VERSION 1 – EFFECTIVE DATE: 01/01/2016 EBOLA VIRUS INACTIVATION DURING STAINING OF BLOOD FILMS WITH GIEMSA STAIN MALARIA MICROSCOPY STANDARD OPERATING PROCEDURE – MM-SOP-07B 1. PURPOSE AND SCOPE To describe the procedure for correct staining of malaria blood films with inactivation of haemorrhagic fever viruses (e.g. Ebola), in order to avoid work-acquired infections This procedure is to be modified only with the approval of the national coordinator for quality assurance of malaria microscopy. All procedures specified herein are mandatory for all malaria microscopists working in national reference laboratories, in hospital laboratories or in basic health laboratories in health facilities performing malaria microscopy. 2. BACKGROUND Laboratory personnel who handle blood specimens from patients who may have been exposed to Ebola virus should assume that the specimens are contaminated with Ebola virus and should follow all safety precautions recommended for handling such specimens. According to current knowledge, Ebola virus can survive for 48 h on a dried blood film. The modification of the Giemsa staining procedure described here allows safe handling of blood samples contaminated with Ebola virus and good-quality staining of malaria parasites. 3. SUPPLIES, MATERIALS AND EQUIPMENT • Giemsa stain (3% solution) (See MM-SOP-04: Preparation of Giemsa working solution); • 5%Triton X-100; • a small container for Giemsa working stain; • methanol, absolute, acetone-free; • staining jars; • a timer; • a plastic pipette; • a slide-drying rack, wooden; • protective latex gloves (powder-free), disposable; • a laboratory coat or gown; • safety glasses and • a class II biological safety cabinet, if available, or an isolation box. 4. SAFETY PRECAUTIONS 1. Use universal precautions. See MM-SOP 11: General safety procedures in the malaria microscopy laboratory. 2. Use appropriate personal protective equipment, including a laboratory coat, gloves and eye protection. See list of references for more details. 3. Do not collect finger-prick blood samples for malaria examination. Samples and specimens should be venous whole blood collected in EDTA-containing tubes. 4. Blood films should be prepared in the laboratory in a class II biological safety cabinet or isolation box. 2MM–SOP–07B: EBOLA VIRUS INACTIVATION DURING STAINING OF BLOOD FILMS WITH GIEMSA STAIN 5. Thick films and thin films must be prepared on separate slides. Avoid aerosol production during their preparation. 6. Allow films to dry completely before removing them from the biological safety cabinet. 7. Dispose of all contaminated materials in a pan to be autoclaved or in 10% sodium hypochlorite (bleach) for at least 5 min. 5. PROCEDURE FLOW CHART DESCRIPTION OF ACTIVITY 1. Prepare 5%Triton X-100 solution. 2. Prepare two jars of 3% working Giemsa stain, add 5%Triton X-100, and mix. Label ”thin films” and “thick films”. 3. Fix the thin film for 15 min in a jar with absolute methanol, and dry. Do not fix thick films. 4.1. Pour 40–50 mL of Giemsa stain in buffered water into a third staining jar, add two drops of Triton X-100, and mix. 4.2. Place slides with fixed thin smears and unfixed thick smears into the Giemsa stain jars with the corresponding labels ”thin” and “thick” for 45 min. 4.3. Remove each slide individually, and drain briefly on absorbent paper. 4.4. Rinse each thin smear by dipping it three or four times into the solution of Giemsa stain in buffered water in the third jar. 4.5. Place each thick smear slide into the buffered Giemsa stain for 5 min, dry upright in a rack, and examine at 100x. 4.6. Discard the remaining 3% Giemsa solution. 1. Prepare 5% Triton X-100 solution with: deionized water (warmed to 56 oC) = 95.0 mL Triton X-100 = 5.0 mL To dissolve the viscous Triton X-100 more easily, pre-warm the deionized water and slowly add the Triton X-100, swirling to mix. Do not shake. 2. Prepare two jars for 3% working Giemsa stain, and label one for thin films and the other for thick films. Add the amounts of 5% Triton X-100 indicated in the table below. Working Giemsa solution must be made freshly for each batch of smears. Reagent Thick blood film Thin blood film Giemsa buffered water (see MM SOP 03a and MM SOP 03b) 40.0 mL 40.0 mL 5% Triton X-100 2.0 mL Two drops from a 1-mL pipette Stock Giemsa stain (see MM SOP O2) 1.2 mL 1.2 mL Staining time 45-60 min 45–60 min Staining procedure for blood smears 3. Fix thin films for inactivation of Ebola virus for 15 min in a jar with absolute methanol. Allow to dry. Do not fix thick films. Allow them to dry thoroughly before staining. Protect them from dust, insects, heat and fumes of absolute methanol. 4. Staining procedure 4.1. Pour 40–50 mL of water buffered to pH 7.2 into a third staining jar. Add two drops of Triton X-100, and mix. Use this solution for rinsing thin and thick films. 4.2. Place slides with fixed thin smears and with unfixed thick smears into the staining jars with the corresponding label, ”thin films” and “thick films”, and set the timer to 45 min. 4.3. At the end of the staining time, remove each slide individually, and drain briefly on absorbent paper. 4.4. Rinse each thin smear by dipping it three or four times in the buff- ered water in the third jar. 4.5. Place each thick film slide into the buffered water for 5 min. 4.6. Allow the smears to dry upright in a rack. After drying, the stained smears are ready to be examined; see MM-SOP 08: Microscopy examination of thick and thin blood films for identification of malar- ia parasites. 4.7. Discard the remaining unused 3% Giemsa solution. See MM-SOP 13: Management of wastes generated from malaria diagnostic tests. 3MM–SOP–07B: EBOLA VIRUS INACTIVATION DURING STAINING OF BLOOD FILMS WITH GIEMSA STAIN 6. PROCEDURE NOTES Thin and thick blood films should be stained separately, because different amounts of the reagent 5% Triton X-100 are used. Exposure to the high concentrations of Triton X-100 indicated above for 45 min is essential to inactivate Ebola virus. Thin smears must be exposed to absolute methanol for at least 15 min to inactivate Ebola virus. 7. RELATED SOPs MM-SOP 3a: Preparation of water buffered to pH 7.2 MM-SOP 3b: Preparation of water buffered to pH 7.2 with buffer tablets MM-SOP 04: Preparation of Giemsa working solution MM-SOP 08: Microscopy examination of thick and thin blood films for identification of malaria parasites MM-SOP-11: General safety procedures in the malaria microscopy laboratory MM-SOP 13: Management of wastes generated from malaria diagnostic tests 8. REFERENCES Centers for Disease Control and Prevention. Guidance for malaria diagnosis in patients suspected of Ebola infection in the United States. Atlanta. Georgia; 2014. WHO. Infection prevention and control (IPC) guidance summary. Geneva; 2014. WHO. Personal protective equipment in the context of filovirus disease outbreak response. Geneva; 2014. 9. DOCUMENT HISTORY Date (mmm/yyyy) Version Comments Responsible person (First name, last name) January 2016 1 Reviewed and finalized by experts, edited and formatted Glenda Gonzales, Technical Officer, WPRO WHO/HTM/GMP/MM/SOP/2016.07b © World Health Organization 2016. All rights reserved.
الإصدارة 1 - تاريخ بدء النفاذ: 1 كانون الثاني/ يناير 6102 تعطيل فيروس الإيبولا خلال صبغ شريحة دم بصبغة الجيمسا لفحص الملاريا الإجراءات التشغيلية المعيارية للفحص المجهري للملاريا - B70-POS-MM الغرض والنطاق. وصف إجراءات الصبــغ الصحيح لشــريحة دم لفحــص الملاريا مع تعطيل فيروســات الحمــى النزفية (على ســبيل المثــال، الإيبولا)، لتجنــب العدوى المكتســبة من العمل. يحظر إجــراء أي تعديــل في هــذه الإجــراءات دون موافقة المنســق الوطنــي المعنــي بضمان جــودة الفحص المجهــري لتشــخيص الملاريــا. ينبغي على كل من يجــري الفحــص المجهري لتشــخيص الملاريــا الالتــزام بجميــع الإجــراءات الإلزامية المذكــورة بهــذه الوثيقة، ســواء مــن العاملــن بالمختبرات المرجعيــة الوطنيــة أو مختبــرات المستشــفيات أو مختبرات الصحــة العموميــة بالمرافــق الصحية التي تجــري الفحــص المجهري لتشــخيص الملاريا. المعلومات الأساسية. يجب أن يعتبــر العاملــون في المختبرات الذيــن يتعاملون مع عينــات دم مرضى تعرضــوا لفيروس الإيبــولا أن العينــات ملوثة بفيــروس الإيبولا ويجب اتبــاع جميع احتياطات الســلامة الموصــى بها للتعامــل مع مثل هــذه العينات. وفقــا ًللمعلومــات المتوافرة حالًيــا، يمكن لفيــروس الإيبولا البقــاء على قيــد الحياة لمدة 84 ســاعة في شــريحة دم مجففــة. ويوضح تعديــل إجراءات الصبغ بالجيمســا الموصوف هنــا كيفية التــداول الآمن لعينــات الدم الملــوث بفيروس الإيبــولا، بحيث يتــم الصبغ بجــودة عالية لفحص نــوع الملاريا. اللوازم والمواد والمعدات. محلول صبغ الجيمســا (تركيــز ٪3) (انظر وثيقــة الإجــراءات التشــغيلية المعيارية للفحــص المجهري للملاريــا 40 لمعرفــة طريقة تحضير المحلول)؛ محلول تريتون 001-X تركيز ٪5 حاوية صغيرة لمحلول اللتشغيل للصبغ بالجيمسا؛ الميثانول المركز، خال من الأسيتون؛ َمْرَطبان صبغ؛ جهاز توقيت؛ ِمَ ّص من البلاستك؛ رفرف تجفيف الشريحة، من الخشب؛ قفازات لاتكس واقية خالية من البودرة وتستخدم لمرة واحدة؛ معطف أو ِسْربال خاص بالمختبر؛ نظارات السلامة؛ خزانة سلامة بيولوجية من الدرجة الثانية، إن وجدت، أو صندوق عزل. احِتياطات الَسَلاَمة. يجب الالتــزام بتنفيــذ الاحتياطــات العالميــة؛ انظــر انظر وثيقــة الإجــراءات التشــغيلية المعياريــة للفحــص المجهــري للملاريــا جراءات . الســلامة العامــة في الفحــص المجهــري المختبــري للملاريا اســتخدام معدات الحماية الشــخصية المناســبة مثل معطف المختبر والُقفَّ ــازات المَطَّ اِطيَّة، ونظارات الســلامة. ولمزيد مــن التفاصيل انظر . قائمة المراجع. لا تقــم بجمــع عينات الــدم لفحــص الملاريــا بوخز الإصبــع. يجــب أن يتم جمــع عينــات ومســحات الــدم بالكامل مــن الوريــد في حاويات . تحتوي علــى حمــض ثنائي أمــن إيثيلــن رباعــي حمض الأســيتيك. ويجب تحضير شرائح الدم في المختبر في خزانة سلامة بيولوجية من الدرجة الثانية أو صندوق عزل.. 4 يجب أن يتم تحضير الشرائح السميكة والرقيقة على شرائح منفصلة. تجنب إنتاج الَضبُوب أثناء تحضيرها.. B70-POS-MM: تعطيل فيروس الإيبولا خلال تلوين شريحة دم بصبغة الجيمسا لفحص الملاريا 2 دع الشرائح حتى تجف تماما ًقبل إزالتها من خزانة السلامة البيولوجية.. تخلص من جميع المواد الملوثة في حاوية إلى أن يتم تعقيمها أو تبيضها بمحلول هيبوكلوريت الصوديوم (٪01) لمدة دقائق على الأقل.. الإجراءات. وصف النشاطالرسم التخطيطي 4. . ضع الشرائح بحيث تكون المسحات الرقيقة مثبتة والمسحات السميكة غير مثبتة في مرطبي الصبغ بتوسيم متماثل «للشرائح الرقيقة» و«الشرائح السميكة» لمدة 4 دقيقة. . قم بإعداد اثنن مرطبان من محلول الصبغ بالجيمسا بتركيز ٪3، ضع كمية من محلول التريتون 001-X بتركيز ٪5 وقم بمزجه. وقم بتوسيم الشرائح الرقيقة والشرائح السميكة. 4. . قم بإزالة كل شريحة على حدة، وقم بتجفيفها لفترة وجيزة باستخدام َوَرق ماّص. . قم بتثبيت شرائح الدم الرقيقة لمدة دقيقة في مرطبي ميثانول مركز. ودعها حتى تجف. ولا تقم بتثبيت الشرائح السميكة. 4. 4. قم بشطف كل شريحة رقيقة من خلال غمسها - 4 مرات في محلول الجيمسا والماء متعادل الحموضة في المرطب الثالث. 4. . ضع كل شريحة سميكة في محلول الجيمسا والماء متعادل الحموضة لمدة دقائق، ثم دعها تجف على رفرف التجفيف وجهها لأعلى. ثم قم بالفحص على x001 4. . قم بسكب 04 - 0 ملم من الماء متعادل الحموضة في مرطب صبغ ثالث، وضع قطرتن من تريتون 001-X وقم بمزج الخليط. 4 . . تخلص من باقي محلول الجيمسا بتركيز ٪3. . قم بتحضير محلول تريتون 001-X تركيز ٪5 قم بتحضير محلول تريتون 001-X تركيز ٪5 باستخدام:. 9 ملم ماء منزوع الأيونات (يتم تسخينه حتى درجة حرارة سيليزية)، ملم محلول تريتون 001-X. لتحــل لزوجة تريتــون 001-X بصورة أكثر ســهولة، قبل تســخن الماء منــزوع الأيونات قــم بإضافة تريتــون 001-X وببطء، وقــم بتقليب المزيــج. ولا تقم برجه. قم بإعــداد مرطبــن اثنن مــن محلــول الصبغ بالجيمســا بتركيــز ٪3، وخصــص مرطبا ًللشــرائح . الرقيقة والآخر للشــرائح الســميكة. ضــع كمية مــن محلــول التريتــون 001-X بتركيــز ٪5 كما هو مبــن في الجدول التالــي. ويجــب أن يتم تحضيــر محلول الصبــغ بالجيمســا قبل بــدء الصبغ لكل مجموعة مباشــرة. شريحة الدم الرقيقةشريحة الدم السميكةالكاِشف الجيمسا محضرة بالماء متعادل الحموضة (انظر وثيقة الإجراءات التشغيلية المعيارية للفحص المجهري للملاريا b3 , A3) 04 ملم04 ملم قطرتن من مص ملممحلول تريتون 001-X تركيز ٪5 سعة ملم محلول صبغة الجيمسا (انظر وثيقة وثيقة الإجراءات التشغيلية المعيارية للفحص المجهري للملاريا b) . ملم . ملم 4 - 0 دقيقة 4 - 0 دقيقةالوقت المستغرق في الصبغ إجراء الصبغ لمسحات الدم قــم بتثبيــت شــرائح الــدم الرقيقــة لتعطيــل فيــروس الإيبــولا لمــدة دقيقــة في مرطبــي ميثانــول . مركــز. ودعهــا حتــى تجف. لا تقــم بتثبيــت الشــرائح الســميكة، ودعها تجف جيــدا ًقبل الصبــغ، وتجنب أن تتعــرض للغبار أو الحشــرات أو الحرارة أو أبخرة الميثانــول المركز. إجراء الصبغ. 4 قــم بســكب 04 - 0 ملــم مــن المــاء الــدارئ بدرجــة حموضــة . في مرطــب صبــغ ثالــث. ضع 4. قطرتــن مــن تريتــون 001-X وقــم بمــزج الخليــط. واســتخدم هــذا المحلول في شــطف الشــرائح الرقيقــة والســميكة. ضع الشــرائح الرقيقة المثبتة والشــرائح الســميكة غيــر المثبتة في مرطبــي الصبغ بتوســيم متماثل 4. «للشــرائح الرقيقة» و«الشــرائح الســميكة». وقم بضبط جهــاز التوقيت علــى 4 دقيقة. في نهايــة الوقت المحــدد للصبــغ، قــم بإزالة كل شــريحة علــى حــدة، وقــم بتجفيفها لفتــرة وجيزة 4. باســتخدام َوَرق ماّص. قم بشــطف كل شــريحة رقيقــة مــن خــلال غمســها - 4 مــرات في المــاء متعــادل الحموضة في 4.4 المرطــب الثالث. ضع كل شريحة سميكة في الماء المتعادل الحموضة لمدة دقائق. 4. دع كل الشــرائح حتــى تجف على رفــرف التجفيــف وجهها لأعلــى. وبعــد أن تجف تكون الشــرائح 4. الملونــة جاهــزة للفحــص؛ انظــر وثيقــة الفحــص المجهــري للملاريا، وثيقــة الإجــراءات التشــغيلية المعياريــة للفحــص المجهــري للملاريــا 8: الفحــص المجهــري لشــرائح الــدم الســميكة والرقيقــة لتحديــد نــوع الملاريا تخلص من باقــي محلول الجيمســا بتركيز ٪3 غير المســتخدم. انظــر وثيقة الإجراءات التشــغيلية 4. المعيارية للفحص المجهــري للملاريــا : إدارة النفايات الناتجــة عن اختبارات تشــخيص الملاريا. B70-POS-MM: تعطيل فيروس الإيبولا خلال تلوين شريحة دم بصبغة الجيمسا لفحص الملاريا 3 ملاحظات تتعلق بالإجراءات. يجب أن يتــم صبغ شــرائح الــدم الرقيقة والســميكة بشــكل منفصــل، لأنه يتــم اســتخدام كميات مختلفــة مــن الكاشــف تريتــون 001-X تركيز ٪5. كما يعــد التعــرض للتركيــزات العالية مــن تريتون 001-X المشــار إليهــا أعلاه لمــدة 4 دقيقة أمــرا ًضروريــا ًلتعطيل فيــروس الإيبــولا. ويجب وضع الشــرائح الرقيقــة في الميثانــول المركز لمــدة دقيقة علــى الأقــل لتعطيل فيــروس الإيبولا. الإجراءات المعيارية للتشغيل ذات الصلة. A30-POS-MM تحضير ماء متعادل الحموضة عند درجة . b30-POS-MM تحضير ماء متعادل الحموضة عند درجة . باستخدام الأقراص المنظمة 40-POS-MM: تحضير المحلول المستخدم الخاص بصيغة الجيمسا 80-POS-MM الفحص المجهري لشرائح الدم السميكة والرقيقة لتحديد نوع الملاريا 11-POS-MM إجراءات السلامة العامة في الفحص المجهري المختبري للملاريا 31-POS-MM إدارة النفايات الناتجة عن اختبارات تشخيص الملاريا المراجع. noitcefni alobE fo detcepsus stneitap ni sisongaid airalam rof ecnadiuG.noitneverP dna lortnoC esaesiD rof sretneC .4102 ;aigroeG .atnaltA.setatS detinU eht ni .4102 ;aveneG .yrammus ecnadiug )CPI( lortnoc dna noitneverp noitcefnI.OHW .4102 ;aveneG .esnopser kaerbtuo esaesid surivolfi fo txetnoc eht ni tnempiuqe evitcetorp lanosreP.OHW تاريخ الوثيقة. التاريخ (الشهر/السنة) التعليقاتالإصدار الشخص المسؤول (الاسم الأول، الاسم الأخير) كانون الثاني/ يناير 0 قام الخبراء بمراجعتها وصياغتها في صورتها النهائية، التحرير والصياغة غليندا غونزاليس، الموظف التقني، مكتب منظمة الصحة العالمية الإقليمي لغرب المحيط الهادئ b70.6102/POS/MM/PMG/MTH/OHW © منظمة الصحة العالمية 6102. جميع الحقوق محفوظة.