Antigènes excrétés-sécrétés par Plasmodium falciparum en cultures in vitro : étude comparée avec les antigènes somatiques et les antigènes figurés

Bulletin de l'Organisation mondiale de la Sante, 60 (5): 761-766 (1982) Antigenes excretes-secretes par Plasmodiumfalciparum en cultures in vitro. Etude comparee avec les antigenes somatiques et les antigenes figures* J. THELU,1 P. AMBROISE-THOMAS,2 M. CONTAT,3 & P. KuPKA3 Au cours de sa multiplication in vitro, Plasmodium falciparum libere dans le milieu de culture des antigenes excretes-secre'tes. Presents en quantites infinitesimales, ces antigenes sont en grande partie masques par les differents constituants du milieu, notamment ceux quisont apportespar leserum humain. Une techniquefinalement assez simplepermet de les isoler par chromatographie e'changeuse d'ions. Il a et ainsi possible de caracte'riser, parmi les tres nombreusesfractions obtenues, un ensemble defractions (antigene E) dont l'activite' parait d'autant plus importante que sa concentration prot6inique estfaible. Cet antigeneE a 6te' compare' en immuno-enzymologie avec des antigenes somatiques extraits par ultra- sonication de P. falciparum isoles. Parallelement, une autre comparaison a e'te' effectue'e en immunofluorescence indirecte (IFI) sur des etalements d'hematies parasitees par des schi- zontes de P. falciparum (antigenes figures) provenant egalement de cultures in vitro. L'utilisation des antigenes somatiques et de l'antigene E en ELISA et en IFI a donne des resultats tres similaires avec 300 serums humains recueillis en zone d'endemie palustre. On a observe' une grande stabilit' a' la chaleur de l'antigene E, alors que les antigenes somatiques sont partiellement thermolabiles. Au cours des differents stades intraerythrocytaires de son developpement, Plasmodium falciparum pro- duit plusieurs types d'antigenes. Ces antig6nes ont W etudies i partir de differents materiels de base: serums de malades (12, IS), serums de singes Aotus (14) ou de chimpanzes experimentalement infestes (9), hematies provenant de placentas humains forte- ment parasites (13). Par la suite, la culture in vitro de P. falciparum (11) a facilit6 l'obtention de materiel antigenique abondant (4, 5, 7, 8, 10). Cependant, il faut souligner que peu d'etudes (4) ont &6 rapportees sur les antigenes liberes dans le milieu de culture par les parasites. Pourtant, ces antigenes etaient suscep- tibles de presenter des similitudes avec les produits re- trouves dans le serum de malades atteints de palu- disme, ceci pouvant deboucher sur des applications pratiques dans la realisation de tests de sero- diagnostic. L'obtention de ces exoantig6nes ou antigenes * Cette etude a et realisee sous les auspices du Programme d'action antipaludique de l'Organisation mondiale de la Sante et du Programme special PNUD/Banque mondiale/OMS de recherche et de formation concernant les maladies tropicales. ' Attache scientifique, Laboratoire de parasitologie et pathologie exotique, Faculte de Medecine de Grenoble, France. 2 Professeur de parasitologie, Faculte de Medecine de Grenoble, La Tronche 38700, France. Les demandes de tires a part doivent etre envoyees a cette adresse. 3Laboratoire de parasitologie et pathologie exotique, Faculte de Medecine de Grenoble, France. excret's-secretes est malaisee A cause de la faible concentration de ces produits dans un milieu tres riche en differents constituants (en particulier en serum humain). Pour remedier a cette difficulte, nous avons mis en ceuvre une methode qui se prete au traitement de volumes importants: la chromatogra- phie echangeuse d'ions. Par le test immunoenzyma- tique ELISA, nous avons ensuite mesure face a de nombreux serums l'activite et la specificite des anti- genes ainsi obtenus. Ces resultats ont ete compares avec ceux d'une etude analogue conduite avec des antigenes somatiques et, en immunofluorescence in- directe, avec des antigenes figures. MATtRIEL ET MITHODE Culture La souche de P. falciparum (SGE lV) est cultivee in vitro a Grenoble depuis plus de 3 ans suivant la tech- nique de Trager et Jensen (candle jar) sur des hema- ties humaines A+. Le milieu RPMI 1640 est complete par 100 ml de serum human A+ par litre, l'hemato- crite est abaissee a 0,08 et le developpement est syn- chronise par action du sorbitol selon la technique de Lambros et Vanderberg (6). a Souche amicalement fournie par le Dr L. H. Perrin de l'H8pital cantonal de Geneve. 4226 -761- 762 J. THELU ET AL. AntigMes somatiques Ils sont prepares selon une technique proche de celle decrite par Williams (13). Les hematies para- sitees par des schizontes de P. falciparum sont lavees dans du serum physiologique, puis lysees par une solution de saponine a 10 g/litre (20 min au bain- marie a 37 °C). Les parasites recueillis par centrifu- gation (8 min a 10 000 g a 4 °C) sont laves a 4 reprises dans du serum physiologique. Les schizontes sont en- suite ultrasones (frequence 20 KHz, amplitude 6 um pic a pic) 15 fois 1 min avec des intervalles de 1 min. Apres elimination des debris membranaires par cen- trifugation (10 min a 10 00 g a 4 °C), le surnageant clair est recueilli. I1 contient par ml 0,65 mg de pro- teines dosees par la methode de Bradford (3). Antigenes excr&t6s-sd6crettes Le milieu de culture est collecte quotidiennement, puis centrifuge, et le surnageant est conserve dans de l'azote liquide. Quand un volume suffisant (500 ml au moins) est reuni, ce milieu est decongele, concentre 10 fois sur un appareil A fibres creuses (Amicon, fibres HP 10, limite d'exclusion: molecules de masse mole- culaire relative superieure A 10 000), puis soumis A une filtration sterilisante (0,45 gm). La fraction concentree est precipitee par le sulfate d'ammonium A 330 g/litre afin d'eliminer les immunoglobulines humaines, puis elle est centrifugee et dialysee 12 heures. Le milieu est alors fractionne par chromato- graphie echangeuse d'ions A I'aide d'un gel de QAE Sephadex A 50.b La colonne a un volume initial de 500 ml (diametre interne 6 cm, hauteur 18 cm). Le gel est sature, puis equilibre par du tampon Tris HCI (50 mmol/l, pH 7,6). Le depot de milieu concentre a un volume de 20 ml (proteines 55 mg/ml). L'elution (debit 90 ml/h) est effectuee par un gradient de force ionique de contre-ions (Cl- - NaCI de 0 A 0,5 mol/1) dans du tampon Tris HCI (50 mmol/l, pH 7,6). L'eluat est collecte par fractions de 14 ml, qui ont d'abord ete testees separement (126 fractions etu- diees). Par la suite, toutes les fractions presentant une activite antigenique ont e rassemblees (antigene E) et dialysees contre du tampon PBS (50 mmol/l, pH 7,2), afin d'eliminer l'exces de chlorure de sodium. L'antigene E est ensuite reparti en echantil- Ions de 2 ml et conserve sous forme congelee (- 70 °C) jusqu'A 1'emploi. S6rums 6tudi6s II s'agit de serums ou de microechantillons san- guins recueillis en zone d'endemie palustre et notam- ment lors d'une enquete effectuee en Tanzanie par le Dr E. Onori de i'OMS. b Pharmacia, Uppsala, Suede. - Concentration en proteines Densiteoptique en ELISA _'1, EAg:2: 221 10.~~~~~~~1 CL0) 0 0~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ C-) ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~00 *00 .0 .....** * @0100 *0 .0 00 @ 0 25 50 75 100 125 Num6ro de fraction WHO 82575 Fig. 1. Chromatographie sur gel QAE Sephadex A 50. ANTIGtNES EXCRETES-SECRETES PAR P. FALCIPARUM IN VITRO 763 1.0 ao. 0 2 5 10 15 30 Temps (min) Fig. 2. Thermosensibilit6 des antigbnes A 80 OC pendant des temps variables (0 antigbnes somatiques; * antigbnes exr6t6s-s6cr6t6s). Immunofluorescence indirecte Le test est realise suivant une methode decrite pre^ cedemment (1). Comme antigene on a utilis6 des etalements de sang humain parasite par des schi- zontes de P. falciparum (souche SGE 1) obtenus en cultures in vitro synchronisees. Les serums sont &tudi6s aux dilutions 1/20, 1/40 etc., et le conjugue marque a la fluoresceine,c apres titrage prealable, a ete employe A la dilution de 1/50. Test ELISA Le microtest ELISA est conduit selon la methode decrite en 1978 (2) avec des concentrations d'antigene et de conjugu6d determinees par titrage en damier. Le reperage du pic antigenique sur la sortie de colonne est effectue en ELISA face a un melange de serums humains tres positifs. Parmi les contr6les, on a notamment realise pour chacune des fractions dosees des reactions temoins face a differents serums humains negatifs et des <<blancs>> sans serums. RISULTATS La separation des constituants du milieu de culture par chromatographie sur gel QAE Sephadex permet d'obtenir de facon simple l'ensemble des fractions antigeniques principales (antigene E) (Fig. 1). La pre- sence de ce pic mis en evidence par le test ELISA a egalement ete confirme par electrosynerese (contre- ' Anticorps de mouton, anti-IgG humaines marquees A la fluores- ceine. Institut Pasteur, lot 16 74 51 1. d Serum de chevre anti-IgG humaines marquees A la peroxydase. Laboratoires Miles, lot S 808. Dilution optimale d'emploi: 1/ 1500. immunoelectrophorese) face au melange de serums humains positifs utilise pour les determinations en ELISA. Par ailleurs, nous avons evidemment verifi6 l'absence d'activite antigenique dans les extraits de milieu traites exactement dans les memes conditions que les cultures mais non parasites. La thermosensibilite de l'antigene E et celle des antigenes somatiques ont ete' tudiees par exposition A une temperature de 80 °C (bain-marie) pendant des temps variables (Fig. 2). On a ainsi observe une grande stabilite a la chaleur de l'antigene E, alors que les antigenes somatiques sont partiellement thermo- labiles. L'etude comparee de ces deux types d'antigene et des antigenes figures a ete realisee en ELISA et en immunofluorescence indirecte A partir de 300 serums humains preleves en zone d'endemie. Les resultats obtenus montrent qu'il existe une relation lineaire entre les densites optiques mesurees en ELISA et les titres en IFI (Fig. 3). Cette correlation est retrouvee * Antigines somatiques * Antigines s6crOtds-excretWs 1,50 01,25 co Ca) -i JWi T j0,75 0 0,50 0.25 0 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 Dilution de sirum (IFI) Fig. 3. Comparaison du titre d'anticorps anti-Plasmodium mesur6 en IFI et en ELISA. Les segments verticaux repr6- sentent la valeur de l'6cart type. Les nombres d'echantil- Ions sur lesquels les moyennes ont W calcul6es etaient pour les sept dilutions (de la gauche a la droite) de 103, 36, 43, 47, 25, 27 et 18. (-antigbnes somatiques; *antigenes excr4t4s-s4cr6t6s). J. THELU ET AL. aussi bien pour les antigenes somatiques que pour est negative ou tres faiblement positive. Apres l'age l'antigene E. de 5 ans, les titres d'anticorps augmentent et se stabi- En representant cette fois les resultats par rapport a lisent environ apres la trentieme annee. l'age des sujets examines (Fig. 4), on met egalement en evidence la similitude des antigenes etudies. En DISCUSSION particulier, la serologie des enfants de moins de 5 ans Les gels echangeurs d'ions ayant de grandes capaci- tes d'adsorption permettent de traiter des volumes importants de milieux de culture a fortes concentra- N = 21 50 49 51 55 40 34 tions proteiniques. Cette capacite peut etre amelioree en effectuant une separation preliminaire en batch 1,2 (e a avec le meme type de gel. D'autre part, la tres faiblequantite de proteines correspondant aux pics anti- geniques (antigene E) met l'accent sur l'efficacite de co,1 la methode. Cette technique de mise en ceuvre rapide(l'etape de precipitation des immunoglobulines _ [ <seriques peut etre supprimee sans inconvenient) peut 0,8 / eventuellement etre suivie d'une chromatographie d'affinite pour parfaire la purification. .H J f Cependant, la separation obtenue sur le gel QAE 0,6 1 r Sephadex permet deja d'utiliser l'antigene E pour le serodiagnostic en ELISA. Le rendement obtenu est important puisque, a partir de 200 ml de milieu de0,4 culture, il est possible de preparer assez de fractions d'antigene E pour sensibiliser environ 90 plaques de _________________________________________ microtitration, c'est-a-dire-compte tenu des reac- <11-4 5-9 10-19 20-29 3044 >45 tions temoins pratiquees dans chaque plaque-pour Age (ann6es) etudier plus de 8000 serums. Utilise lors d'une enqute epidemiologique, l'antigene ainsi prepare a fourni des resultats tout a fait comparables a ceux qui N= 21 50 49 51 55 40 34 ont ete obtenus avec les antigenes somatiques et avec les antigenes figures. Cette similitude permet, d'une 1,0 part, de confirmer l'interet de l'antigene E et, d'autre E ' b part, elle impose de comparer ses caracteristiques physico-chimiques avec celles des autres antigenes. ll 0,8Les resultats preliminaires de cette comparaison 0,8 (thermosensibilite) tendent a montrer que l'antigene -J ~ _ Z Zl somatique (brut) est en fait la somme d'un consti-wC T tuant thermolabile et de fractions thermostables, = 0,6 alors que l'antigene E est totalement thermostable. Ces antigenes pourraient donc correspondre aux anti- genes L et S observes par Wilson (16) dans des serums In 8 r._ de malades.C3 0,4 _L'etude analytique de l'antigene E (nature, masse moleculaire relative, point isoelectrique, proprietes immunologiques) de P. falciparum est actuellement Il l l l a en cours. Dans un premier temps, nous n'avons114 5A91019 20-29 3044 245 etudie que l'antigene E produit par l'ensemble des stades evolutifs de P. falciparum, tels qu'ils sont Fig. 4. Mesure de la corr6lation entre le taux d'anticorps obtenus dans des cultures asynchrones de 72 h dont le anti-Plasmodium et I'age des individus. Le taux d'anti- milieu est quotidiennement renouvele. Ces antigenes corps est mesur6 en ELISA en utilisant a) I'antigbne ontie etr certaidenementdesnorigin.esd niverses. somatique et b) I'antig&ne m6tabolique. Les segments des origines diverses. Ils verticaux repr6sentent la valeur de 1'6cart type. Les peuvent en effet correspondre aussi bien a des nombres d'6chantillons sur lesquels les moyennes ont produits excretes par les parasites (antigenes meta- et6 calculees 6taient pour les sept groupes d'age (de la boliques) qu'a des substances liberees par les gauche a la droite) de 21, 50, 49, 51, 55, 40 et 34. Plasmodium en cours de destruction (antigenes cata- 764 ANTIGENES EXCRtTES-StCRtTtS PAR P. FALCIPARUM IN VITRO 765 boliques), a des substances liberees au moment de la lyse des hematies parasitees, ou enfin a des coat anti- gens laisses dans le milieu de culture par des mero- zoites lors de leur penetration dans les hematies. Nous tentons actuellement de preciser l'importance relative, la nature et l'activite antigenique de chacun de ces antigenes en utilisant des cultures synchroni- sees de P. falciparum et en recueillant les milieux apres des phases bien precises du developpement parasitaire. SUMMARY EXCRETORY-SECRETORY ANTIGENS OF PLASMODIUM FALCIPARUM PRODUCED IN IN VITRO CULTURE: A COMPARATIVE STUDY WITH SOMATIC AND WHOLE PARASITE ANTIGENS During its multiplication in vitro, Plasmodiumfalciparum releases excretory-secretory antigens into the culture medium. Since these antigens are present in minute quantities they are for the most part masked by the different components of the medium, in particular those of the human serum. The excretory-secretory antigens have been isolated by a simple technique using ion-exchange chroma- tography, and in this way it was possible to characterize a series of fractions ("antigen E"), among the many fractions obtained, whose antigenic activity was higher and whose protein concentration was relatively low. This antigen E was compared, using immuno-enzymology, to somatic antigens extracted from isolated P. falciparum by sonication. It was also compared, using the indirect immunofluorescence assay (IFA), with a whole parasite antigen preparation. In the two tests, the somatic antigen and antigen E gave very similar results with 300 human sera collected in an endemic area. Antigen E was stable on exposure to a temperature of 80 °C for up to 30 min. REFERENCES 1. AMBROISE-THOMAS, P. Etude sero-immunologique de dix parasitoses par les techniques d'immuno-fluores- cence. These Sciences, Lyon, 1969. 2. AMBROISE-THOMAS, P. & DESGEORGES, P. T. Diagnostic immuno-enzymologique (ELISA) des mala- dies parasitaires par une micromethode modifiee. 1. Modalites techniques. Bulletin de l'Organisation mondiale de la Sante, 56: 609-613 (1978). 3. BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein uti- lizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry, 72: 248-254 (1976). 4. JEPSEN, S. & ANDERSEN, B. J. Immunoabsorbent iso- lation of antigens from the culture medium of in vitro cultivated Plasmodiumfalciparum. Actapathologica et microbiologica Scandinavica, Sect. C, 89: 99-103 (1981). 5. KILEJIAN, A. Stage-specific proteins and glycoproteins of Plasmodium fakciparum : identification of antigens unique to schizonts and merozoites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 77: 3695-3699 (1980). 6. LAMBROS, C. & VANDERBERG, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. Journal ofparasitology, 65: 418-420 (1979). 7. MACKEY, L. ET AL. Diagnosis of Plasmodium fakci- parum infection using a solid-phase radioimmunoassay for the detection of malaria antigens. Bulletin de l'Organisation mondiale de la Sante, 58: 439-444 (1981). 8. PERRIN, L. H. ET AL. Characterization of antigens from erythrocytic stages of Plasmodium falciparum reacting with human immune sera. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 75: 163-165 (1981). 9. SADUN, E. H. & GORE, R. W. Mass diagnostic test using Plasmodium falciparum and Chimpanzee ery- throcyte lysate. Experimentalparasitology. 23: 277-285 (1968). 10. SIDDIQUI, W. A. ET AL. In vitro production and partial purification of Plasmodium falciparum antigen. Bulle- tin de l'Organisation mondiale de la Sante, 57 (Suppl. 1): 75-82 (1979). 11. TRAGER, W. & JENSEN, J. B. Human malaria parasites in continuous culture. Science, 193: 673-675 (1976). 12. WILLIAMS, A. I. 0. & HOUBA, V. Soluble serum anti- gens of P. falciparum in Nigerians. 1. Local incidence of malarial soluble serum antigens and antibodies. African journal of medical sciences, 3: 295-307 (1972). 13. WILLIAMS, A. I. 0. Preparation and use of malarial placenta antigen for immunodiffusion studies in a Nigerian population. Transactions ofthe Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 67: 621-630 (1973). 14. WILSON, R. J. M. & VOLLER, A. Malarial S-antigens from man and owl monkey infected with Plasmodium fakciparum. Parasitology, 61: 461-464 (1970). 766 J. THELU ET AL. 15. WILSON, R. J. M. ET AL. The stability and fractionation of malarial antigens from the blood of Africans in- fected with Plasmodium falciparum. International journal for parasitology, 3: 511-520 (1973). 16. WILSON, R. J. M. The production of antigens by Plas- modium falciparum in vitro. Internationaljournalfor parasitology. 4: 537-547 (1974).