Detection of influenza virus subtype A by polymerase chain reaction: WHO external quality assessment programme summary analysis, 2015 Introduction Global influenza virus surveillance has been conducted through the WHO Global Influenza Surveillance and Response System (GISRS) for over half a century.1 Currently there are 143 institutions in 113 WHO Member States recognized by WHO as National Influenza Centres (NICs). The laboratory network also comprises 6 WHO Collaborating Centres (CCs), 4 Essential Regulatory Laboratories and ad hoc groups set up to address specific emerging issues. Due to the continuous evolution and the pandemic potential of non-seasonal influenza viruses, timely surveillance and robust laboratory diagnostics are essential. The WHO external quality assessment programme (EQAP) for influenza virus subtype A detection by polymerase chain reaction (PCR) was initiated in 2007, aiming to monitor the quality and comparability of the performance of participating laboratories in routine molecular diagnosis and surveillance. The EQAP has extended its scope from influenza A(H5N1) to seasonal influenza A, influenza B and other nonseasonal influenza A viruses reported in human infections. Summaries of the performance of participating laboratories from panels 1 to 13 (2007 to 2014) have been reported in the Weekly Epidemiological Record.2–8 In 2015, the project continued under the coordination of WHO’s Global Influenza Programme, implemented by the H5 Reference Laboratory and National Influenza Centre at the Centre for Health Protection, Department of Health, Hong Kong Special Administrative Region (SAR), China, with support from WHO regional offices. The programme currently dispatches samples for testing once per year. This report summarizes the results of panel 14, which was dispatched to participating laboratories in 2015. Phenotypic/genotypic neuraminidase inhibitor (NAI) susceptibility testing for influenza 1 2 3 4 5 6 7 8
Détection des virus grippaux de type A par amplification génique: analyse sommaire du programme d’évaluation externe de la qualité de l’OMS, 2015 Introduction Depuis plus d’un demi-siècle, le Système mondial OMS de surveillance de la grippe et de riposte (GISRS) assure la surveillance des virus grippaux au niveau mondial.1 Il existe actuellement 143 établissements reconnus par l’OMS comme centres nationaux de lutte contre la grippe, répartis dans 113 États Membres. Le réseau de laboratoires comprend également 6 centres collaborateurs de l’OMS, 4 laboratoires essentiels de réglementation et des groupes spéciaux créés pour pour traiter de questions spécifiques qui se font jour. Compte tenu de la constante évolution des virus grippaux non saisonniers et de leur potentiel pandémique, il est indispensable de maintenir une surveillance en temps utile et des capacités solides de diagnostic en laboratoire. Le programme d’évaluation externe de la qualité (EQAP) de l’OMS, portant sur la détection des virus grippaux de type A par amplification génique (PCR), a été lancé en 2007; il vise à contrôler la qualité et la comparabilité des résultats de surveillance et de diagnostic moléculaire de routine obtenus par les laboratoires participants. L’EQAP a élargi son champ d’action au-delà du seul virus A(H5N1) pour inclure la grippe A saisonnière, la grippe B et d’autres virus grippaux A non saisonniers notifiés dans des cas d’infection humaine. Pour les séries 1 à 13 (2007 à 2014), une synthèse des résultats des laboratoires participants a été publiée dans les numéros correspondants du Relevé épidémiologique hebdomadaire.2-8 En 2015, le projet s’est poursuivi sous la coordination du Programme mondial de lutte contre la grippe de l’OMS, sa mise en œuvre étant assurée par le laboratoire de référence H5 et le Centre national de lutte contre la grippe relevant du Centre de protection sanitaire, Département de la santé, de Hong Kong (Région administrative spéciale (RAS) de la Chine), avec l’appui des bureaux régionaux de l’OMS. Dans le cadre du programme, des échantillons sont actuellement envoyés une fois par an aux laboratoires participants à des fins d’analyse. Le présent rapport récapitule les résultats de la série 14, dont les échantillons ont été envoyés aux laboratoires en 2015. Une analyse phénotypique/génotypique de la sensibilité 1 2 3 4 5 6 7 8
See http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/en/ See No. 45, 2008, pp. 401–412. See No. 48, 2009, pp. 493–504. See No. 3, 2011, pp. 17–24. See No. 3, 2012, pp. 29–36 See No. 4, 2013, pp. 37–48 See No. 4/5, 2014, pp. 37–44. See No. 3, 2015, pp. 9–16. o
Voir http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/en/ Voir No 45, 2008, p. 401-412. Voir No 48, 2009, p. 493-504. Voir No 3, 2011, p. 17-24. Voir No 3, 2012, p. 29-36 Voir No 4, 2013, p. 37-48 Voir No 4/5, 2014, p. 37-44. Voir No 3, 2015, p. 9-16.
RELEVE EPIDEMIOLOGIQUE HEBDOMADAIRE, N 1, 8 JANVIER 2016 3
A(H1N1)pdm09 viruses was also included on an optional basis.
aux inhibiteurs de la neuraminidase pour les virus grippaux A(H1N1)pdm09 était également incluse à titre facultatif.
Preparation of panel 14 Vacuum-dried triton X-100 inactivated influenza viruses were dispatched to participating laboratories. Viruses were grown in Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells, inactivated by triton X-100, and then prepared as described previously.2–8
Préparation de la série 14 Après inactivation par le triton X-100 et dessiccation sous vide, les virus grippaux ont été envoyés aux laboratoires participants. Ils ont été cultivés sur des cellules rénales canines Madin-Darby (MDCK), inactivés par le triton X-100, puis préparés selon les mêmes modalités que les séries précédentes.2-8
Composition of panel 14 Panel 14 consisted of 10 coded samples, represented by different concentrations of influenza viruses, including influenza A(H5N1) virus of genetic clades 2.2.1 and 2.3.2.1, influenza A(H1N1)pdm09 wild type virus and virus with H275Y amino acid substitution in the neuraminidase, influenza A(H3N2) virus, influenza A(H7N9) virus, influenza B virus (Victoria lineage) and a sample that contained no virus. Two influenza A(H1N1)pdm09 samples designated for phenotypic / genotypic testing of NAI susceptibility were included upon request. Details of the composition of the panel are shown in Table 1a and 1b. Participants were instructed to reconstitute each sample with PCR-grade water prior to testing. A questionnaire on the laboratory methods and gene targets used for the EQAP specimens was also included.
Composition de la série 14 La série 14 comportait 10 échantillons codés, contenant différentes concentrations de virus grippaux, dont des virus A(H5N1) appartenant aux clades génétiques 2.2.1 et 2.3.2.1, des virus A(H1N1)pdm09 de type sauvage ou porteurs de la substitution d’acides aminés H275Y sur la neuraminidase, des virus A(H3N2), des virus A(H7N9), des virus grippaux B (lignée Victoria) et un échantillon ne contenant aucun virus. Deux échantillons de virus grippal A(H1N1)pdm09 destinés à un test phénotypique/génotypique de sensibilité aux inhibiteurs de la neuraminidase ont été inclus sur demande dans cette série. La composition de la série est présentée en détail dans les Tableaux 1a et 1b. Les laboratoires participants ont reçu l’instruction de reconstituer chaque échantillon avec de l’eau ayant la qualité requise pour la PCR avant de procéder à l’analyse. Un questionnaire portant sur les méthodes de laboratoire et les cibles géniques utilisées pour les échantillons de l’EQAP a été joint.
Distribution of panel and response of participants NICs and other national influenza laboratories were invited to participate before the panels were dispatched. Panel 14 was dispatched between April 2015 and June 2015 from Hong Kong SAR to 174 participating laboratories from 137 countries in the 6 WHO regions at ambient temperature by courier service as previously described.8 Participating laboratories were requested to report results within 4 weeks after the date of sample reception. Of the 174 participating laboratories which received the panel, 123 (70.7%) received samples within one week of dispatch and 153 (87.9%) reported results before the closing date. The number of laboratories reporting results from different WHO regions on time for analysis in panel 14 is shown in Figure 1.
Distribution de la série d’échantillons et réponse des participants Les centres nationaux de lutte contre la grippe, ainsi que d’autres laboratoires nationaux de la grippe, ont été invités à participer au programme avant l’envoi des échantillons. Entre avril et juin 2015, les échantillons de la série 14 ont été envoyés de la Région administrative spéciale de Hong Kong à 174 laboratoires participants, situés dans 137 pays appartenant aux 6 Régions de l’OMS, à température ambiante et par un service d’acheminement rapide, comme décrit précédemment.8 Il a été demandé aux laboratoires de transmettre leurs résultats dans un délai de 4 semaines à compter de la date de réception des échantillons. Sur les 174 laboratoires participants, 123 (70,7%) ont reçu les échantillons dans la semaine suivant leur expédition et 153 (87,9%) ont transmis leurs résultats avant la date de clôture. Le nombre de laboratoires ayant transmis les résultats de la série 14 à temps pour l’analyse dans chaque Région de l’OMS est indiqué dans la Figure 1.
Methods of detection Various PCR protocols and testing strategies were used by participating laboratories for the detection of influenza type A and B viruses and subtyping of influenza A(H1N1)pdm09, A(H3), A(H5) and A(H7) viruses as described for previous panels.2–8 More than half of the participants used US Centers for Disease Control and Prevention (CDC) protocols. Use of different PCR protocols did not yield apparent differences in performance. Details on target genes, detection methods and source of primers/probes and enzymes used were included in the summary report of performance that was distributed to all participants. 4
Méthodes de détection Comme pour les séries précédentes,2-8 les laboratoires participants ont employé divers protocoles de PCR et différentes stratégies d’analyse pour détecter les virus grippaux des types A et B et déterminer le sous-typage des virus A(H1N1)pdm09, A(H3), A(H5) et A(H7). Plus de la moitié des laboratoires ont utilisé les protocoles des Centers for Disease Control and Prevention (CDC) des États-Unis. L’utilisation de différents protocoles de PCR ne s’est pas traduite par une variation manifeste des résultats. Les détails sur les gènes cibles, les méthodes de détection et l’origine des amorces/sondes et enzymes utilisées figuraient dans le compte rendu analytique des résultats qui a été distribué à tous les laboratoires participants. WEEKLY EPIDEMIOLOGICAL RECORD, NO 1, 8 JANUARY 2016
Table 1a Panel composition and results of Panel 14 (2015) of the WHO external quality assessment programme to detect influenza viruses Tableau 1a Composition et résultats de la série 14 (2015) du programme d’évaluation externe de la qualité de l’OMS pour la détection des virus grippaux No. (%) of laboratories correctly identifying sample (n=153) – Nombre (%) de laboratoires ayant correctement identifié l’échantillon (n = 153) 150 (98.0) 149 (97.4) 144 (94.1) 142 (92.8) 151 (98.7) 148 (96.7) 148 (96.7) 141 (92.2) 150 (98.0) 150 (98.0)
Influenza viruses – Virus grippaux
Virus/Cladea – Virus/Cladea
Sample number – Numéro de l’échantillon
Copies/μlb
A(H5N1) A(H5N1) A(H5N1) A(H5N1) A(H1N1)pdm09 A(H1N1)pdm09 A(H3N2) A(H7N9) B Negative – Négatif a
2.2.1 2.2.1 2.3.2.1 2.3.2.1 A/California/7/2009-like virus – Analogue à A/California/7/2009 A/California/7/2009-like virus – Analogue à A/California/7/2009 A/Switzerland/9715293/2013-like virus – Analogue à A/Switzerland/9715293/2013 A/Hong Kong/5731/2014 B/Brisbane/60/2008-like virus (Victoria lineage) – Analogue à B/Brisbane/60/2008 (lignée Victoria) NA – SO
V03-2015c V09-2015 V02-2015 V05-2015 V01-2015 V07-2015 V08-2015 V10-2015 V06-2015 V04-2015
3.32 x 102 1.31 x 102 3.28 x 10 2
7.41 x 101 1.90 x 102 1.81 x 10 2
1.34 x 102 1.04 x 103 1.73 x 102 NA – SO
The nomenclature of influenza A(H5N1) was based on the HA gene. For additional information, see http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/h5n1_nomenclature/en/ – La nomenclature des virus A(H5N1) est basée sur le gène HA. Pour en savoir plus, consulter http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/h5n1_nomenclature/en/ Measured by real-time RT-PCR after 5 days of storage of inactivated virus at 25°C. – Mesuré par PCR en temps réel après 5 jours de conservation du virus inactivé à 25° C.
b
NA: not applicable. – SO: sans objet
Table 1b Details of influenza A(H1N1)pdm09 samples for the optional neuraminidase inhibitor susceptibility testing Tableau 1b Échantillons de virus grippaux A(H1N1)pdm09 inclus pour l’analyse facultative de la sensibilité aux inhibiteurs de la neuraminidase Amino acid substitutiona (Nucleotide change detected) – Substitution d’acides aminésa (modification nucléotidique détectée) H275Y (C823T) No. of participants with correct results – Nbre de laboratoires obtenant des résultats corrects Genotypic – Génotypique (n=33) 33 Phenotypic – Phénotypique (n=24) 24
Sample No. – No de l’échantillon
Oseltamivir
Zanamivir
NAI01-2015
(Highly) reduced inhibition – Inhibition (fortement) réduite Normal inhibition – Inhibition normale
Normal inhibition – Inhibition normale Normal inhibition – Inhibition normale
NAI02-2015
Wild type – Type sauvage
31
24
a
Residue position in N1 neuraminidase numbering of A/California/7/2009 H1pdm09-like virus. – Position du résidu dans la numérotation N1 de la neuraminidase du virus de type A/California/7/2009 H1pdm09.
Performance of laboratories Only results returned within the designated closing date from the 153 laboratories were included in the analysis. Based on the same assessment criteria for panels 1–13,2–8 125 of the 153 (81.7%) participating laboratories returned correct results for all 10 samples, and 136 (88.9%) correctly identified all 4 influenza A(H5) samples. Two different influenza A(H5N1) viruses were included. The first was an avian influenza A(H5) virus of clade
Résultats des laboratoires Seuls les résultats transmis par 153 laboratoires dans les délais fixés ont été inclus dans l’analyse. Selon les mêmes critères d’évaluation que pour les séries 1 à 13,2-8 125 des 153 laboratoires participants (81,7%) ont fourni des résultats corrects pour l’ensemble des 10 échantillons et 136 (88,9%) ont correctement identifié les 4 échantillons de virus grippaux A(H5). Deux virus grippaux A(H5N1) différents ont été inclus dans la série. Le premier était un virus aviaire A(H5) du clade 2.2.1
RELEVE EPIDEMIOLOGIQUE HEBDOMADAIRE, No 1, 8 JANVIER 2016 5
Figure 1 Number of laboratories reporting results in the WHO external quality assessment programme for detection of influenza A and B viruses from different WHO regions, panel 14 (2015) Figure 1 Nombre de laboratoires transmettant leurs résultats au programme d’évaluation externe de la qualité (EQAP) de l’OMS pour la détection des virus grippaux A et B dans les différentes Régions de l’OMS, série 14 (2015) European Region – Région européenne: 58 (37,9%)
Eastern Mediterranean Region – Région de la Méditerranée orientale: 12 (7,8%)
South-East Asia Region – Région de l’Asie du Sud-Est: 7 (4,6%)
Region of the Americas – Région des Amériques: 30 (19,6%)
Western Pacific Region – Région du Pacifique occidental: 23 (15%)
African Region – Région africaine: 23 (15%)
2.2.1 (represented as V03-2015 and V09-2015 in different concentrations). The rates of correct detection were 150/153 (98.0%) and 149/153 (97.4%) respectively. The second was a human influenza A(H5) virus of clade 2.3.2.1 (represented as V02-2015 and V05-2015 in different concentrations). The rates of correct detection were 144/153 (94.1%) and 149/153 (97.4%) respectively. For the influenza A(H1N1)pdm09 samples, the rates of correct detection for V01-2015 and V07-2015 were 151/153 (98.7%) and 148/153 (96.7%) respectively. For the influenza A(H3N2) sample (V08-2015) and influenza B Victoria lineage sample (V06-2015), 148/153 (96.7%) and 150/153 (98.0%) laboratories reported correct results respectively. The rate of correct detection for the influenza A(H7N9) sample (V10-2015) was 141/153 (92.2%). The sample was correctly reported as influenza A(H7) (n=107), influenza A(H7N9) (n=20) or influenza A untypeable (n=14, for participants who did not indicate performance of H7 testing). Three participating laboratories reported positive results for the negative sample (V04-2015). The false-positive rate was 2.0% (Table 1a). In this panel, 28/153 (18.3%) participants reported incorrect results. Altogether 15/153 (9.8%) participants returned one incorrect result and 13/153 (8.5%) returned more than one incorrect result (Table 2). The details are presented in Table 3. 6
(représenté par les échantillons V03-2015 et V09-2015 à différentes concentrations). Le taux de détection correcte de ces échantillons était de 150/153 (98,0%) et 149/153 (97,4%), respectivement. Le second était un virus humain A(H5) du clade 2.3.2.1 (représenté par les échantillons V02-2015 et V05-2015 à différentes concentrations). Le taux de détection correcte de ces échantillons était de 144/153 (94,1%) et 149/153 (97,4%) respectivement. Pour le virus grippal A(H1N1)pdm09, le taux de détection correcte des échantillons V01-2015 et V07-2015 était de 151/153 (98,7%) et 148/153 (96,7%), respectivement. Pour les échantillons de virus grippal A(H3N2) (V08-2015) et de virus grippal B de la lignée Victoria (V06-2015), 148/153 laboratoires (96,7%) et 150/153 laboratoires (98,0%), respectivement, ont transmis des résultats corrects. Pour l’échantillon de virus grippal A(H7N9) (V10-2015), le taux de détection correcte était de 141/153 (92,2%). L’échantillon a été correctement identifié comme étant un virus A(H7) (n = 107), un virus A(H7N9) (n = 20) ou un virus de type A ne pouvant être typé (n = 14, laboratoires n’ayant pas signalé d’analyse H7). Trois laboratoires participants ont notifié un résultat positif pour l’échantillon négatif (V04-2015), soit un taux de faux positifs de 2,0% (Tableau 1a). Dans cette série, 28 des 153 laboratoires participants (18,3%) ont transmis des résultats incorrects. Globalement, 15 laboratoires sur 153 (9,8%) ont obtenu un résultat incorrect et 13 sur 153 (8,5%) en ont obtenu plusieurs (Tableau 2). Ces résultats sont présentés en détail dans le Tableau 3. WEEKLY EPIDEMIOLOGICAL RECORD, NO 1, 8 JANUARY 2016
Table 2 Performance of participating laboratories in the external quality assessment programme, panel 14 (2015) Tableau 2 Résultats des laboratoires participant au programme d’évaluation externe de la qualité, série 14 (2015) Performance – Résultats 10 samples correct – 10 échantillons corrects 9 samples correct – 9 échantillons corrects 6–8 samples correct – 6-8 échantillons corrects <6 samples correct – <6 échantillons corrects No. (%) of laboratories (n=153) – Nombre (%) de laboratoires (n = 153) 125 (81.7) 15 (9.8) 11 (7.2) 2 (1.3)
Table 3 Details of incorrect results reported by participating laboratories in the external quality assessment programme, panel 14 (2015) Tableau 3 Détails des résultats incorrects rendus par les laboratoires participant au programme d’évaluation externe de la qualité, série 14 (2015) Samples – Échantillons Number of participants reporting – Nombre de laboratoires ayant notifié des résultats Influenza A untypeable – Virus grippaux A ne pouvant être typés 7 2 9 1 A(H3) A(H3)v A(H5) A(H7) A untypeablea – A ne pouvant être typéa 1 0 1 1 1 6 B Negative – Négatif 1 0 2 1 Negative – Négatif 0 NA – SO 0 1 0 3 Total 9 3 11 4 Total
Influenza A(H5) – Virus Other influenza A subtype – Autres sousgrippaux A(H5) types grippaux A V02-2015 /clade 2.3.2.1 V03-2015 /clade 2.2.1 V05-2015 /clade 2.3.2.1 V09-2015 /clade 2.2.1 Non-influenza A(H5) – Virus grippaux non A(H5) V01-2015/ A(H1N1)pdm09 V04-2015/ Negative – V04-2015/Négatif V06-2015/ B Victoria V07-2015/ A(H1N1)pdm09 V08-2015/ A(H3) V10-2015/ A(H7) a
1 1 0 2 A(H1N1)pdm09
NA – SO 0 0 NA – SO 4 0
1 0 1 0 NA – SO 1
0 0 0 1b 0 0
0 1 0 1 0 1
0 0 1 0 0 NA – SO
0 2 NA – SO 1 0 1
2 3 3 5 5 12
Only includes laboratories that have indicated performance of the specific typing assay. – Inclut uniquement les laboratoires ayant indiqué que l’essai spécifique de typage a été réalisé. Transcription error: A(H3)v test was not performed by this participant. – Erreur de transcription: test A(H3)v pas effectué par ce participant.
b
NA: not applicable. – SO: sans objet
Phenotypic / genotypic neuraminidase inhibitor susceptibility testing Two influenza A(H1N1)pdm09 samples, namely NAI012015 (associated with highly reduced neuraminidase inhibition by oseltamivir) and NAI02-2015 (wild type), were included for the NAI susceptibility testing. Altogether 38/153 (24.8%) participants reported NAI results, in which 33 and 24 participants returned results for genotypic and phenotypic testing respectively, and 19 participants performed both tests. For the genotypic testing, all 33 participants reported NAI01-2015 to be associated with (highly) reduced inhibition by oseltamivir with nucleotide change (C823T) in the NA gene corresponding with H275Y (H274Y in N2 NA numbering) amino acid substitution. Three participants also reported (highly) reduced inhibition by peramivir. For NAI02-2015, 31/33 (93.9%) reported
Test phénotypique/génotypique de sensibilité aux inhibiteurs de la neuraminidase Deux échantillons de virus A(H1N1)pdm09, c’est-à-dire NAI012015 (associé à une forte réduction de l’inhibition de la neuraminidase par l’oseltamivir) et NAI02-2015 (de type sauvage), ont été inclus dans la série à des fins d’analyse de la sensibilité aux inhibiteurs de la neuraminidase. En tout, 38 des 153 laboratoires participants (24,8%) ont transmis des résultats sur la sensibilité aux inhibiteurs de la neuraminidase, 33 d’entre eux ayant effectué un test génotypique, 24 un test phénotypique et 19 ayant procédé aux deux types de test. Pour le test génotypique, les 33 laboratoires concernés ont tous signalé que l’échantillon NAI01-2015 était associé à une (forte) réduction de l’inhibition par l’oseltamivir, avec une modification nucléotidique (C823T) sur le gène NA correspondant à une substitution d’acide aminé H275Y (H274Y suivant la numérotation N2). Trois laboratoires participants ont également indiqué une (forte) réduction de l’inhibition par le peramivir. Pour
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wild-type influenza A(H1N1)pdm09 while 2 (6.1%) reported a mixture of mutant and wild-type virus with reduced neuraminidase inhibition by oseltamivir.
l’échantillon NAI02-2015, 31 des 33 laboratoires (93,9%) ont notifié un virus grippal A(H1N1)pdm09 de type sauvage, tandis que 2 (6,1%) signalaient un mélange de virus mutant et de virus de type sauvage, avec une baisse de l’inhibition de la neuraminidase par l’oseltamivir. Ces 33 laboratoires participants ont eu recours à diverses méthodes: 21 d’entre eux (63,6%) ont utilisé la discrimination allélique par RT-PCR en temps réel, 12 (36,4%) le séquençage Sanger, 4 (12,1%) le pyroséquençage et 1 (3,0%) l’analyse de la courbe de fusion. Cinq participants ayant utilisé le séquençage Sanger ont indiqué qu’ils avaient eu recours à plus d’une méthode. Pour le test phénotypique, les 24 laboratoires participants ont tous transmis des résultats corrects. Pour l’échantillon NAI012015, 23 laboratoires ont fait état d’une forte réduction de l’inhibition par l’oseltamivir et 1 laboratoire a indiqué une réduction de l’inhibition. Pour l’échantillon NAI02-2015, les 24 participants ont tous correctement signalé une inhibition normale par l’oseltamivir. Les deux échantillons présentaient une inhibition normale par le zanamivir. Sur les 24 laboratoires participants, 19 ont communiqué des résultats, tous corrects, sur le zanamivir. Deux méthodes principales ont été utilisées pour l’analyse phénotypique: l’épreuve NA-Star par chimiluminescence (n = 3) et le test fluorimétrique avec substrat MUNANA (n = 21). Le Tableau 4 fournit un récapitulatif des valeurs de CI50 obtenues par les deux méthodes.
Among these 33 participants, various methods were used, including: allelic discrimination by real-time RT-PCR used by 21 (63.6%); Sanger sequencing used by 12 (36.4%); pyrosequencing used by 4 (12.1%); and melting curve analysis used by 1 (3.0%). Five participants using Sanger sequencing reported using more than one method. For phenotypic testing, all the 24 participants reported correct results. For NAI01-2015, 23 participants reported highly reduced inhibition by oseltamivir and 1 reported reduced inhibition. For NAI02-2015, all the 24 participants correctly reported normal inhibition by oseltamivir. Both samples had normal inhibition by zanamivir. Of the 24 participants, 19 also reported results for zanamivir and all were correct. Two major methodologies were used for phenotypic testing: chemiluminescence-based NA-Star assay (n=3) and fluorescence-based MUNANA assay (n=21). IC50 values obtained by both methods are summarized in Table 4.
Discussion The number of laboratories participating in the EQAP has remained fairly stable since panel 8 in 2010 (Figure 2). Among these panels the average correct rate for all samples and influenza A(H5) detection were 80% and 88% respectively, compared to 82% and 89% in panel 14. The subtyping performance for influenza A(H5N1) genetic clade 2.2.1 (299/306 = 97.7%) and 2.3.2.1 (286/306= 93.5%) was good in this panel. It was noted that different participants reported different interpreta-
Discussion Le nombre de laboratoires participant à l’EQAP est resté relativement stable depuis la série 8 en 2010 (Figure 2). Sur l’ensemble des séries, le taux moyen de résultats corrects pour tous les échantillons et pour la détection des virus grippaux A(H5) s’élève à 80% et 88% respectivement, contre 82% et 89% pour la série 14. Dans cette série, de bons résultats ont été obtenus pour le soustypage des virus grippaux A(H5N1) des clades génétiques 2.2.1 (299/306 = 97,7%) et 2.3.2.1 (286/306 = 93,5%). On a constaté que différents laboratoires ont fait une interprétation différente
Table 4 IC50 values obtained by phenotypic neuraminidase inhibitor susceptibility testing Tableau 4 Valeurs CI50 obtenues pour le test phénotypique de sensibilité aux inhibiteurs de la neuraminidase NAI01–2015 NAI02–2015 Observed fold differenceb – Facteur de différence observéb
Drug – Médicament
Assay – Épreuve
Number of datasets – Substrate – Nombre de Substrat séries de données NA-Star MUNANA NA-Star MUNANA 3 20a 3 16
IC50 values (nM) – Valeurs de CI50 (nM) Median – Valeur médiane 132.50 246.53 1.05 0.52 Range – Intervalle 72.57–212.21 81.64–790.00 0.80–1.11 0.35–0.80 Median – Valeur médiane 0.46 0.55 0.73 0.33 Range – Intervalle 0.37–0.60 0.10–2.40 0.70–1.16 0.13–1.10
Oseltamivir
Chemiluminescence-based – Par chimiluminescence Fluorescence-based – Fluorimétrique
158–358 187–3500 <10 <10
Zanamivir
Chemiluminescence-based – Par chimiluminescence Fluorescence-based – Fluorimétrique
a
One dataset with IC50 value with order of magnitude of 104 was considered as outlier and not presented. – Une série de données avec une CI50 d’un ordre de grandeur de 104 a été considérée comme aberrante et n’a donc pas été présentée. Observed fold difference: Fold difference between NAI01-2015 and NAI02-2015 as reported by each participant. – Facteur de différence observé: facteur de différence signalé par chaque participant entre NAI01-2015 et NAI02-2015. WEEKLY EPIDEMIOLOGICAL RECORD, NO 1, 8 JANUARY 2016
b
8
Figure 2 Performance of laboratories participating in the WHO external quality assessment programme for detection of influenza A and B viruses, panels 1–14, 2007–2015 Figure 2 Performance des laboratoires participants au programme d’évaluation externe de la qualité (EQAP) de l’OMS pour la détection des virus grippaux A et B, séries 1-14, 2007-2015
180 160 77% No. of laboratories – Nombre de laboratoires
88% 80% 82% 82% 82%
90% 91% 90% 89% 85% 86%
100% 88% 89% 83% 82% 82% 71% 60% 50% 82% 89% 90% 80% 70% Proportion of laboratories – Proportion de laboratoires
140 120 67% 100 80 60 40 20 0 54 83 95 114 65% 74% 77% 76%
79%
77% 78%
158 128 139 109
158
159
163
158
156
153
40% 30% 20% 10% 0%
1
2
3
4
5
6
7 8 Panel – Série
9
10
11
12
13
14
No. of laboratories – Nombre de laboratoires
All correct % – Tous les résultats sont corrects (%)
All H5 correct % – Tous les résultats A(H5) sont corrects (%)
tions (influenza A(H5) or untypeable influenza A) based on similar H5 subtyping Ct values. This is likely due to adoption of different cut-off Ct values for interpretation, with 2 participants reporting false negative results for H5 in this panel. Repeat testing or performing alternative confirmatory tests on samples with high Ct values close to the cut-off could be considered.
des valeurs Ct semblables obtenues pour le sous-typage H5, certains concluant à un virus A(H5) et d’autres à un virus de la grippe A ne pouvant être typé. Cela s’explique probablement par l’utilisation de différentes valeurs seuil de Ct pour l’interprétation, 2 laboratoires participants ayant notifié des résultats faux négatifs pour H5 dans cette série. Une répétition du test ou la réalisation d’autres tests de confirmation pourraient être envisagées pour les échantillons présentant des valeurs élevées de Ct proches du niveau seuil. Pour l’échantillon de virus grippal A(H7N9), le taux de résultats corrects de détection a augmenté, passant de 135/156 (86,5%) pour la série 13 à 141/153 (92,2%) pour la série 14, atteignant ainsi un niveau comparable aux taux obtenus pour les virus grippaux saisonniers. Le nombre de laboratoires ayant effectué un test de sous-typage H7 a également augmenté, passant de 114/156 (73,1%) pour la série 13 à 136/153 (88,9%) pour la série 14. Cette amélioration témoigne de la meilleure capacité des laboratoires à détecter les virus grippaux A(H7), qui continuent d’être signalés dans des cas d’infection humaine. La raison pour laquelle 6 laboratoires ont signalé un résultat négatif bien qu’ayant effectué un test de sous-typage H7 n’a pu être identifiée. Deux de ces laboratoires ont indiqué que l’échantillon avait été soumis à deux tests successifs, et un laboratoire a transmis un résultat négatif bien qu’ayant obtenu des valeurs élevées répétées de Ct pour chaque test.
For the influenza A(H7N9) sample, the correct rate of detection increased from 135/156 (86.5%) in panel 13 to 141/153 (92.2%) in panel 14, which is comparable to that for seasonal influenza viruses. The number of participants performing H7 testing also increased to 136/153 (88.9%) in panel 14 from 114/156 (73.1%) in panel 13. The improvement reflected better preparedness for the detection of influenza A(H7) virus, which continued to be reported in human infections. For the 6 participants who reported a negative result despite performing H7 testing, no obvious reason could be identified. Two of these participants reported testing the sample twice sequentially, and one reported a negative result despite obtaining repeatable high Ct values in each test run.
RELEVE EPIDEMIOLOGIQUE HEBDOMADAIRE, No 1, 8 JANVIER 2016 9
The false positive rate dropped to 2.0% (3/153) in panel 14, as compared to 3.8% (6/156) in panel 13. However, sample swapping, transcription error and inconsistent use of controls were noted, highlighting the importance of good laboratory practice. In addition, in view of continuous virus evolution, regular evaluation to ensure continued sensitivity of the test method, and sending unsubtypable influenza A samples/isolates to WHO CCs for further characterization, are strongly recommended. In panel 14, phenotypic and genotypic NAI susceptibility testing was included on an optional basis. An influenza A(H1N1)pdm09 sample with NA H275Y substitution associated with reduced inhibition to oseltamivir (NAI01-2015) and a wild-type virus (NAI02-2015) were included. The performance was very good in general. For the 2 participants reporting NAI02-2015 as a mixture of wild-type and NA H275Y mutant virus by genotypic testing alone, the use of Sanger sequencing and allelic discrimination real-time RT-PCR were reported. The incorrect results were possibly due to the samples having high viral loads, increasing the risk of crosscontamination. Two other participants who reported using Sanger sequencing did not provide genotyping results for NAI02-2015. This is possibly related to compromised assay sensitivity for the inactivated samples, where alternative protocols with shorter amplicon size might be more successful.
Le taux de faux positifs est tombé à 2,0% (3/153) dans la série 14, alors qu’il était de 3,8% (6/156) dans la série 13. Cependant, des échanges d’échantillons, des erreurs de transcription et une utilisation non systématique de témoins ont été observés, soulignant l’importance des bonnes pratiques de laboratoire. En outre, compte tenu de la constante évolution des virus, il est fortement recommandé d’évaluer régulièrement la méthode d’analyse pour vérifier qu’elle demeure sensible et d’envoyer les échantillons/isolats de grippe A ne pouvant être sous-typés aux centres collaborateurs de l’OMS où ils pourront être caractérisés de manière plus précise. Dans la série 14, l’analyse génotypique et phénotypique de la sensibilité aux inhibiteurs de la neuraminidase a été incluse à titre facultatif. Elle portait sur un échantillon de virus A(H1N1) pdm09, présentant une substitution H275Y sur la neuraminidase et associé à une réduction de l’inhibition par l’oseltamivir (NAI01-2015), ainsi que sur un échantillon de virus A(H1N1) pdm09 de type sauvage (NAI02-2015). De manière générale, les résultats de cette analyse ont été très bons. Les 2 laboratoires ayant signalé que l’échantillon NAI02-2015 contenait un mélange de virus de type sauvage et de virus mutant avec substitution H275Y sur la NA sur la base du seul test génotypique ont indiqué qu’ils avaient utilisé les méthodes de séquençage Sanger et de discrimination allélique par RT-PCR en temps réel. Ces résultats incorrects s’expliquent peut-être par une forte charge virale des échantillons, entraînant un risque accru de contamination croisée. Deux autres laboratoires participants ayant utilisé le séquençage Sanger n’ont pas transmis de résultats de génotypage pour NAI02-2015. Cela pourrait être lié à une sensibilité insuffisante du test pour les échantillons inactivés et il est possible que d’autres protocoles utilisant un amplicon plus court donnent de meilleurs résultats. Toutes les interprétations phénotypiques notifiées étaient correctes. Les valeurs de CI50 signalées pour NAI01-2015 avec l’oseltamivir variaient d’un laboratoire à l’autre en raison des différences de substrats et de protocoles utilisés pour l’analyse. Toutefois, la comparaison des valeurs de CI50 entre le virus de sensibilité réduite (NAI01-2015) et le virus de sensibilité normale (NAI02-2015) révèle un écart d’un facteur supérieur à 100 dans tous les laboratoires participants. Ce résultat est compatible avec les critères établis par l’OMS pour indiquer que l’échantillon NAI01-2015 est associé à une forte réduction de l’inhibition par l’oseltamivir. Le laboratoire participant qui a signalé une inhibition réduite par l’oseltamivir pour NAI012015 n’a pas indiqué quel critère d’interprétation avait été adopté. Environ 25% des laboratoires participants ont communiqué des résultats de sensibilité aux inhibiteurs de la neuraminidase pour la série 14, une proportion comparable aux séries 12 et 13. Trois laboratoires qui n’avaient pas demandé d’échantillons destinés à l’analyse de la sensibilité aux inhibiteurs de la neuraminidase ont notifié des résultats corrects de test génotypique de sensibilité pour les 2 échantillons de virus A(H1N1)pdm09, V01-2015 et V07-2015. À l’avenir, pour que leurs résultats soient inclus dans l’analyse finale, les laboratoires sont invités à confirmer leur participation aux essais de sensibilité et à demander à recevoir les échantillons prévus à cette fin. Par ailleurs, environ 15% des laboratoires participants ont fourni des résultats issus de l’analyse phénotypique de la sensibilité aux inhibiteurs de la neuraminidase, épreuve incluse pour la première fois dans cette série; la plupart des résultats venaient de la Région euroWEEKLY EPIDEMIOLOGICAL RECORD, NO 1, 8 JANUARY 2016
All reported phenotypic interpretations were correct. Reported IC50 values for NAI01-2015 to oseltamivir among participants were varied due to differences in testing substrates and protocols. However, when comparing the IC50 values between the virus with reduced susceptibility (NAI01-2015) and the susceptible virus (NAI02-2015), the observed fold difference values for all participants were more than 100. This matched the WHO criteria to indicate that NAI01-2015 is associated with highly reduced inhibition by oseltamivir. For the participant who reported NAI01-2015 to have reduced inhibition by oseltamivir, the adopted interpretation criterion was not reported. Around 25% of participants reported NAI susceptibility results in panel 14 which is similar to panels 12 and 13. Three participants who did not request NAI samples reported correct genotypic NAI results on the 2 influenza A(H1N1)pdm09 samples V01-2015 and V07-2015. To ensure that test results can be included in the performance analysis, participants are encouraged to confirm participation in susceptibility testing in future and to request the appropriate samples. On the other hand, around 15% of the participants returned results in the phenotypic NAI susceptibility testing which was initiated in this panel, most from the European Region (n=15), followed by the Western Pacific Region (n=4), the Region of the Americas (n=3) and the South-East Asia Region (n=2). The coverage and good results indi10
cate that the methodology has been well established in some laboratories. In view of the growing importance of antiviral susceptibility surveillance, further strengthening of capacity globally basis would be beneficial, WHO EQAP will continue to develop the programme and consider implementing a scoring system.
péenne (n=15), suivie de la Région du Pacifique occidental (n=4), de la Région des Amériques (n=3) et de la Région de l’Asie du Sud-Est (n=2). Le taux de couverture et les bons résultats obtenus pour cette méthode indiquent qu’elle est déjà bien établie dans certains laboratoires. Compte tenu de l’importance croissante de la surveillance de la sensibilité aux antiviraux, il serait bénéfique de renforcer ces capacités à l’échelle mondiale; l’EQAP de l’OMS continuera à développer ce programme et envisagera de mettre en œuvre un système de notation.
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