents avec los antigbnes No P. faklc- p vivx P malaria ment P. falci- P. cynomolgi P. galli- parum * * e parum bastlanellii naceum 315 Npa 12 mois 48 mois 0 64 80 20 521 3 mois 24 mois NP 0 64 40 0 4 mois'h 25 mois% NP 0 64 40 0 6 mois 27 mois NP 0 16 20 0 8 mois 29 mois NP 0 16 40 0 543 NP 4 mois NP 0 0 20 0 NP 7 mois NP 0 16 20 0 NP 9 mois NP 0 0 0 0 a NP Test non pratiqu6. ces series de controles. I1 a donn6 des reactions anti-immunoglobulines humaines qui, normalement, faiblement positives face aux antigenes P. gailinaceum n'aurait pas dui r6veler des anticorps de souris. et P. cynomolgi bastianellii. Les examens sur ce pool de serums ont donc ete Ce resultat nous a paru doublement surprenant rep6t6s & plusieurs reprises, chaque fois avec le meme puisqu'il n'existe pratiquement pas de communaute r6sultat. antig6nique entre les plasmodiums des rongeurs et L'ensemble de ces observations rejoint tout A fait les parasites des primates ou ceux des oiseaux. En ce que nous avons obtenu dans d'autres etudes et il outre, au cours de nos series de r6actions effectu6es faut certainement etre tres prudents en ce qui con- en double insu, nous utilisions un conjuguefluorescent cerne la valeur des reactions d'immunofluorescence Tableau 3. S6rums humains de sujets suspects de paludisme ou d'ant6c6dents palustres: comparaison des antig6nes P. cynomolgi bastianellii et P. gallinaceum a Antigbne P. gallinaceum Total 0 20 40 80 160 320 640 0 18 6 1 0 0 0 0 25 (20,8%) 20 29 4 1 0 0 0 0 34 Antigene 40 14 6 5 1 0 0 0 26 P. cynomolgi bastianellii 80 4 5 2 2 1 0 0 14 95 s6rums positifs (80,2%) 160 2 1 3 5 2 0 0 13 MGITb: 22,4 320 0 0 0 1 2 1 0 4 640 0 0 0 1 2 0 1 4 Total 67 22 12 10 7 1 1 120(55,8%) 53 s6rums positifs (44,2%) MGIT b: 5,4 a La teneur des serums en anticorps est exprim6e par l'inverse des titres. b MGIT = moyenne g6om6trique de l'inverse des titres d'anticorps fluorescents. ANTIGiNE P. GALLINACEUM POUR LE DIAGNOSTIC DU PALUDISME HUMAIN faiblement positives. Si les dilutions de 1/16 ou de 1/20 sont en effet generalement retenues comme seuil de specificite du test, cette valeur liminaire n'est pas absolue et elle reste exposee a des risques de rdactions croisees. Le titre d'anticorps correspondant ne saurait donc entrainer une certitude diagnostique et on ne peut lui accorder tout au plus qu'un interet d'orientation. Serums de chimpanzes impaludes experimentale- ment. Le tableau 2 rapporte les resultats obtenus 'a partir des serums de trois chimpanzes qui, apres splenectomie, ont ete impaludes avec P. malariae et avec P. vivax (singe No 315), P. vivax puis P. fal- ciparum (singe NO 521), ou bien seulement avec P. vivax (singe NO 543). Pour ces 8 s6rums, nous avons observ6 des titres d'anticorps fluorescents sensiblement equivalents avec les antigenes P. falciparum et P. cynomolgi bastianellii. En revanche, l'antigene P. gallinaceum s'est revel6 beaucoup moins actif en ne donnant qu'un seul r6sultat faiblement positif (1/20). Serums humains preleves chez les malades suspects d'anteJddents palustres. La comparaison des anti- genes P. gallinaceum et P. cynomolgi bastianellii a port6 sur 120 s6rums de sujets ayant s6journe outre- mer et pr6sentant des ant6c6dents palustres certains ou tres probables (tableau 3). Sept de ces serums ont ete trouves positifs aux deux premieres dilutions (1/20 ou 1/40) avec l'anti- gene P. gallinaceum alors qu'ils donnaient des tests negatifs avec l'antigene P. cynomolgi bastianellii. Inversement, 49 s6rums etaient negatifs avec l'anti- gene P. gallinaceum tandis qu'ils etaient positifs ou meme fortement positifs avec l'antigene P. cyno- molgi bastianellii. Si l'on considere les resultats d'ensemble, ce der- nier antigene a fourni 80,2% de reactions positives et un titre moyen d'anticorps fluorescents (MGIT) de 22,4. Avec l'antigene P. gallinaceum, ces chiffres etaient respectivement de 44,2% et de 5,4. La comparaison des antigenes P. falciparum, P. cynomolgi bastianellii et P. gallinaceum a ete effec- tu6e sur 30 des serums pr&c6dents qui ont et6 6galement etudies face a l'antig6ne P. falciparum (tableau 4). En ce qui concerne aussi bien le pourcentage des r6sultats positifs que les titres moyens d'anticorps fluorescents, les deux plasmodiums des primates ont, lM encore, donne des resultats sensiblement 6qui- valents et qui sont tres superieurs & ceux que nous avons observ6s avec I'antig6ne P. gallinaceum. E 0 (3 C,) Cq '0 cn0r, Co0 E -o 0 cn C, 0. E 0E cn C. -o 0._ 3 n ._' s 0. 0B -Q is - E O tn aw0 0 D 'a 0 0 0 o 0 ~0 0 co 0 0c ._I C 3 co 0 c E o 0 .0 C 0 z CD00 0 o 0 0 CD - LO 0 N Cf, CD 0 CD 0 co le 0 N c,, 0 CCD 0 0 C AD C o N Nt to eP U)N o 0 0 C,, CI C' I- Z Z 0 Z Z I- Z Z 0L z 0 0 0. 0.Z Z 0. Z 0 0 N Z Z 0. Z 0 I Z Z 0. e oNZ Z Z 0 .0 Z C'iP4 Q. Z Z Z cO N Z Z C- E. 1A I%0: 859 0; c0 0 0 e 0 Z 0.co .C C 0o lac0 - 0 to -0 C Lo 0 0 la oC DCX Z E.. 10. BRIEF COMMUNICATIONS/NOTES Tableau 5. Paludismes humains certains: comparaisons des antig6nes P. falciparum, P. cynomolgi bastianelli et P. gallinaceum Inverses des titres d'anticorps fluorescents Surnm avec les antigbnes No Type d'infection P. falciparum P. cynolg' P. gallinaceum 1 P. ova/e (en cours d'accbs) 32 80 20 2 P. vivax (primo-invasion) Npa 320 0 3 P. vivax (rechute) NP 2560 2560 4 P. vivax (rechute) NP 1280 640 5 P. vivax (rechute) NP 640 640 6 P. vivax (rechute) 256 640 160 7 P. vivax (1 semaine aprbs traitement 256 1280 320 par la chloroquine) 8 P. vivax (anciennement trait6 par 64 80 20 la chloroquine) 9 P. falciparum (pool de s6rums positifs) 4096 320 160 10 P. falciparum (en cours d'accbs) 1024 160 40 11 P. falciparum (1 semaine aprbs 1024 40 20 traitement par la chloroquine) 12 P. falciparum post-transfusionnel (1 an 1024 20 20 aprbs traitement par la chloroquine) 13 P. falciparum (6 mois aprbs traitement 256 40 40 par la chloroquine) 14 P. ma/ariae (rechute) b 64 320 20 a NP = test non pratiqu6. b S6rum positif b 1/2560 face b I'antigbne P. ma/ariae. Paludismes humains confirmes. Comparaison des antigenes P. falciparum, P. cynomolgi bastianellii et P. gallinaceum. Nous avons pu etudier 14 serums humains pr6leves, avant ou apres traitement par la chloroquine, chez des sujets atteints de paludisme 'a P. ovale, P. vivax, P. falciparum ou P. malariae (tableau 5). Les tests pratiques avec les antigenes P. falciparum et P. cynomolgi bastianellii ont tous ete positifs, le plus souvent a des titres tres nettement significatifs. Les antigenes heterologues ont bien evidemment donne des resultats moins eleves que l'antigene speci- fique (P. falciparum pour les serums NOs 9 et 13, P. malariae pour le serum No 14), ou qu'un antigene tres proche de l'antigene specifique (P. cynomolgi bastianellii pour les serums anti-P. vivax N0s 2, 6, 7 et 8). Contrairement a Kielmann et al. (1970a), nous n'avons pas observe de titres plus eleves avec l'anti- gene P. gallinaceum qu'avec les plasmodiums des primates. L'antigene P. gallinaceum nous a cependant donne six reactions nettement positives et meme, dans trois cas, des titres identiques ou tres compa- rables i ceux qui ont 6te observes avec P. cynomolgi bastianellii (serums Nos 3, 4 et 5). Cependant, un des serums etudies a ete trouve negatif avec ce meme antigene, 7 autres serums n'etant que faiblement positifs (1/20 ou 1/40) ce qui correspond sensiblement a la limite de la specificite du test. Conclusion et resume' L'etude de 180 serums preleves chez des malades atteints de paludisme, chez d'anciens paludeens, chez des sujets temoins ou encore chez des animaux d'experience permet de confirmer en partie les con- clusions de Kielmann et de ses collaborateurs. Il est en effet indiscutable qu'en immunofluorescence in- directe l'antigene P. gallinaceum peut permettre la detection d'anticorps anti-P. vivax, P. falciparum, 860 ANTIGENE P. GALLINACEUM POUR LE DIAGNOSTIC DU PALUDISME HUMAIN 86f P. malariae ou P. ovale. Etant donne la facilite avec laquelle P. gallinaceum peut etre entretenu au laboratoire, il est evidemment tres tentant de l'uti- liser comme reactif pour le s6rodiagnostic des palu- dismes humains. Cette utilisation nous parait cependant hasardeuse et justifie la plus extreme prudence. En effet, seules les reactions fortement positives ont une valeur diagnostique indiscutable. Ce type de reactions est assez rare avec l'antigene P. galli- naceum. Au contraire, on observe generalement de faibles titres d'anticorps fluorescents qui, etant donne la possibilite de reactions croisees, ne permettent pas d'affirmer la realite de l'infection palustre. In- versement, la faible sensibilite de cet antigene n'auto- rise pas ta ecarter l'eventualite d'un paludisme devant un resultat negatif. Malgre les difficultes que peut presenter leur pre- paration, les seuls antigenes de groupes se pretant au serodiagnostic des paludismes humains sont donc constitues par des parasites des singes. En matiere de paludisme humain, la certitude diagnostique ne peut en realite resulter que de tests effectues avec chacune des quatre especes plasmodiales parasites de l'homme. L'obtention de ces reactifs antigeniques se heurte encore a de nombreuses difficultes. On peut esperer que ces problemes techniques seront simpli- fies par l'emploi de melanges d'antigenes sp&cifiques comme l'ont recemment propos6 Sulzer et al.1 et peut-8tre par la possibilite de conserver ces antigenes sous forme lyophilisee (Ambroise-Thomas et al., 1972). 1 Sulzer, A. J., Turner, A. & Wilson, M. (1971). A pre- liminary report on the preparation and trial of multi-species antigen on human malarias for use in the indirect fluorescent antibody test. Document non publie WHO/MAL/71.749. REMERCIEMENTS Nous remercions bien vivement: le Professeur Benazet, des Laboratoires Rhone-Poulenc de Vitry-sur-Seine, qui a bien voulu nous fournir une souche de P. cynomolgi bastianellii et la souche Institut Pasteur de Paris de P. gallinaceum; le Dr Alister Voller, de Londres, 'a 1'ami- tie duquel nous devons les antigenes P. falciparum et P. malariae utilises pour les tests realises en France; le Dr A. Kielmann et le Dr G. Sarasin, de Bale, qui nous ont fait l'amiti6 de nous donner leur souche de P. galli- naceum et de nous indiquer regulierement les progres de leurs propres travaux. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Ambroise-Thomas, P. (1969) Etude sero-immunologique de dix parasitoses par les techniques d'immunofluores- cence (These Doctorat es sciences, Lyon) Ambroise-Thomas, P., Duprat, J., Goullier, A. & Kien Truong, T. (1972) Bull. Org. mond. Sante6, 46, 558 Ambroise-Thomas, P., Kien Truong, T., Saliou, P. & Mojon, M. (1969) Rev. Inst. Pasteur Lyon, 2, 275 Ingram, R. L., Otken, L. B. & Jamper, J. R. (1961) Proc. Soc. exp. Biol. Med., 106, 52 Kielmann, A., Sarasin, G., Bernhard, A. & Weiss, N. (1970a) Bull. Org. mond. Sante, 43, 617 Kielmann, A. & Weiss, N. (1968a) Trans. roy. Soc. trop. Med. Hyg., 62, 458 Kielmann, A. & Weiss, N. (1968b) Acta tropica, 25, 185 Kielmann, A., Weiss, N. & Sarasin, G. (1970b) Bull. Org. mond. Sante, 43, 612 Lippincott, S. W. et al. (1945) J. dlin. Invest., 24, 362 Sulzer, A. J. & Wilson, M. (1967) J. Parasit., 53, 1110 Todorovic, R., Ferris, D. & Ristic, M. (1967) Ann. trop. Med. Parasit., 61, 117 Voller, A. (1962) Bull. Org. mond. Sante, 27, 283