Introduction to a standardized method for the evaluation of the potency of Bacillus thuringiensis serotype H-14 based products*

,Research iRecherche Bulletin ofthe World Health Organization, 61 (1): 93-97(1983) ©) WorldHealth Organization 1983 Introduction to a standardized method for the evaluation of the potency of Bacillus thuringiensis serotype H-14 based products* N. RISHIKESH & G. QUtLENNEC1 Vector resistance and other constraints have necessitated consideration of the use of alternative materials and methods in an integrated approach to vector control. Bacillus thuringiensis serotype H-14 is a promising biological control agent which acts as a conven- tional larvicide through its delta-endotoxin (active ingredient) and which now has to be suitablyformulatedfor application in vector breeding habitats. The active ingredient in the formulations has so far not been chemically characterized or quantified and therefore recourse has to be taken to a bioassay method. Drawing on past experience and through the assistance mainly of various collaborating centres, the World Health Organization has standardized a bioassay method (described in the Annex), which gives consistent and repro- ducible results. The method permits the determination of the potency of a B.t. H-14 preparation through comparison with a standard powder. The universal adoption of the standardized bioassay method will ensure comparability of the results of different investigators. While chemical pesticides will continue to play an important role in disease vector control in the coming decades, there are constraints such as the spread of vector resistance, concern about environmental pollu- tion, and rising costs. The high cost of the newer alter- native insecticides poses a problem for developing countries with limited public health budgets. Those insecticides developed for the agricultural market very often cannot be used against human disease vectors owing to the more stringent requirements, particularly in respect of toxicity and specificity, for substances that come into close contact with man. It is therefore increasingly necessary to consider alternatives to the use of chemicals, such as other * A French translation of this article appears on pages 99-103. Division of Vector Biology and Control, World Health Organ- ization, 1211 Geneva 27, Switzerland. materials and methods, in an integrated approach to vector control (1). Biological control is an attractive alternative since, in practice, it should be a simple and economical manipulation of natural regulatory mech- anisms in man's favour (2). Bacillus thuringiensis serotype H-14 (B. t. H-14) is the most promising biological control agent devel- oped to date to an advanced level under the collab- orative research programme sponsored by the UNDP/World Bank/WHO Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases (3, 4).a This serotype produces parasporal crystals (delta- endotoxin) differing in size, shape and electron density from those of other serotypes (4, 5). Larvae a Data sheet on the biological control agent Bacillus thuringiensis serotype H-14 (de Barjac 1978). Unpublished WHO document, WHO/VBC/79.750, rev. 1, 1982. 4263 -93- 94 N. RISHIKESH & G. QUELENNEC are killed as a result of the toxic effect of the crystal(s) and not through septicaemia caused by the bacillus. The agent thus acts like a conventional larvicide. At present, for operational use, the bacillus has to be mass-cultured and the spore/crystal mixture has to be suitably formulated for application to the vector breeding habitats. FORMULATION SPECIFICATIONS It is essential to develop specifications for the products of B.t. H-14, as is done for chemical larvicide formulations. Such specifications (6) describe the product (content of the active ingredient and all the physical and chemical properties which characterize the pesticide) and also assure its activity against the target vector(s). WHO specifications include the analytical methods necessary for evalu- ating the content of active ingredients of the product and for measuring its physical and chemical proper- ties. The delta-endotoxin of B.t. H-14 cannot at present be chemically characterized or quantified and the amount of toxin has no relationship with the number of spores. The spore-crystal proportion of a preparation of B. t. H-14 varies with the strain and its mode of production. Potency of B.t. H-14 preparations The concentration of delta-endotoxin (active ingredient) in a preparation cannot at present be determined by chemical means. Hence a bioassay method has to be adopted to estimate the potency of B.t. H-14 preparations. Serological methods are also under consideration (A. Yousten, personal communi- cation). Although these methods can offer some advantages, they are as yet insufficiently developed to be of use. STANDARDIZATION OF THE BIOASSAY METHOD The World Health Organization has taken a lead in developing standardized bioassay methods for detect- ing and measuring insecticide resistance in mosquito larvae (7). Standardized bioassay methods with appropriate modifications have also been extensively used for over two decades as an essential tool for the preliminary screening of the candidate compounds submitted by industry to the WHO programme for evaluating and testing new insecticides (8, 9). This experience paved the way for developing a standard bioassay method for B.t. H-14 (see Bulletin of the World Health Organization, 58: 231-232 (1980)). In the determination of the potency of a prepara- tion, many factors have to be borne in mind in order to ensure consistent results (10, 11, 12). An excellent initial dispersal of the spores/crystals in water is essential to provide a homogeneous suspension of the active material. Bias due to sedimentation was largely overcome by using, as test insect, bottom-feeding larvae of Aedes aegypti which are also easily colonized. Ae. aegypti Bora Bora strain was normally used to minimize variation in susceptibility between strains. b The bioassay method was developed with the assist- ance of WHO field units and Collaborating Centres.C Once satisfactorily consistent results were obtained in these centres, it was tested by several independent laboratories. This collaborative work showed that the method gave reproducible results provided the pro- cedure was carefully followed and the same mosquito strain was used. The method was finally discussed and a protocol adopted at a WHO informal consultation on stan- dardization of B.t. H-14 in March 1981,d which was also attended by representatives of the main producers of commercial formulations of B.t. H-14. This protocol was revised at the fifth meeting of the WHO Scientific Working Group on Biological Con- trol of Vectors in October 1981,e and considered by the WHO Expert Committee on Biological Control of Vectors in December 1981 (2). An edited version of the revised protocol is presented in the Annex. The determination of the potency is by comparing the dosage/response curve of the preparation being analysed with the curve for the standard powder under standard conditions. The procedures recommended for measurement of the potency of products of B. t. H-14 require the use of an internationally recognized standard preparation. In the case of Bacillus thuringiensis H-14, the pro- posed standard is the spore-crystal complex prepared by the International Reference Centre on Bacillus thuringiensis (at the Institut Pasteur, Paris), which was designated by the International Organization for Biological Control (OILB). b DEMPAH, J. & Coz J. Essais de Bacillus thuringiensis israe- lensis sur les moustiques. Unpublished WHO document WHO/ VBC/79.719, 1979. c Centre for Overseas Pest Research, Porton Down, United King- dom; Entente Interdepartementale de Demoustication, Montpellier, France; Institut Pasteur, Paris, France; Organisation de Coordi- nation et de Cooperation pour la Lutte contre les grandes Endemies, Bobo-Dioulasso, Upper Volta; Office de la Recherche Scientifique et Technique Outre-Mer, Bondy, France; University of California, Berkeley, USA; University of California, Riverside, USA; Universiti Sains Malaysia, Penang, Malaysia; USDA Gulf Coast Mosquito Research, Lake Charles, USA. d Report of the Informal Consultation on Standardization of Bacillus thuringiensis serotype H-14. Unpublished WHO document TDR/BCV/BTH-14/81.1, VBC/81.828, 1981. e Fifth meeting of the Scientific Working Group on Biological Control of Vectors, Geneva, 1981. Unpublished WHO document TDR/VEC-SWG(5)/8 1.3. POTENCY OF BACILLUS THURINGIENSIS H-14 PREPARATIONS 95 The originally recommended standard (IPS-78),f when lyophylized, did not provide consistent results. A new interim standard (IPS-80) was used until suffi- cient quantities of IPS-82, the final standard, became available. After a collaborative study to determine its stability, IPS-82, if satisfactory, will be submitted to the WHO Expert Committee on Biologicals for consideration as an international standard. f IPS-78 was arbitrarily given a potency of 1000 units; IPS-80 and IPS-82 have been compared with IPS-78 and given appropriate values (authors' note). CONCLUSIONS At present the bioassay is the only feasible method for determining the potency of different B.t. H-14 preparations. The WHO standardized method, developed through the collaborative efforts of various scientists throughout the world, is now giving consistent and reproducible results. The universal adoption of this standardized bioassay method will ensure comparability of results obtained by different investigators. REFERENCES 1. WHO Technical Report Series, No. 561, 1975. (Ecology and control of vectors in public health: twenty-first report of the WHO Expert Committee on Insecticides). 2. WHO Technical Report Series, No. 679, 1982. (Biological control of vectors ofdisease: sixth report of the WHO Expert Committee on Vector Biology and Control). 3. GOLDBERG, L. J. & MARGALIT, J. A bacterial spore demonstrating rapid larvicidal activity against Anopheles sergentii, Uranotaenia unguiculata, Culex univittatus, Aedes aegypti and Culexpipiens. Mosquito news, 37: 355-358 (1977). 4. DE BARJAC, H. Une nouvelle variete de Bacillus thurin- giensis tres toxique pour les moustiques: B. thurin- giensis var. israelensis serotype 14. Comptes rendus des seances de l'Academie des Sciences (Paris), 286D: 797-800 (1978). 5. CHARLES, J.-F. & DE BARJAC, H. Sporulation et cristal- logenese de Bacillus thuringiensis var. israelensis en microscopie electronique. Annales de microbiologie (Paris), 133A: 425-442 (1982). 6. WORLD HEALTH ORGANIZATION. Specifications for pesticides used in public health. 5th ed., Geneva, 1979. 7. WHO Technical Report Series, No. 443, 1970. (Insecti- cide resistance and vector control: seventeenth report of the WHO Expert Committee on Insecticides). 8. WRIGHT, J. W. The WHO programme for the evalu- ation and testing of new insecticides. Bulletin of the World Health Organization, 44: 11-22 (1971). 9. METCALF, R. L. ET AL. WHO collaborative programme for evaluation of new insecticides. Screening and laboratory tests for Stages I, II and III. Cahiers O.R.S. T.O.M. entomologie medicale et parasitologie, VII (2): 111-119 (1969). 10. SINEGRE, G. Contribution A la normalisation des epreuves de laboratoire concernant des formulations experimentales et commerciales du serotype H-14 de Bacillus thuringiensis. 1. Stabilite des suspensions d'epreuve et d6tection des eventuels contaminants chimiques toxiques pour les larves de moustiques. Cahiers O.R.S. T.O.M. entomologie me'dicale et parasitologie, XIX (3): 143-147 (1981). 11. SINEGRE, G. ET AL. Contribution A la normalisation des epreuves de laboratoire concernant des formulations experimentales et commerciales du serotype H-14 de Bacillus thuringiensis. 2. Influence de la temperature, du chlor residuel, du pH et de la profondeur de l'eau sur l'activite biologique d'une poudre primaire. Cahiers O.R.S. T. O.M. entomologie me'dicale et parasitologie, XIX (3): 149-155 (1981). 12. SINEGRE, G. ET AL. Contribution A la normalisation des epreuves de laboratoire concernant des formulations experimentales et commerciales du serotype H- 14 de Bacillus thuringiensis. 3. Influence separee ou conjointe de la densite larvaire, du volume ou profondeur de l'eau et de la presence de terre sur l'efficacite et l'action larvicide residuelle d'une poudre primaire. Cahiers 0.R.S. T.O.M. entomologie me'dicale et parasitologie, XIX (3): 157-163 (1981). 96 N. RISHIKESH & G. QUELENNEC Annex I BIOASSAY PROTOCOL FOR BACILLUS THURINGIENSIS H-14 PREPARATIONS 1. Standard bacterial preparation The standard material, IPS-78, is obtainable from the Pasteur Institute in Paris.a It should be stored and handled according to the supplier's recommendations which include the necessity of storage in the dark at 2-5 °C, equilibration at room temperature before opening the plastic box to avoid condensation and, after the taking of a sample, resealing of the container and its return to storage at 2-5 oC.b 2. Assay species Early fourth instar larvae of the Bora-Bora strain of Aedes aegypti should be used. Eggs to start breed- ing colonies can be obtained from the Pasteur Insti- tute, Paris, or several other centres. To obtain larvae at the same developmental stage, induce the eggs to hatch by use of a stimulant, such as the addition of 100 mg ascorbic acid/litre of water. This deoxygenates the water and all the eggs hatch very quickly. Purchase a large stock of suitable mos- quito food to avoid variations from the use of differ- ent batches of food in the course of time. Store this food in dry, cool (5 °C) conditions to prevent infesta- tion by storage pests or infection by moulds. Feed the larvae with standardized optimal quantities of food, using a standardized breeding routine at a constant temperature selected from a range between 22 °C and 28 'C. Do not vary this temperature for different experiments. Harvest the larvae (e.g., with a strainer or a pipette) at a pre-selected age when all have just moulted into the fourth instar. If A. aegypti is unacceptable in a country for safety reasons, use Culex quinquefasciatus or C. pipiens. 3. Preparation of bacterial suspensions Homogenize a weighed quantity of the bacterial preparation in a known volume of chlorine-free water, preferably deionized or distilled (or tap water that has been aerated in shallow trays for 24 hours). A glass homogenizer, ball mill or blender with rotating knives are suitable homogenizing equipments. Place a e Laboratoire de Lutte bact&riologique, Institut Pasteur, 25 rue de Dr Roux, 75724 Paris, Cedex 15, France. b The new provisional standard, IPS-82, is now available as a 100 mg tablet in a bottle. A desired amount, not less than 20 mg, should be weighed in a precision balance to prepare a suspension of the standard. After this sample is taken, the bottle should be resealed and stored in dry conditions, preferably in a desiccator. The suspen- sion can be stored in a refrigerator for up to 6 months and portions can be used as standard for conducting several bioassays (authors' note). loopful of this initial suspension on a microscope slide, apply a cover slip, and check (under phase con- trast illumination) that all clumps have been broken into individualized spores and crystals. Agitate the initial suspension thoroughly and prepare at least five serial dilutions (for example, x 0.8 each time) in chlorine-free water. Re-agitate every time a fresh dilution is made. For the proposed standard IPS-80, a top concentration of 0.4 mg/litre is likely to be suitable. A sufficient range of concentrations should be used for the test samples in order to obtain a good mor- tality rate distribution. Shake each dilution (e.g., 20 circular shakes by hand) and then apply early fourth instar larvae at a suitable density, such as one larva per 8 ml of bacterial suspension (25 larvae per 150 or 200 ml would be suitable). The larvae should not be fed during the assay. Wax cups should not be used as they may trap the crystals. Keep at a constant temperature, selected from the range of 23-27 °C in darkness or dim light. They must be kept away from sunlight. An exposure time limited to 24 hours is desirable. It should extend over an active feeding period, while avoiding the prepupal period and pupation. 4. Numbers of insects and replicate assays Sufficient insects and replicate assays should be used to achieve a coefficient of variation not ex- ceeding 20%. For instance, four cups of 25 larvae per concentration and seven concentrations per test bacterial product are suitable, with the assay repeated on three different days. The objective is to have at least two mortality rates on either side of the LC5o within the range of 10-90% mortality. It is essential, when the assays are repeated on different days, that they should be based on a freshly weighed batch of powder. Progressive study of the data, as successive assays are completed, will enable the optimum use to be made of the available insects.c The important features to note are the relative size of the within-assay variation (scatter of points about a straight line) com- pared with the between-assay variation (e.g., vari- ation between replicate LC5o values), and also the slope of the assay lines, which is partly a reflection of the variation within the particular batch of insects used. c BURGES, H. D. & THOMPSON, E. M. Standardization and assay of microbial insecticides. In: Burges, H. D. & Hussey, N. W.(ed.) Microbial control of insects. London, Academic Press, 1971. POTENCY OF BACILLUS THURINGIENSIS H-14 PREPARATIONS 97 5. Reading the assay After an exposure period of exactly 24 hours, count the numbers of live larvae (the results are based on counts of live larvae because of the cannibalistic tendency of larvae at lower concentrations).d If the control mortality exceeds 10%o, discard the assay. Calculate the percentage mortalities and obtain LC50 values by plotting on log-probit graph paper, or by using a computer programme with a probit or logit transformation of mortality against log concentra- tion. The provision of such a computer programme that could be used by laboratories not linked to a d Therefore, it is suggested that the exact number of larvae introduced at the start of the test should be recorded. A supple- mentary counting after an exposure period of 48 hours is recommended (authors' note). computer terminal would be useful. An inexpensive small calculator now operates with a pre-pro- grammed magnetic strip. If it should be possible to forward a suitably programmed strip to laboratories (on request), this would lead to greater uniformity in the calculation of assay data. 6. Calculation of potency in units of toxicity for Aedes aegypti The relative potency (P) of the test preparation (in units of toxicity) with respect to the standard is given by the equation: 1000 x LC50 standard Pt= LC5o test preparation Bulletin de l'Organisation mondiale de la Sante, 61 (1): 99-103 (1983) © Organisation mondiale de la Sante 1983 Introduction a une methode normalisee pour I'evaluation de 1'activite des produits a base de Bacillus thuringiensis, serotype H-14* N. RISHIKESH' & G. QUELENNEC1 Devant l'apparition de re'sistances chez les vecteurs et d'autres contraintes, il a fallu envisager le recours a des methodes et des mate'riaux nouveaux, dans une approche integree de la lutte antivectorielle. Le serotype H-14 de Bacillus thuringiensis (B. t. H-14) est un agent de lutte biologique prometteur, qui agit comme un larvicide classique par sa delta-endotoxine (matiere active) et pour lequel il faut maintenant trouver des formula- tions ade'quates pour le traitement des gttes larvaires des vecteurs. Jusqu'd pre'sent, la matiere active dans lesformulations n'a e&te' ni quantifi&e ni caracte'rise'e chimiquement, et de ce fait il est n&cessaire de recourir a une me'thode d'essai biologique. Se fondant sur P'experience anterieure et grace a l'assistance essentiellement apportee par divers centres collaborateurs, l'Organisation mondiale de la Sante' a elabore' une mdthode normalisete d'essai biologique (d&crite en annexe) donnant des re'sultats coherents et reproductibles. Cette m6thode permet de de6terminer l'activite' d'une prdparation de B.t. H-14 par re6ference a une poudre etalon. L'adoption universelle de la mdthode normalisde d'essai biologique garantira la comparabilite des resultats obtenus par differents chercheurs. Les pesticides chimiques vont sans nul doute conserver au cours des prochaines decennies un role important dans la lutte contre les vecteurs de mala- dies, mais ils se heurtent cependant A divers obs- tacles, tels que l'apparition de resistances chez un nombre de plus en plus grand de vecteurs, les preoc- cupations suscitees par la pollution de l'environ- nement, l'augmentation des couts. Le prix eleve des insecticides de remplacement les plus recents est un probleme pour les pays en developpement, dont les budgets de sante publique sont reduits. Les insec- ticides mis au point pour le marche agricole ne peuvent tres souvent pas etre utilises contre les vec- teurs de maladies humaines, car les conditions impo- sees-notamment sur les plans de la specificite et de la toxicite-sont plus strictes quand il s'agit de sub- stances venant au contact etroit de l'homme. I1 s'avere donc de plus en plus necessaire d'envi- sager des moyens pouvant remplacer l'usage de pro- duits chimiques, tels que l'emploi d'autres materiaux et d'autres methodes, dans une approche integree de la lutte antivectorielle (1). La lutte biologique est une * La version originale en anglais figure aux pages 93-97. Division de la Biologie des Vecteurs et Lutte antivectorielle, Organisation mondiale de la Sante, 1211 Geneve 27, Suisse. solution seduisante, puisqu'en pratique elle devrait representer une manipulation simple et economique de mecanismes regulateurs naturels en faveur de l'homme (2). Le serotype H-14 de Bacillus thuringiensis (B.t. H-14) est l'agent de lutte biologique le plus promet- teur qui ait jusqu'a present fait l'objet d'une mise au point poussee dans le cadre du programme de recher- che collective mene sous les auspices conjoints du PNUD, de la Banque mondiale et du Programme special OMS de recherche et de formation concer- nant les maladies tropicales (3, 4)." Ce serotype produit des cristaux parasporaux (delta-endotoxine) differant de ceux des autres serotypes par leur taille, leur forme et leur densite electronique (4, 5). C'est l'effet toxique de ces cristaux qui tue les larves et non une septicemie due au bacille. L'agent agit donc comme un larvicide classique. Actuellement, pour une utilisation operationnelle, il est necessaire de realiser une culture de masse du bacille et de faire des formulations avec le melange spores/cristaux qui soient adaptees au traitement des gites larvaires des vecteurs. a Data sheet on the biological control agent Bacillus thuringiensis serotype H-14 (de Barjac 1978). OMS, document non publie, WHO/VBC/79.750, Rev 1, 1982. 4264 -99- 100 N. RISHIKESH & G. QUELENNEC NORMES DES FORMULATIONS I1 est indispensable d'elaborer des normes pour les produits a base de B.t. H-14, comme cela a ete fait pour les formulations de larvicides chimiques. Ces normes (6) decrivent le produit (sa teneur en matiere active, ainsi que toutes les proprietes physiques et chimiques caracterisant le pesticide), et en garan- tissent egalement l'activite contre le ou les vecteurs cible. Dans les normes OMS figurent les methodes analytiques necessaires pour evaluer la teneur en matiere active et pour mesurer les proprietes physiques et chimiques du produit. Actuellement on ne peut pas encore quantifier ou caracteriser chimiquement la delta-endotoxine de B.t. H-14; de plus, il n'y a pas de relation entre la quantite de toxine et le nombre de spores. La proportion spores/ cristaux d'une preparation de B.t. H-14 varie selon la souche et le mode de production. Activite des preparations de B.t. H-14 La concentration de delta-endotoxine (matiere ac- tive) dans une preparation ne peut a l'heure actuelle etre determinee par des moyens chimiques. I1 faut donc recourir a une methode d'essai biologique pour evaluer l'activite des preparations de B.t. H-14. On envisage aussi de recourir a des methodes sero- logiques (A. Yousten, communication personnelle). Bien que ces dernieres methodes offrent certains avantages, elles ne sont pas encore suffisamment au point pour devenir d'usage courant. NORMALISATION DE LA METHODE D'ESSAI BIOLOGIQUE L'Organisation mondiale de la Sante a pris la tete pour la mise au point de methodes normalisees d'essais biologiques visant A mettre en evidence et mesurer la resistance aux insecticides chez les larves de moustiques (7). Depuis plus de vingt ans, avec les modifications appropriees, des methodes normali- sees d'essais biologiques sont aussi largement utili- sees comme un moyen indispensable de selection preliminaire des composes soumis par l'industrie au programme OMS d'evaluation et d'essai de nouveaux insecticides (8, 9). L'experience ainsi acquise a prepare la voie pour l'elaboration d'une methode normalisee d'essai biologique applicable A B.t. H-14 (voir Bulletin de l'Organisation mondiale de la Sante, 58: 239-241 (1980)). Lorsque l'on veut determiner l'activite d'une preparation il faut, pour garantir la coherence des resultats, tenir compte d'un assez grand nombre de facteurs (10, 11, 12). Une excellente dispersion ini- tiale des spores/cristaux est indispensable pour assurer une suspension homogene de la matiere active. La possibilite d'erreur due a la sedimentation a e en grande partie corrigee par l'utilisation, comme insectes d'epreuve, d'Aedesaegypti, dont les larves se nourrissent en profondeur et qui sont faciles A elever en colonie. Afin de minimiser les variations de sensibilite d'une souche A l'autre, c'est la souche Bora Bora d'Ae. aegypti qui' a normalement ete utilis6e.b La methode d'essai biologique a et& preparee avec l'assistance de centres collaborateursc et d'unites de terrain de l'OMS. Une fois que des resultats d'une homogeneite satisfaisante ont e obtenus dans ces centres, la methode a e mise A l'essai dans plusieurs laboratoires independants. Ce travail collectif a mon- tre que la methode donnait des resultats repro- ductibles, A condition de respecter scrupuleusement la procedure indiquee et d'utiliser la meme souche de moustiques. La methode a e finalement discutee et un proto- cole adopte au cours d'une consultation informelle sur la normalisation de B.t. H-14 tenue par l'OMS en mars 1981 d et A laquelle assistaient aussi des repre- sentants des principaux producteurs de formulations commerciales de B.t. H-14. Le protocole a e revise lors de la cinquieme reunion du Groupe de travail scientifique de l'OMS pour la lutte biologique contre les vecteurs, en octobre 1981,e et examine par le Comite OMS d'experts de la lutte biologique contre les vecteurs en decembre de la meme annee (2). On trouvera en annexe la description de ce protocole revise. La determination de l'activite se fait par comparaison entre la courbe dose/reponse de la pre- paration a analyser et la courbe obtenue avec la poudre etalon, dans des conditions normalisees. Les procedures recommandees pour mesurer l'acti- vite des produits A base de B. t. H-14 exigent le recours A une preparation etalon universellement reconnue. Dans le cas de Bacillus thuringiensis H-14, l'etalon propose est le complexe spores/cristaux prepare par le Centre international de reference pour Bacillus thuringiensis (A l'Institut Pasteur, Paris), qui a et designe par l'Organisation internationale de Lutte b DEMPAH, J. & Coz, J. Essais de Bacillus thuringiensis israelensis sur les moustiques. OMS, document non publie, WHO/VBC/79.719, 1979. c Centre for Overseas Pest Research, Porton Down, Royaume- Uni; Entente Interdepartementale de Demoustication, Montpellier, France; Institut Pasteur, Paris, France; Organisation de Coordination et de Cooperation pour la Lutte contre les Grandes Endemies, Bobo-Dioulasso, Haute-Volta; Office de la Recherche Scientifique et Technique Outre-Mer, Bondy, France; Universite de Californie, Berkeley, Etats-Unis d'Amerique; Universite de Cali- fornie, Riverside, Etats-Unis d'Amerique; Universiti Sains Malaysia, Penang, Malaisie; USDA Gulf Coast Mosquito Research, Lake Charles, Etats-Unis d'Amerique. d Report of the Informal Consultation on Standardization of Bacillus thuringiensis serotype H-14. OMS, document non publie TDR/BCV/BTH-14/81.1, VBC/81.828, 1981. ' Fifth Meeting of the Scientific Working Group on Biological Control of Vectors, GenLve, 1981. OMS, document non publie TDR/VEC-SWG (5)/81.3. ACTIVITE DES PREPARATIONS DE BACILLUS THURINGIENSIS H-14 101 biologique (OILB). Lyophilise, 1'etalon qui avait e recommande a l'origine (IPS-78)f n'a pas donne de resultats cons- tants. Un nouvel etalon provisoire (IPS-80) a e utilise en attendant de disposer de quantites suffisantes d'IPS-82, etalon definitif. Si l'etude collective destinee a en determiner la stabilite donne des resultats satisfaisants, l'IPS-82 sera propose au Comite OMS d'experts de la Standardisation biolo- gique comme etalon international. f II avait et arbitrairement attribue a 1'IPS-78 une activite de 1000 unites; 1'IPS-80 et 1'IPS-82 ont et compares a 1'IPS-78, et se sont vu attribuer des valeurs appropriees (note des auteurs). CONCLUSIONS L'essai biologique est actuellement la seule m'thode praticable pour determiner l'activite de dif- ferentes preparations de B.t. H-14. La methode normalisee OMS, mise au point grace aux efforts collectifs de scientifiques du monde entier, donne maintenant des resultats coherents et reproductibles. L'adoption universelle de cette methode normalisee d'essai biologique garantira la comparabilite des resultats obtenus par differents chercheurs. BIBLIOGRAPHIE 1. OMS, Serie de Rapports techniques, N° 561, 1975 (Ecologie des vecteurs et lutte antivectorielle en sante publique. Vingt et unieme rapport du Comite OMS d'experts des Insecticides). 2. OMS, Serie de Rapports techniques, N° 679, 1982 (Lutte biologique contre les vecteurs de maladie. Sixieme rapport du Comite OMS d'experts de la biologie des vecteurs et de la lutte antivectorielle). 3. GOLDBERG, L. J. & MARGALIT, J. A bacterial spore demonstrating rapid larvicidal activity against Anopheles sergentii, Uranotaenia unguiculata, Culex univittatus, Aedes aegypti and Culexpipiens. Mosquito News, 37: 355-358 (1977). 4. DE BARJAC, H. Une nouvelle variete de Bacillus thuringiensis tres toxique pour les moustiques: B. thuringiensis var. israelensis serotype 14. Comptes rendus des seances de l'Academie des Sciences, (Paris), 286D: 797-800 (1978). 5. CHARLES, J.-F. & DE BARJAC H. Sporulation et cristallogenese de Bacillus thuringiensis var. israelensis en microscopie electronique. Annales de Microbiologie (Paris), 133A: 425-442 (1982). 6. Organisation mondiale de la Sante. Normes pour les pesticides utilises en sante'publique. Cinquieme edition, Geneve, 1980. 7. OMS, Serie de Rapports techniques, N° 443, 1970 (Resistance aux insecticides et lutte antivectorielle. Dix- septieme rapport du Comite OMS d'experts des Insecticides). 8. WRIGHT, J. W. The WHO programme for the evaluation and testing of new insecticides. Bulletin de l'Organisation mondiale de la Sante6, 44: 11-22 (1971). 9. METCALF, R. L. ET AL. WHO collaborative programme for evaluation of new insecticides. Screening and laboratory tests for Stages I, II and III. Cahiers O.R.S. T. O.M., entomologie medicale et parasitologie, VII (2): 111-119 (1969). 10. SINEGRE, G. Contribution a la normalisation des epreuves de laboratoire concernant des formulations experimentales et commerciales du serotype H-14 de Bacillus thuringiensis. 1. Stabilite des suspensions d'epreuve et detection des eventuels contaminants chimiques pour les larves de moustiques. Cahiers O. R. S. T. O.M., entomologie me'dicale et parasitologie, XIX (3): 143-147 (1981). 11. SINEGRE, G. ET AL. Contribution a la normalisation des epreuves de laboratoire concernant des formulations experimentales et commerciales du serotype H-14 de Bacillus thuringiensis. 2. Influence de la temperature, du chlore residuel, du pH et de la profondeur de l'eau sur l'activite biologique d'une poudre primaire. Cahiers 0. R. S. T. O.M. entomologie me'dicale et parasitologie, XIX (3): 149-155 (1981). 12. SINEGRE, G. ET AL. Contribution a la normalisation des epreuves de laboratoire concernant des formulations experimentales et commerciales du serotype H-14 de Bacillus thuringiensis. 3. Influence separee ou conjointe de la densite larvaire, du volume ou de la profondeur de l'eau et de la presence de terre sur l'efficacite et l'action larvicide residuelle d'une poudre primaire. Cahiers 0. R. S. T. O.M. entomologie me'dicale et parasitologie, XIX (3): 157-163 (1981). 102 N. RISHIKESH & G. QUELENNEC Annexe PROTOCOLE POUR L'ESSAI BIOLOGIQUE DES PREPARATIONS DE BACILLUS THURINGIENSIS, SEROTPYE H-14 1. Preparation bacterienne etalon L'etalon, IPS-78, peut etre obtenu aupres de l'Institut Pasteur de Paris.' I1 importe de respecter pour sa conservation et sa manipulation les recommandations du fournisseur: stocker a l'abri de la lumiere, a temperature de 2 a 5 °C; laisser revenir a la temperature ambiante avant d'ouvrir la boite en plastique afin d'eviter toute condensation; enfin, apres prelevement d'un echantillon, refermer herme- tiquement l'emballage et le replacer a temperature de 2 a 5 oC.b 2. Especes utilisees pour 1'essai On utilisera des larves d'Aedes aegypti, souche Bora Bora, en debut de quatrieme stade. On peut se procurer les oeufs necessaires pour etablir la colonie d'elevage en s'adressant a l'Institut Pasteur de Paris ou dans differents autres centres. Pour obtenir des larves au meme degre de developpement, on suscitera l'closion des ceufs a l'aide d'un stimulant, par exemple par addition d'acide ascorbique a raison de 100 mg/litre d'eau. Cela a pour effet de desoxygener l'eau, et tous les ceufs eclosent tres rapidement. On se procurera une bonne quantite d'aliments adequats pour les moustiques, afin d'eviter les variations que pourrait entrainer l'utilisation, dans le temps, de lots d'aliments differents. Ces aliments seront conserves au sec et au frais (5 C) de maniere a eviter leur infestation par des insectes ou leur infection par des moisissures. On nourrira les larves avec des quantites standardisees optimales d'aliments, selon un plan d'elevage normalise, a une temperature constante choisie dans la fourchette 22 °C-28 'C. Cette temperature ne doit pas varier d'une experience a l'autre. On recoltera les larves (a l'aide d'un tamis, par exemple, ou d'une pipette), a un age determine d'avance, quand elles viennent tout juste de muer au quatrieme stade. Si, pour des raisons de securite, Ae. aegypti se trouve etre inacceptable dans un pays, on prendra Culex quinquefasciatus ou C. pipiens. a Laboratoire de Lutte bacteriologique, Institut Pasteur, 25, rue du Dr Roux, 75724 Paris Cedex 15, France. b Le nouvel etalon provisoire, IPS-80, est maintenant disponible en flacon, sous forme de comprimes de 100 mg. Pour preparer une suspension de 1'etalon, on pesera a l'aide d'une balance de precision la quantite necessaire de produit, soit 20 mg au moins (en veillant a bien resceller ensuite le flacon et en le replaqant dans les conditions de conservation voulues, de preference dans un dessicateur). Cette suspension se conserve jusqu'a 6 mois au refrigerateur, et peut etre utilisee en plusieurs fois comme etalon pour des essais biologiques (note des auteurs). 3. Preparation de suspensions bacteriennes Peser une certaine quantite de la preparation bacterienne et l'homogeneiser dans un volume connu d'eau ne contenant absolument pas de chlore, et de preference desionisee ou distillee (ou dans de l'eau du robinet, que l'on a laisse s'aerer dans des recipients peu profonds pendant 24 h). Un homogeneiseur en verre, un moulin a boule ou un melangeur a couteaux rotatifs conviennent tres bien pour cette operation. Deposer sur une lame une anse de cette suspension initiale, recouvrir d'une lamelle et verifier (en contraste de phase) que tous les agglomerats se sont bien divises en cristaux et spores separes. Agiter vigoureusement la suspension initiale, et preparer une serie de cinq dilutions au moins (a' chaque fois x 0,8, par exemple) dans de l'eau ne renfermant pas de chlore. Agiter de nouveau apr&s chaque dilution. En ce qui concerne l'etalon propose IPS-80, une concentration mere de 0,4 mg/litre parait adequate. On utilisera pour les echantillons d'epreuve une serie de concentrations suffisante pour obtenir une bonne distribution des taux de mortalite. Agiter chaque dilution (par exemple secouer a la main 20 fois, en tournant), puis y introduire rapidement des larves de quatrieme stade en quantite adequate, soit une larve par 8 ml de suspension bacterienne (on aura une bonne densite en comptant par exemple 25 larves pour 150 ou 200 ml). Les larves ne doivent pas etre nourries pendant l'essai. On ne se servira pas de gobelets paraffines, qui pourraient bloquer les cristaux. Conserver a une temperature constante choisie dans la fourchette 23-27 °C, a l'obscurite ou sous faible eclairage, a l'abri de la lumiere solaire. II est souhaitable de limiter la duree d'exposition a 24 h. Ce temps d'exposition doit couvrir une periode d'alimentation active, en evitant la periode prepupale et la pupaison. 4. Nombre d'insectes et repetition des essais On procedera avec un nombre suffisant d'insectes a des essais assez nombreux pour arriver a un coefficient de variation n'excedant pas 207o -on pourra prendre par exemple 4 recipients contenant 25 larves par concentration, et 7 concentrations par produit bacterien a essayer, l'essai etant repete trois fois a jour different. L'objectif est d'obtenir au moins deux taux de mortalite de part et d'autre de la CL5o, dans la fourchette 10-900o de mortalite. I1 est indispensable, dans les essais repetes a jour different, de prendre a chaque fois un lot de poudre fraichement pese. ACTIVITt DES PRtPARATIONS DE BACILLUS THURINGIENSIS H-14 103 Une etude progressive des donnees, au fur et a me- sure que sont termines les essais successifs, permettra d'utiliser de faqon optimale les insectes dont on dispose.c Les caracteres importants a noter sont la dimension relative de la variation a l'interieur de l'essai (variation entre les valeurs de la CL50 dans les differents essais paralleles), ainsi que l'inclinaison des lignes de regression, qui reflechit en partie la variation a l'interieur du lot particulier d'insectes utilise. 5. Lecture de 1'essai Apres une exposition de 24 h exactement, compter le nombre de larves vivantes (les resultats sont bases sur les numerations de larves vivantes, en raison des tendances cannibales des larves aux concentrations les plus faibles).d Si la mortalite temoin depasse 10%, on ne tiendra pas compte de l'essai. Calculer les C BURGESS, H. D. & THOMPSON, E. M. Standardization and essay of microbial insecticides. In: BURESS, H. D. & HUSSEY, N. W. (ed.) Microbial control of insects. Londres, Academic Press, 1971. d Pour cette raison, il est suggere de noter le nombre exact de larves introduites au debut de 1'epreuve. II est recommande de proceder a une numeration supplementaire apres 48 h d'exposition (note des auteurs). mortalites en pourcentage, et trouver les valeurs de la CL5o par report sur papier log-probit, ou en utilisant un programme informatique avec transformation probit ou logit de la mortalite par rapport au logarithme de la concentration. I1 serait utile de dis- poser d'un programme informatique de ce genre, que pourraient utiliser des laboratoires non relies a un terminal d'ordinateur. Une petite calculatrice (de prix modere) fonctionne actuellement avec une bande preprogrammee. I1 devrait etre possible d'envoyer une bande adequatement programmee aux labora- toires qui en font la demande, ce qui entrainerait une plus grande uniformite dans le calcul des donnees de l'essai. 6. Calcul de 1'activite en unite de toxicite pour Aedes aegypti L'activite relative (P), en unites de toxicite, de la preparation etudiee, par rapport a l'etalon, est donnee par l'equation: p 1000 x CL5o etalon CL50 preparation etudi6e