L'emploi de sondes d'ADN pour le diagnostic du paludisme: Mémorandum d'une Réunion de l'OMS

Bulletin de l'Organisation mondiale de la Sante, 65 (1): 27-38 (1987) (D Organisation mondiale de la Sante 1987 L'emploi de sondes d'ADN pour le diagnostic du paludisme: Memorandum d'une Reunion de 1'OMS* Les progres recents accomplis dans la mise au point et l'application des sondes d'ADN pour le diagnostic du paludisme ont ete examines lors d'une consultation infor- melle de l'OMS, qui s'est tenue a Gen&ve en octobre 1985. Ces sondes sont basses sur le principe que tout organisme possede des sequences uniques d'ADN, qui le differencient d'autres organismes e'troitement apparentes. Plusieurs laboratoires ont reussi a isoler des sondes d'ADN sp&ifiques de Plasmodium falciparum. Leur caracteristique principale est qu'elles sont fortement repe6tees dans le genome de P. falciparum. En laboratoire leur sensibilitd va de 5-10 pg d I ng d'ADN, ce qui correspond d 102_104 plasmodies au stade annulaire par echantillon, et semble tout a fait comparable d celle d'un diagnostic micros- copique classique. Cette technique presente donc apparemment un grand interet ope'rationnel. Un test base' sur l'emploi du ge'nome entier de P. falciparum a e'galement Wte6 mis au point, et des etudes ont ete' re'cemment entreprises sur l'application diagnostique de sondes d'ARN et d'ADN spegcifiques des hdmatozoaires humains du paludisme. L'e'valuation sur le terrain, pour limite6e qu'elle soit, montre que ces sondes ont une sensibilite' tout a' fait comparable a celle de la microscopie traditionnelle. Toutefois, la necessite d'utiliser un traceur radioactif, le 32P, rend l'epreuve inutilisable si l'on ne dispose pas d'un laboratoire bien e'quipe. On s'efforce donc de simplifier l'epreuve et de mettre au point des me'thodes non radioactives de marquage des sondes. Le present article examine quelle serait l'application de ces techniques pour le diagnostic du paludisme dans le cadre des soins de sante' primaires. INTRODUCTION Depuis la decouverte des plasmodies par Laveran en 1881, le microscope a joue un role primordial dans le diagnostic du paludisme, surtout dans les cas ou l'identification de l'esp&ce en cause et ou l'estimation de la densite parasitaire constituent des criteres importants pour le choix du traitement A appliquer. L'apparition et l'extension de souches de P. falci- parum chloroquino- ou polypharmacoresistantes ont renforc6 l'importance du diagnostic microscopique, puisque les m6dicaments de remplacement sont onereux et que leur emploi A titre presomptif est A la fois inappropri6 et couteux. La pratique generale actuelle qui consiste A appliquer aux cas de paludisme un traitement presomptif au niveau peripherique du systeme de soins de sante primaires, puis A examiner les frottis sanguins au niveau du district, ou A un niveau plus eleve, avant d'instaurer un traitement curatif, * Le present Memorandum est base sur le rapport d'une consul- tation informelle de l'OMS, qui s'est tenue a Geneve du 2 au 4 octobre 1985. Les noms des participants figurent a la page 38. Les demandes de tires i part peuvent etre adress&es a Recherche et Renseignements Techniques, Programme d'Action antipaludique, Organisation mondiale de la Sante, 1211 Gen&ve 27, Suisse. L'original anglais de cet article a ete publik dans le Bulletin de l'Organisation mondiale de la Sante,.64 (5): 641-652 (1986). entraine un gaspillage de medicaments, le risque de provoquer une pharmacoresistance et, ce qui est probablement plus grave, un retard dangereux pour la vie des malades de l'application du traitement curatif. En dehors de son utilisation clinique, le diagnostic microscopique du paludisme joue egale- ment un role important dans les etudes epidemio- logiques. II est devenu l'outil indispensable de 1'etude de la dynamique de cette maladie et de l'evaluation des mesures de lutte antipaludique. Dans le paludisme, la microscopie est une epreuve diagnostique qui presente de nombreux avantages. Elle est sensible (par exemple, un bon observateur peut deceler une cellule parasitee sur 1 x 106 hema- ties), et specifique d'espece et de stade. Elle peut egalement fournir des informations sur la viabilite de n'importe quel parasite present dans le sang periphe- rique, connaissance qui peut s'averer utile lorsqu'on evalue la reponse au traitement. L'examen de frottis sanguins devient quantitatif si l'on compte le nombre de champs qui, a fort grossissement, contiennent un ou plusieurs parasites, ou si l'on determine le rapport de ces derniers aux leucocytes dans une goutte epaisse. La quantification devient tres precise, si l'on associe l'examen microscopique de frottis sanguins et une numeration erythrocytaire. Les inconvenients de la microscopie sont qu'elle 4747 -27- MEMORANDUM necessite un technicien qualifie et un microscope a fort grossissement bien entretenu, conditions qui font souvent defaut au niveau peripherique des soins de sante primaires. C'est egalement une methode lente, puisque l'examen de routine d'une goutte epaisse prend au moins 5 A 10 minutes, si l'on veut deceler de faibles parasitemies de faqon fiable. Dans les regions impaludees, les soins de sante primaires requierent des epreuves de diagnostic simples, rapides et sures, pouvant etre utilisees A tous les niveaux du systeme, en particulier sur le terrain lorsque le malade se trouve au poste sanitaire. Bien qu'on doive pouvoir poser un diagnostic microsco- pique dans ces conditions, cela se revele impossible dans la plupart des regions impaludees du monde, notamment en Afrique tropicale. II faut donc trouver d'autres methodes. Les techniques basees sur la detection d'antigenes ou les sondes d'acide desoxy- ribonucleique (ADN) pourraient constituer des approches interessantes. Le present Memorandum examine A quel stade en est la mise au point des sondes d'ADN et quelle serait leur application dans le diagnostic du paludisme. On trouvera des details sur les autres methodes possibles dans le rapport d'un groupe scientifique de l'OMS sur la biologie des parasites du paludisme (11). DIAGNOSTIC DU PALUDISME DANS LE CADRE DES SOINS DE SANTE PRIMAIRES Des moyens permettant le diagnostic sont neces- saires A trois niveaux des soins de sante primaires: laboratoires centraux bien equipes; - laboratoires peripheriques de reference; -installations de terrain adaptees aux soins de sante primaires. Le passage d'une strategie antipaludique d'eradi- cation A une strategie de lutte et de developpement d'activites de lutte integrees aux systemes nationaux de soins de sante primaires, ont fait que desormais on met l'accent sur le paludisme en tant que maladie. L'aspect curatif est donc devenu fondamental pour la lutte antipaludique, tout comme la lutte antivec- torielle l'avait et pour l'radication. Compte tenu des problemes de pharmacoresistance du paludisme a falciparum, de la situation economique difficile des pays touches et des chances limitees que l'on a de mettre au point de nouveaux antipaludiques, il faut faire un usage rationnel des medicaments dispo- nibles, et chaque malade devra recevoir un traitement efficace. Cela n'est possible que si l'on dispose des moyens permettant de faire aisement le diagnostic, d'evaluer la reponse au traitement, de suivre chaque cas et de controler la qualite du diagnostic microsco- pique de routine. L'equipement en microscopes necessaire au diagnostic individuel des cas existe dans les laboratoires centraux, et, en general, dans les labora- toires peripheriques, mais rarement sur le terrain. En principe, le materiel des laboratoires centraux sert egalement aux etudes epidemiologiques necessaires aux operations de lutte antipaludique comme les enquetes, la surveillance des foyers de paludisme et celle de la situation de la maladie. Toutefois, ces etudes impliquent l'examen d'un tres grand nombre de prelevements de sang, ce qui prend un temps consi- derable et pose des problemes logistiques importants. Des methodes diagnostiques automatisees auraient par consequent un impact capital sur les operations de lutte antipaludique a ce niveau. Dans la mesure ou les tests diagnostiques ont des fonctions differentes, ils devront avoir une specificite et une sensibilite qui repondent A l'objectif de l'etude et/ou au niveau auquel ils seront employes. Par exemple, alors qu'un test destine au diagnostic indi- viduel des cas dans des regions a immunite collective relativement faible devra etre tres sensible, cela importera peu dans les regions a transmission inten- sive du paludisme, comme l'Afrique tropicale. Dans ces regions, ou la majeure partie de la population peut presenter une faible parasitemie sans souffrir de la maladie, il sera plus approprie de disposer de tests ayant une sensibilite critique de 1000 A 10 000 plasmodies asexuees par microlitre de sang. Un tel test, semi-quantitatif, donnant une indication gros- siere du degre de parasitemie constituerait en fait un avantage. Le tableau 1 resume les caracteristiques requises des tests diagnostiques du paludisme, dans les deux types de situation, clinique et epidemio- logique. TECHNOLOGIE DE BASE DE L'UTILISATION DIAGNOSTIQUE DE SONDES D'ADN Principes ge'neraux des sondes d'ADN La mise au point et l'emploi des sondes d'ADN pour le diagnostic du paludisme sont bases sur le principe selon lequel tout organisme possede des sequences d'ADN uniques, qui le differencient des autres organismes etroitement apparentes; cela suppose que ces sequences soient identifiees et isolees. On y parvient, en general, en employant des techniques de recombinaison de l'ADN (ADNr), pour identifier A la fois les sondes potentielles et les sequences cibles, ce qui permet ensuite de produire des sondes d'ADN A usage diagnostique. Ces sequences cibles d'ADN peuvent etre constituees d'elements fortement repetes du genome parasitaire ou de genes connus pour coder pour une molecule particuliere, par exemple les genes codant pour 28 EMPLOI DE SONDES D'ADN POUR LE DIAGNOSTIC DU PALUDISME Tableau 1. Valeur relative, pour la clinique et l'6pid6miologie, des diverses caract6ristiques des tests diagnostiques du paludisme Caract6ristique Diagnostic clinique Etudes 6pid6miologiques Sensibilit6 Population immune + + + + + + Population non-immune + + + + Sp6cificit6 d'espbce + + t + + + + + Quantification de la densit6 parasitaire: Forte parasit6mie Population immune + + + + Population non-immune + Faible parasit6mie Population immune - + + + Population non-immune + + + R6sultats imm6diats + + + + + Possibilit6 d'analyser un grand nombre d'6chantillons + + + + + + Sp6cificit6 de stade + + + + + Emploi d'un isotope radioactif dans l'6preuve Non acceptable Acceptable 11 existe des techniques avec sondes d'ADN. I'acide ribonucleique ribosomique. A l'avenir, on pourra peut-etre mettre au point des sondes d'ADN capables de faire la distinction entre plasmodies pharmacoresistantes et pharmacosensibles. Une fois la sonde d'ADN identifiee et isolee, elle peut etre employee pour le diagnostic. La reaction sur laquelle repose ce test diagnostique est la dena- turation et la renaturation des brins d'ADN comple- mentaire. Dans toute sonde d'ADN ou sequence cible, les bases nucleotidiques sont disposees dans un ordre precis. L'ADN denature ne peut se renaturer que si les bases sont dans le meme ordre. Ainsi, deux chaines d'ADN, celle de la sequence cible et celle complementaire de la sonde, doivent avoir une sequence identique pour pouvoir se renaturer ou s'hybrider (fig. 1). La sonde d'ADN ne s'hybridera pas avec d'autres sequences d'ADN dont les nucleo- tides ne sont pas disposes dans le meme ordre. C'est ce principe qui confere A ces epreuves leur sp6cificite. Production d'une sonde marquee: methodes de marquage Pour pouvoir detecter la reaction d'hybridation, il faut marquer la sonde de maniere a la visualiser. A l'heure actuelle, la methode la plus courante consiste A employer un isotope radioactif revele par une plaque photographique. D'autres methodes de detec- tion, comme le marquage A la biotine, sont en cours d'etude. Les trois methodes suivantes sont possibles. a) Marquage direct des sequences d'ADN. Pour obtenir une sonde marquee, on coupe d'abord arti- ficiellement le fragment d'ADN A l'aide d'enzymes appropriees, puis on ajoute de l'ADN-polymerase I et des desoxyribonucleotides triphosphates que l'enzyme polymerise en une nouvelle chaine. Si l'un des triphosphates est marque, par exemple au 32p OU a la biotine, on obtient une sonde avec traceur reperable. Cette methode est appelee coupure- substitution. Les avantages de cette methode, associee A l'isole- ment de la sonde d'ADN dans un plasmide approprie, sont qu'elle est d'execution facile, qu'elle amplifie le signal du traceur et qu'elle peut etre utilisee pour un marquage radioactif ou a la biotine. Ses incon- venients sont que des hybridations non specifiques peuvent se produire en raison de la presence de sequences du plasmide et qu'il peut y avoir renatu- ration spontanee, ce qui reduit l'affinite de la sonde pour l'ADN cible. Le bacteriophage M1 3 peut egalement servir de vecteur pour la construction des sondes d'ADN. Ce phage est inhabituel puisque son ADN peut exister aussi a l'etat monocatenaire. I1 peut etre marque par synthese partielle d'une seconde chaine. Une autre possibilite serait de marquer la forme bicatenaire du M13 et de l'utiliser comme "sonde secondaire", ce qui eviterait d'avoir A marquer chaque sonde. L'avantage du M13 est qu'on peut obtenir une activite specifique elevee avec un marquage au 32P et qu'il est egalement possible de le marquer A la 29 MtMORANDUM 1. Pdevsrdussngpw pqo auddSgtsur(inm4stkiect6 --- 2. Lys bsOWNk*inctiisswrunejph.Sdenicrsdtisgs 3. Tanf r I'dwnlon as un flue -do ritrocekdoe £ rI'acwu appard demumnde 4. hteh pedat 10 mis. 10-_Wk. dm&du tunpon 5. Cha,_ dwe tm 6tu * 50C pendat 1 ws 6. A.o.r send. fA* n* -4tLaisse*Cafi dl%ybidsrls sonds ame 7 Lever 8. Co**vrvcuiwW pinque d.'_ *1r 9. D6vlpperenmn h* n en cam n*e~ ADN sipien +Sonde d' nec rADwii 7 7.6a -7L- a.. 0. j, I .. .. aI Fig. 1. M6thode utilis6e pour I'hybridation sur filtre des sondes d'ADN avec I'ADN de P. falciparum. 4 30 EMPLOI DE SONDES D'ADN POUR LE DIAGNOSTIC DU PALUDISME biotine. Comme l'ADN du M13 est monocatenaire, la competition entre la renaturation et l'hybridation avec l'ADN cible n'est plus un probleme. Par contre, un inconvenient de cette technique est qu'une hybridation non specifique avec l'ADN humain peut se produire, en raison de la presence de sequences du bacteriophage. b) CopiesARN de sdquences d'ADN clonees. Des copies ARN de sequences d'ADN precises peuvent etre obtenues grace a l'ARN-polymerase, dont la fonction dans la nature est de copier les genes pour les traduire en proteines. Le produit de l'ARN-poly- merase est une copie ARN de l'ADN, qui contient toujours la sequence de bases de l'ADN et qui peut s'hybrider avec elle. On peut incorporer un traceur dans la copie ARN en utilisant des ribonucleotides tri- phosphates radioactifs. Les tests bases sur cette approche sont egalement faciles a executer et le marquage de la sonde au 32p peut etre realise avec une activite specifique elevee, analogue a celle des sondes d'ADN produites dans le bactWriophage M13. Elles sont egalement monocate- naires et evitent par consequent toute competition entre la renaturation et I'ADN cible. De plus, ces sondes ne contiennent pas de sequence plasmidique et, comme les hybrides ARN-ADN sont plus stables que les hybrides ADN-ADN, on peut effectuer la reaction d'hybridation dans des conditions plus restrictives, reduisant ainsi les signaux de fond non specifiques. Des etudes preliminaires de l'application des sondes d'ARN au diagnostic du paludisme ont e entreprises (6). On a obtenu une sonde marquee au 32p par transcription in vitro, a l'aide d'ARN-poly- merase, du recombinant lineaire obtenu par clonage du fragment d'ADN Rep2 au site Hind III d'un plasmide vecteur pSP64. Comme on peut obtenir une activite specifique plus elev&e en prenant des sondes d'ARN radiomarquees, I'ARN SP6-RepHind s'est revele plus sensible que la sonde d'ADN Rep2 pour detecter l'ADN de P. falciparum, des parasitemies de 0,0001I% etant decelees dans 100 yA d'un culot d'hematies infectees (c'est-a-dire environ 1000 P. falciparum). En outre, les faibles signaux de fond parfois observes avec les sondes d'ADN etaient inexistants avec celle d'ARN. c) Autres m6thodes possibles. Bien qu'on ait sur- tout employe l'ADN comme molecule cible pour la mise au point de tests diagnostiques bases sur la technique d'hybridation, toute sequence unique du genome parasitaire pourrait servir de cible a une sonde d'hybridation. Toutefois, comme les sequences presentes dans une seule copie rendent l'epreuve peu sensible, il est souhaitable de choisir comme cible des sequences souvent repetees dans le genome. On peut employer de l'ARN plutot que de l'ADN parasitaire comme cible de l'hybridation, avec l'avantage que la transcription provoque une ampli- fication de la sequence, un choix interessant etant constitue par l'ARN ribosomique qui est present a plus d'un million de copies par cellule; l'inconvenient est que les genes d'ARN ribosomique sont les memes entre especes apparentees, ce qui peut rendre le test moins specifique. En outre, I'ARN est moins stable que l'ADN et l'epreuve necessiterait une mani- pulation plus delicate que pour les tests utilisant l'ADN comme cible. Le marquage par des traceurs non radioactifs comme la biotine n'a pas jusqu'A present tres bien reussi. II existe des genes clones de l'ADN de P. falciparum et il faudrait etudier la possibilite de les utiliser A des fins diagnostiques. Un autre avantage de ces sondes pour les ARN cibles est qu'elles devraient permettre, du moins en theorie, de faire la distinction entre les divers stades parasitaires, puisque differentes sequences d'ARN sont probablement exprimees a chaque stade du cycle evolutif du parasite. Synth&se chimique Plut6t que d'utiliser des sondes d'ADN clone issues de bacteries, on pourrait envisager la synthese chimique des oligonucleotides. Cette approche suppose connue la sequence des bases de l'ADN cible. On peut produire en peu de temps de grandes quantites de ces sondes "sur mesure" par synthese chimique d'oligonucleotides, basee sur la sequence de l'ADN de sondes specifiques. Toutefois, A l'heure actuelle, le marquage au 32P donne une sonde d'une faible activite specifique et le succes de l'hybridation depend de l'appariement correct des sequences de bases de la sonde chimique avec celles de l'ADN cible. Cela peut poser un probleme lorsqu'on a des sequences fortement repetees qui varient legerement a chaque repetition. Prise de sang pour analyse II faut disposer d'un volume de sang determine pour pouvoir comparer les prelevements et faciliter la quantification de l'epreuve. Dans ce but, la methode la plus commode consiste a prelever directement du sang, par piqure au doigt, dans un tube capillaire de volume connu. Une autre m6thode, moins satis- faisante, consiste a laisser le sang impregner un papier filtre prealablement marque d'une faqon telle qu'un prelevement couvrant une surface delimit&e ait un volume approximativement determine. Actuellement, les prelevements de sang destines A I'analyse par sondes d'ADN se font dans des tubes capillaires h6parin6s, apres quoi le sang (100 yd au plus) est verse dans un petit recipient. Cette methode 31 MEMORANDUM est facile A appliquer, relativement bon marche, et praticable pour autant qu'on dispose des moyens de traiter les prelevements; ceux-ci ne doivent toutefois pas etre trop nombreux, ce qui pourrait poser des problemes, ainsi d'ailleurs que leur transport sur de grandes distances vers un laboratoire central. I1 faudrait mettre au point une methode simplifiee, par exemple l'application directe du prelevement sur du papier nitrocellulosique, bien qu'il faille la aussi resoudre le probleme de la manipulation du papier sur le terrain. Desseches, ces prelevements pourraient etre facilement conserves ou envoy&s par la poste au laboratoire. Une variante de la collecte sur papier filtre serait la solution ideale. MISE AU POINT DE SONDES D'ADN POUR LE DIAGNOSTIC DU PALUDISME: SITUATION ACTUELLE Pour mettre au point des techniques de diagnostic a base d'ADN, il est indispensable d'identifier, pour chaque espece de plasmodies, des sondes specifiques ayant un degre satisfaisant de sensibilite. Ces sondes doivent pouvoir reconnaitre toutes les souches d'une espece donnee et pas seulement celles dont elles sont issues. En outre, elles ne doivent pas reagir avec I'ADN humain ou I'ADN d'autres microorganismes susceptibles d'etre presents dans les echantillons analyses. Des sondes d'ADN qui pourraient remplacer, pour le diagnostic, l'examen d'etalements de sang auraient plusieurs avantages, sous reserve que les difficultes techniques que pose l'application sur le terrain d'un test base sur ces principes soient surmont&es. Son avantage le plus net et le plus immediat est qu'il pourrait etre automatise, diminuant ainsi le temps necessaire pour chaque diagnostic. Ce serait particulierement utile dans les grandes enquetes sur les populations impaludees, qui peuvent necessiter l'examen de milliers de prelvements. Au stade actuel de leur mise au point, les tests bases sur des sondes d'ADN ont une sensibilite et une specificite qui ne le cedent en rien A celles obtenues en microscopie optique. Toutefois, le fait d'avoir A employer une sonde d'ADN A traceur radioactif interdit son emploi diagnostique A tous les niveaux des soins de sante, sauf A celui du laboratoire central bien equipe. D'autres methodes de marquage sont donc recherchees. Des sondes d'ADN d'une specificite prouvee A l'egard de P. falciparum ont e mises au point dans plusieurs laboratoires (2, 5, 7). Leur caracteristique principale est qu'elles sont fortement repetees dans le genome de P. falciparum. Leur sensibilite, qui va de 5-10 pg A 1 ng d'ADN, ce qui correspond a 102_104 plasmodies au stade annulaire pour un seul preleve- ment, parait tout A fait comparable A celle obtenue en microscopie classique. I1 semble donc que cette technique ait un int6r8t operationnel. Un test base sur l'emploi du genome complet de P. falciparum a egalement e mis au point (8) et recemment, des etudes sur l'application des sondes d'ARN pour le diagnostic du paludisme ont e entreprises. Si on leur appliquait des methodes d'hybridation- transfert et d'analyse chromosomique, les sondes d'ADN seraient peut-etre egalement capables de de- celer des differences A l'interieur d'une meme espece. Etudes en laboratoire Franzen et al. (5) ont isole des clones contenant des sequences d'ADN fortement repetees dans une banque genomique obtenue a partir de l'isolement de P. falciparum F32 provenant de la Republique-Unie de Tanzanie. On a choisi l'un des clones, le Rep2, pour le caracteriser par analyse de la sequence des nucleotides. Les resultats ont montre que le fragment insere de ce clone etait compose de repetitions imparfaites de 21 paires de bases disposees en tandem. On a estime que ces repetitions constituaient environ 1 7o du genome de P. falciparum, qui en com- prend 104 A 2 x i05 copies, selon l'estimation de la taille du genome utilisee pour le calcul. De plus, ces copies sont disposees en grappes et il ne semble pas qu'elles aient e transcrites dans des cultures de P. falciparum non synchrones (1). Cette sonde n'a pas presente de reactions croisees avec les plasmodies humaines des especes P. vivax, P. malariae et P. ovale ni avec les especes P. chabaudi et P. yoelii trouvees chez les rongeurs; il n'y a pas eu non plus de reaction croisee avec les protozoaires Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani et Entamoeba histo- lytica. Cette sonde d'ADN, apres coupure-substi- tution, etait capable de deceler 25 pg d'ADN purifie de P. falciparum et des taux de parasitemie de 0,001 %. On a obtenu ces resultats en marquant la sonde au 32P avec une activite specifique moderee. Barker et al. (2) ont effectue le criblage d'une banque genomique partielle de l'isolement gambien FCR-3 de P. falciparum et ils ont isole au moins 30 sequences fortement repetees. Tous les fragments clones s'hybridaient avec l'ADN de P. falciparum mais ne presentaient aucune reaction croisee avec l'ADN humain. La sequence la plus fortement re- petee, le clone pPF14, a e choisie pour des etudes complementaires et s'est revelee specifique de P. falciparum, puisqu'elle n'a pas reagi avec des ADN purifies de P. vivax, P. cynomolgi, P. galli- naceum ou P. lophurae, ni avec des cellules infectees par P. malariae ou P. ovale. Apres coupure-substi- tution sur le pPF14, on a pu deceler 5 pg d'ADN purifie de P. falciparum et une tres faible parasitemie 32 EMPLOI DE SONDES D'ADN POUR LE DIAGNOSTIC DU PALUDISME (200 plasmodies) dans les prelevements de sang. L'analyse quantitative a montre que le pPF14 etait repete entre 104 et 105 fois par genome, selon la taille estimee de ce dernier. II est present dans tout le genome sous forme de grappes dispersees non identiques et semble exister sur tous les chromosomes. Il est forme d'une courte repetition qui possede une sequence centrale commune et une sequence laterale variable. Un fragment d'ADN repetitif, le Rep2O, provenant d'un isolement africain de P. falciparum, l'HG-13, a e clone et analyse par Oquendo et al. (7). Comme les deux sondes precedentes, ce fragment contenait une sequence de 21 paires de bases se repetant de nombreuses fois en tandem. On a trouve sur le meme fragment d'ADN deux grappes de la meme copie orientees a l'oppose l'une de l'autre. Les donnees actuelles laissent a penser que le Rep20 est specifique d'espece. Il a reagi avec de l'ADN des stades erythrocytaires d'isolements de P. falciparum pro- venant de Thallande et de Papouasie-Nouvelle- Guinee, ainsi qu'avec des hematies parasitees par divers clones genetiquement purs de P. falciparum provenant de Thalilande. II n'a pas reagi avec l'ADN purifie de P. chabaudi et de P. berghei, ni avec des cellules infectees par P. vivax. Un autre fragment repet, le pBRKl-14, de l'ADN de l'isolement Ki de P. falciparum a ete clone et analyse (Sakol Panyim, communication personnelle, 1985). Il contenait un insert de 746 paires de bases et decelait des quantites d'ADN pur de P. falciparum de l'ordre du ng. Il ne presentait pas de reaction crois6e avec l'ADN des plasmodies de P. vivax, P. cyno- molgi, P. knowlesi et P. chabaudi, ni avec l'ADN humain ou l'ADN du moustique Anopheles dirus. La sonde pBRKI-14, en raison de sa sensibilite compara- tivement plus faible, pourrait etre plus utile pour la detection specifique de parasitemies a P. falciparum relativement elevees, bien que son aptitude a distinguer les divers isolements et clones doive etre etudiee plus avant. Cette sonde, tout comme l'ADN repetitif obtenu a partir des banques d'ADN des isolements Honduras I/CDC et FCR-3 /Gambien de P. falciparum (3) et du clone E12 d'un isolement de Papouasie-Nouvelle- Guinee de P. falciparum (4), a et utilisee pour montrer les variations entre clones. L'arrangement de l'ADN repetitif des clones de l'isolement Honduras I/CDC s'est revele instable puisqu'on a pu deceler des variations apres six mois de culture in vitro. La sonde pBRKl-14 a montre un mode d'hybri- dation-transfert different avec l'isolement africain G112 de P. falciparum et les clones T9/94, T9/96, T9/98 et T9/106 de P. falciparum provenant de la province de Tak en Thailande. Ces clones different par leur pharmacosensibilite, leurs caracteristiques isoenzymatiques et leurs proteines de surface detec- tees par les anticorps monoclonaux (9). Toutefois, la pBRKl-14 n'a pu faire la distinction entre les clones T9/96 et T9/98 qui n'avaient comme difference que leur sensibilite aux antipaludiques courants. Pollak et al. (8) ont mis au point une epreuve rapide et simple de detection de P. falciparum dans le sang humain. Elle est basee sur l'hybridation ADN-ADN, avec comme sonde de l'ADN entier radiomarque et comme sang, celui recueilli par piqure au doigt. Ils ont signale que cette technique permettait de deceler des taux de parasitemie de 0,0001% dans 10 1u de sang. Coppel et al. (4) ont utilise trois sondes d'ADN complementaire provenant de genes d'antigenes clones pour faire la distinction entre des isolements de P. falciparum. Deux des sondes codaient pour les antigenes S, ce qui laisse a penser que les variations d&celees par ces sondes sont le reflet de modifications dans la masse moleculaire relative (Mr) de ces pro- teines, alors que la troisieme codait pour une proteine de Mr 250 000. Il semblerait que les variations decelees par cette troisieme sonde soient le reflet de modifications dans la taille du peptide et le nombre de ses repetitions. Van der Ploeg et al. (10) ont decrit une autre technique basee sur l'analyse de I'ADN et susceptible de faire la distinction entre des isolements de P. falci- parum. Cette methode est fondee sur la separation de molecules d'ADN de la taille d'un chromosome, d'une longueur d'au moins 2000 kilobases, par electrophorese sur gel avec gradient de concentration et champ pulse apres lyse legere des hematies infectees. Cette technique a montre que les stades erythrocytaires asexues et sexues de la meme lign6e parasitaire possedaient des caryotypes identiques, tandis que la longueur de ces molecules d'ADN de taille chromosomique differait selon les isolements geographiques et selon les clones derives d'une meme population de P. falciparum. Bien que cette tech- nique puisse servir A faire la distinction en laboratoire entre populations parasitaires, elle ne semble pas avoir d'application sur le terrain. Evaluation sur le terrain Jusqu'ici, seules les sondes pPF14 et Rep2 de P.falciparum ont ete soumises a une evaluation limitee sur le terrain. La premiere a ete utilisee pour analyser 632 prelevements de sang en Thailande et 570 au Kenya, et la seconde 28 prelevements au Liberia. La methodologie de base employee en Thailande et au Kenya etait la suivante: on a recueilli 50 gl de sang dans un tube capillaire heparine, apres piqure au doigt; ce sang a ete lyse puis depose sur un filtre de nitrocellulose a l'aide d'un systeme de micro-trans- fert par taches ("dot-blot"); I'ADN a e denature 33 MEMORANDUM Tableau 2. R6sultats pr6liminaires d'une 6tude com- parative du diagnostic du paludisme (Plasmodium falci- parum) par examen microscopique° et par sonde d'ADN (pPF 1 4) Etude thailandaise: Total des malades: Total des positifs (Frottis + ADN +) Faux n6gatifs (Frottis + ADN -) Total des n6gatifs (Frottis - ADN -) Faux positifs (Frottis - ADN +) 577 151 36 426 13 Etude kenyane: Total des malades: Total des positifs (Frottis + ADN +) Faux n6gatifs (Frottis + ADN -) Total des n6gatifs (Frottis - ADN -) Faux positifs (Frottis - ADN +) 509 188 37h 321 1 34 a Le diagnostic a 6td pos6 par un technicien en microscopie experiment6 qui a examin6 200 champs d'une goutte 6paisse. Par la suite, 19 d'entre eux se sont r&v6I6s n6gatifs aprbs second examen de la goutte 6paisse. c Par la suite, 11 d'entre eux se sont r&v616s r6ellement positifs apr6s second examen de la goutte 6paisse. in situ et fixe sur le filtre par chauffage; les filtres ont ensuite ete hybrides avec la sonde d'ADN radioactive, laves et exposes a un film sensible aux rayons X (fig. 1). Deux modifications ont et appor- tees A cette technique dans l'etude liberienne, a savoir que l'ADN a ete d'abord extrait avec du phenol apres lyse, puis denature avant d'etre depose sur le filtre de nitrocellulose. L'etude thailandaise a et effectuee dans la province de Chantaburi, sur la frontiere orientale, selon un protocole permettant une comparaison detaillee entre l'examen microscopique de routine des etalements de sang, un examen microscopique plus complet et la technique avec sonde d'ADN. L'etude du Kenya, realisee en cooperation avec le Kenya Medical Council et les laboratoires Wellcome, a et faite suivant le meme protocole. La methodologie etait la suivante: a) Examen de routine de gouttes epaisses colorees des sujets consultant d'eux-memes le dispensaire anti- paludique soit pour de la fievre actuelle ou recente, soit pour un examen de suivi apres un diagnostic de paludisme. L'examen consistait en une recherche rapide des hematozoaires sur 50 A 100 champs micro- scopiques. b) Examen plus detaille, par un technicien experimente en paludologie, de 200 champs micros- copiques d'une goutte epaisse coloree au Giemsa, et notation de l'espece, du stade parasitaire et du Kenya 50 so (a 0)(ao4O E . 30 40 .0 0 z C5o <100 C500 C1ow0 Parasites/200 laucocytes Frottis+ ADN- Frottis-i ADN+ Fig. 2. Comparaison des rdsultats du diagnostic para- sitologique et du test avec sonde d'ADN pour P. falci- parum chez 577 malades thailandais et 509 malades kenyans, en fonction de la densit6 parasitaire. nombre d'hematozoaires pour 200 leucocytes. c) Recherche des parasites dans les prelevements de sang A l'aide de la sonde d'ADN selon la methode decrite plus haut, effectuee au laboratoire de terrain de Chantaburi et dans un laboratoire central bien equipe situe aux Etats-Unis d'Amerique. Le tableau 2 et les figures 2 et 3 resument les resultats obtenus dans les etudes menees en Thailande et au Kenya. II faut poursuivre l'analyse de ces donnees, en particulier dans les cas ou les resultats sont contradictoires. Neanmoins, il est interessant de noter que 71 o des faux negatifs, c'est-a-dire les cas positifs A l'examen microscopique et negatifs par le test A la sonde d'ADN, ont et observes chez des malades ayant des parasitemies tres faibles, de moins de 10 plasmodies pour 200 leucocytes, ce qui corres- pond A moins de 400 plasmodies par gl de sang. Tha'ilande 34 EMPLOI DE SONDES D'ADN POUR LE DIAGNOSTIC DU PALUDISME Une evaluation sommaire de la sonde d'ADN Rep2 s'est faite sur des prelevements de sang recueillis par piqiure au doigt chez 28 hommes asymptomatiques vivant dans une region d'holoendemie du Liberia. Tha'ilande <1 1-5 6-10 11-i5 Groupe d'Age Kenya <1 1-5 6-10 11-15 16-20 Groupe d'§ge Frottis ADN + ~ Frottis + ADN Frottis- ADN- Frottis+ ADN+ Fig. 3. Comparaison des r6sultats du diagnostic para- sitologique et du test avec sonde d'ADN pour P. falci- parum chez 577 malades thailandais et 509 malades kenyans, en fonction de I'age. 250 a200 a i E o150 .0 E 0 z s0 200 160 co 140 0 120 E l 100 0 40 20 o Dix-sept d'entre eux se sont revels positifs par le test a la sonde d'ADN, contre 21 apres examen microscopique de 40 minutes d'une goutte epaisse coloree au Giemsa (6). Si chaque goutte epaisse n'avait e examinee que pendant 10 minutes, on n'aurait diagnostique que 15 sujets positifs. La densite parasitaire allait de 2 a 4500 P. falciparum4ll, avec une mediane de 20/4d. Six sujets pr'sentaient des infections mixtes A P. falciparumIP. malariae et un malade une infection unique a P. malariae. Cette derniere n'a pas e decelee par le test A la sonde d'ADN. La detection limite sur le terrain etait d'environ 10 P. falciparum4ll pour des echantillons de 35 il. Sur les quatre prlelvements infectes par P. falci- parum et qui n'ont pas reagi A 1'epreuve d'hybrida- tion, l'un avait 10 plasmodies asexuees et 30 gameto- cytes par IA, le second 15 plasmodies asexuees par Al et les deux derniers 2 plasmodies asexuees par gl. Tous les prelevements pour lesquels l'examen microscopique n'avait revele aucune parasitemie a P.falciparum apres 40 minutes etaient egalement negatifs par le test d'hybridation. FUTURES ETUDES SUR LES SONDES A USAGE DIAGNOSTIQUE Sondes d'ADN On a identifie plusieurs clones d'ADN de P. falciparum contenant des sequences repetitives et capables de deceler les plasmodies dans le sang. Ils semblent etre specifiques d'espece et reconnaitre des isolements provenant de regions geographiques tres diverses. On a egalement decouvert des sondes decelant des variations entre clones. La structure de deux fragments repetitifs clones independamment a e mise en evidence et decrite en detail (1, 7). Tous deux consistent en repetitions imparfaites en tandem d'une sequence de 21 paires de bases. Ces clones, malgre leur origine differente (l'un provenait d'un hematozoaire de Tanzanie et 1'autre de Gambie) ont des repetitions en tandem du meme type. Bien que les autres clones soient moins bien caracterises A l'heure actuelle, I'analyse de restriction et le sequencage de certains nucleotides semblent indiquer qu'ils ont tous une structure interne repe- titive. Par consequent, il semble absolument necessaire de les comparer pour determiner s'ils sont ou non identiques. En pratique, 1'interet des clones d'ADN repetitif pour le diagnostic depend autant de leur sensibilite que de leur specificite. Des tests de sensibilite differente seront necessaires pour repondre A l'emploi qu'on en fera. On estime A l'heure actuelle que la limite theorique de sensibilite d'une sonde 35 MEMORANDUM unique marquee au 32P ayant l'activite la plus elev6e possible est de l'ordre de 100 a 1000 plasmodies/ 50 Al de sang, soit 2 a 20 plasmodies/lI, ce qui represente une parasitemie de 0,00004 a 0,0004% (sur la base d'une numeration erythrocytaire de 5 x 109/ml de sang). Toutefois, ces resultats supposent l'utilisation du 32p, un traceur a forte radioactivite. Bien que cette sensibilite soit tout A fait comparable a celle de la microscopie traditionnelle, il faut l'ameliorer pour les cas ou meme les densites parasitaires les plus faibles doivent etre decelees. Le niveau de detection des sequences de bases de l'ADN cible pourrait etre eleve en associant des sondes differentes pour un meme parasite, ou en utilisant quatre desoxyribonucleotides triphosphates marques. Des techniques d'une sensi- bilite plus faible, avec un seuil de detection de 1000 parasites/Al, faciliteraient le diagnostic du paludisme clinique dans les zones de forte endemicite; ce serait possible avec les sondes dont on dispose a l'heure actuelle. Jusqu'a present, tous les efforts entrepris pour mettre au point des sondes destinees au diagnostic ont porte sur P. falciparum, bien que l'on commence aussi maintenant a constituer des banques geno- miques pour P. vivax. Il semble probable que l'on parvienne A mettre au point des sondes pour cette, espece dans un proche avenir. II n'existe pas de banque genomique pour les deux autres plasmodies humaines, P. malariae et P. ovale, et la mise au point de sondes pour le diagnostic d'un paludisme A P. ovale n'est pas actuellement tres urgente. Par contre, des sondes capables d'identifier P. malariae auraient leur place dans le cadre de la lutte anti- paludique en Afrique. II serait egalement interessant du point de vue operationnel de disposer d'une sonde universelle capable de reconnaitre tous les types de paludisme sans precision de l'espece. Une telle sonde aurait des applications au niveau des soins de sante primaires, lorsqu'on cherche A savoir si le paludisme est bien la cause de symptomes cliniques, des tests ulterieurs pouvant ensuite etre effectues pour identifier l'espece si le traitement du malade l'exige. II y a deux approches possibles A la mise au point d'une telle sonde universelle: a) combiner en une sonde unique les sondes specifiques de chaque espece ou b) identifier et isoler une sequence de bases d'ADN commune A toutes les especes. La premiere de ces approches suppose que l'on puisse disposer de sondes specifiques de toutes les especes de plasmodies humaines, ce qui n'est pas le cas A l'heure actuelle. La seconde semble plus realisable pour le moment, puisqu'on a identifie chez P. gallinaceum une sequence genique repetee qui semble etre commune a toutes les plasmodies, mais pas a l'ADN des autres organismes (Wirth, communication personnelle, 1985). Simplification du test d'hybridation Marquage de la sonde. On emploie actuellement des sondes marquees au 32p puisqu'elles rendent le test tres sensible. Cet isotope a comme inconvenient sa courte periode radioactive; en outre, les difficultes liees a la manipulation de toute substance radioactive rendent son emploi impossible en dehors d'un labora- toire bien equipe. II est par consequent tres sou- haitable de mettre au point des methodes non radioactives pour le marquage des sondes. Les pro- gres dans ce domaine ont ete lents et a l'heure actuelle, seuls les nucleotides marques a la biotine, comme l'uridine triphosphate (UTP), semblent pro- mis A un certain avenir. Malheureusement, la preparation de 1'ADN marque a la biotine est difficile et sa sensibilite est au moins 10 fois inferieure a celle des meilleures methodes radioactives. De plus, l'application de cette methode A la detection des plas- modies dans le sang est, dans une certaine mesure, limitee par le fait que la biotine est une substance pro- duite naturellement chez l'homme. Des methodes differentes de marquage de l'ADN sont actuellement mises au point a d'autres fins diagnostiques, et il faut savoir quel est leur interet dans le paludisme. Elle comprennent, entre autres: a) La modification chimique de 1'ADN suivie d'une detection A l'aide d'anticorps specifiques. C'est un domaine ou les progres sont rapides et qui devrait aboutir a des resultats pratiques dans un proche avenir. Un exemple de ce type d'approche est le marquage de I'ADN par insertion d'un groupe sulfone antigenique dans les residus cytosine des sondes, la detection de l'hybridation 6tant realisee par une reaction immunoenzymatique. I1 existe dans le commerce un necessaire d'epreuve base sur ce principe, mais il reste a verifier si son emploi peut s'appliquer au diagnostic du paludisme. b) Le marquage direct ou indirect de I'ADN a l'europium, un metal rare. Des n&ecessaires de diagnostic bases sur ce principe sont actuellement en cours de mise au point. c) Des tests immunofluorimetriques pour la detec- tion des acides nucleiques, semblables A ceux mis au point pour la detection des antig&nes. Methode d'hybridation sur filtre. Les methodes actuelles d'hybridation sur filtre comprennent de nombreuses etapes qui les rendent assez incommodes. II convient donc de verifier dans quelle mesure on pourrait abreger certaines d'entre elles ou meme les supprimer. Par exemple: a) le prelevement de sang: pourrait-il etre applique directement sur le papier filtre, en prenant par exemple de grandes feuilles de papier-filtre epais Whatman, plutot que de transferer l'echantillon d'un tube capillaire dans un flacon puis sur un filtre de 36 EMPLOI DE SONDES D'ADN POUR LE DIAGNOSTIC DU PALUDISME nitrocellulose? b) le chauffage du filtre: est-il indispensable, ou pourrait-il etre remplace par d'autres methodes ne necessitant pas de hautes temperatures? c) 1'etape de prehybridation: est-elle absolument necessaire et si oui, pourrait-on reduire sa duree au minimum? d) la duree de la reaction d'hybridation: cette etape tres longue-pourrait-elle etre raccourcie en modifiant les conditions de la reaction? De plus, de hautes temperatures ne seraient peut-etre plus necessaires si l'on ajoutait du formamide au tampon. Il est peut-etre possible de simplifier la methode classique d'hybridation sur filtre en la faisant par exemple en phase liquide, ce qui serait bien plus rapide que le passage a travers une membrane. De plus, des methodes simples de detection pourraient etre basees sur la chromatographie sur hydroxy- apatite, qui distingue A coup stur un fragment d'ADN monocatenaire d'un fragment hybride avec de l'ADN ou de l'ARN. On pourrait aussi employer des sondes liees A une matrice solide, par exemple un batonnet enrobe d'une matrice appropriee. Ainsi, I'ADN ou l'ARN de l'echantillon pourrait etre detecte par hybridation A l'aide d'une reaction de competition avec une sonde marquee qui reconnaitrait la sequence sur la phase solide. II faut bien stur affiner ces methodes avant d'en faire des tests diagnostiques operationnels. Conception d'un n6cessaire pour test. Il faut soigneusement evaluer toutes les techniques sur le terrain avant de chercher a preconiser un protocole d'epreuve normalise. Cependant, une fois elabores un protocole et un systeme d'epreuve uniformes, il faudra concevoir un necessaire adapte a l'utilisation sur le terrain. L'experience acquise dans d'autres domaines a montre la necessite d'inclure dans chaque necessaire tout le materiel et les produits indispen- sables A la reussite du test. En outre, ce necessaire doit comprendre des temoins positifs et negatifs pour tous les parametres etudies, et le contro'le de la qualite des resultats doit faire partie de tout protocole. II sera probablement necessaire de mettre au point des reactifs de tres longue duree de conservation, car il a ete prouve que, pratiquement, si l'une quelconque des substances necessaires au test, conservee a temperature ambiante ou au refrigerateur, a une limite d'utilisation de moins d'un an, cela represente un inconvenient majeur. Un necessaire dont les echantillons ou les reactifs doivent etre conserves au- dessous de + 4 °C est pratiquement inutilisable sur le terrain. Quand une nouvelle technique s'est montree realisable et adaptable aux conditions du terrain, il faut normaliser au maximum son execution. II faut examiner et evaluer tres completement chaque element du necessaire afin de savoir quelle presentation (formulations, emballage, etc.) donnera les meilleurs resultats au niveau op6rationnel et sera la plus rentable. De plus, il ne faut choisir, dans la mesure du possible, que du materiel courant et facile A se procurer. Des que les elements d'un systeme de test auront ete choisis, il faudra s'efforcer de les conserver et de n'en changer qu'apres evaluation soigneuse et complete des nouveaux, pour ce qu'ils sont et par rapport aux autres elements normalises du systeme adopte a l'origine. Evaluation sur le terrain Des etudes complementaires de validation des sondes d'ADN actuellement disponibles et de celles qui sont A l'etude sont necessaires. Cette validation devra d'abord se faire sous forme d'etudes inter- laboratoires appliquant differentes techniques aux prelevements provenant d'etudes cliniques et epidemiologiques. Les techniques les plus promet- teuses seront ensuite selectionnees pour des essais en double aveugle sur le terrain, de maniere a comparer les resultats de la sonde avec ceux des techniques microscopiques classiques. Ces etudes pourront comprendre: a) Des epreuves de specificite des sondes. Ces recherches porteront sur differentes especes de plasmodies humaines dans diverses regions geogra- phiques, ainsi que dans diverses localites a l'interieur d'un meme pays, afin de determiner la specificite de souche. b) Des epreuves de sensibilite des sondes. Ces etudes, qui porteront sur des prelevements de sang provenant en particulier de sujets ayant de tres faibles parasitemies, pourront etre faites sur des populations immunes ou semi-immunes de regions d'hyperende- mie. c) Des etudes sur la sensibilite du test: son aptitude A deceler une disparition reelle des parasites apres un traitement radical, et la presence residuelle d'ADN parasitaire dans le sang apres suppression de la para- sitemie. Elles pourraient etre facilement realisees dans des dispensaires antipaludiques ou les malades sont suivis apres traitement radical. Autres applications En dehors de leur normalisation pour le diagnostic des infections sanguines, les sondes d'ADN pour- raient etre utiles dans d'autres domaines, par exemple: - 1'examen systematique du sang dans les banques de sang; -la detection des parasites chez le moustique; -la detection des isolements pharmacoresistants (si 38 MEMORANDUM l'on peut mettre au point des sondes specifiques de ces isolements). II a deja ete prouve que des sondes d'ADN pouvaient deceler des sporozoites chez le moustique, et la mise au point de necessaires pour la detection d'antigenes specifiques d'espece de ces stades est bien avancee. * * * C. C. Draper, Department of Tropical Hygiene, London School of Hygiene and Tropical Medicine, Londres, Angleterre B. M. Greenwood, Medical Research Council Laboratories, Fajara, Gambie M. Holmberg, Departement de Genetique medicale, Centre biomedical, Universite d'Uppsala, Uppsala, Suede Sakol Panyim, Department of Biochemistry, Faculty of Science, Mahidol University, Bangkok, Thallande U. Pettersson, Departement de Genetique medicale, Centre biomedical, Universite d'Uppsala, Uppsala, Suede Y. Pollack, Departement de Microbiologie et d'Immuno- logie, Universite du Neguev Ben Gourion, Jerusalem, Israel J. Scaife, Department of Molecular Biology, University of Edinburgh, Edimbourg, Ecosse Laksami Suebsaeng, Malaria Division, Department of Communicable Diseases, Ministry of Public Health, Bangkok, Thallande D. Wirth, Department of Tropical Health, Harvard School of Public Health, Boston, MA, Etats-Unis d'Amerique Secretariat OMS P. F. Beales, Programmation et Formation, Programme d'Action antipaludique, OMS, Geneve, Suisse E. B. Doberstyn, Programme special PNUD/Banque mondiale/OMS de Recherche et de Formation concer- nant les Maladies tropicales, et Recherche et Renseigne- ments Techniques, Programme d'Action antipaludique, OMS, Geneve, Suisse L. J. Martinez, Programme sp&cial PNUD/Banque mondiale/OMS de Recherche et de Formation concer- nant les Maladies tropicales, et Recherche et Renseigne- ments Techniques, Programme d'Action antipaludique, OMS, Geneve, Suisse J. A. Najera, Programme d'Action antipaludique, OMS, Geneve, Suisse E. Onori, Methodologie et Evaluation epidemiologiques, Programme d'Action antipaludique, OMS, Geneve, Suisse D. Payne, Programme special PNUD/Banque mondiale/ OMS de Recherche et de Formation concernant les Maladies tropicales, et Recherche et Renseignements Techniques, Programme d'Action antipaludique, OMS, Geneve, Suisse P. I. Trigg, Recherche et Renseignements Techniques, Programme d'Action antipaludique, OMS, Geneve, Suisse W. H. Wernsdorfer, Recherche et Renseignements Tech- niques, Programme d'Action antipaludique, OMS, Geneve, Suisse REMERCIEMENTS Mlle Marina Pearce doit etre remerci6e pour I'aide qu'elle a apportee a la realisation de la figure 1. BIBLIOGRAPHIE 1. ASLUND, L. ET AL. Highly reiterated non-coding sequence in the genome of Plasmodium falciparum is composed of 21 base-pair tandem repeats. Journal of molecular biology, 185: 509-516 (1985). 2. BARKER, R. H. ET AL. Specific DNA probe for the diagnosis of P. falciparum malaria. Science, 231: 1434-1436 (1986). 3. 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