Nouvelles données sur les vecteurs de Wuchereria bancrofti à Madagascar : influence de la température sur la vitesse de développement du parasite et le taux d'infection du vecteur

Bull. Org. mond. Santt 11969, 40, 763-769 Bull. Wid Hith Org. Nouvelles donnees sur les vecteurs de Wuchereria bancrofti 'a Madagascar Influence de la temperature sur la vitesse de developpement du parasite et le taux d'infection du vecteur * J. BRUNHES 1 Trois especes de moustiques ont ete reconnues comme des vecteurs naturels de Wuche- reria bancrofti a Madagascar: Anopheles funestus, A. gambiae et Culex pipiens fatigans. Les essais d'infection experimentale ont abouti au developpement de W. bancrofti chez A. gambiae A et B, A. coustani, A. mascarensis, Culex p. fatigans et Culex antennatus. En laboratoire, une hausse de la tempe'rature ambiante accelere l'evolution du parasite chez le vecteur. Eleves a 20°C, 25°C et 30°C, les insectes femelles gorges sur filariens sont porteurs de stades infectants respectivement apres 27, 14 et 11 jours. La tempe'rature a egalement une influence, variable selon l'espece, sur le taux d'infection et la capacite de transmission des vecteurs. Suivant l'auteur, il semble justifie d'attribuer, du moins en partie, aux conditions climatiques regnant a Madagascar l'inegalite de la repartition de l'endemie filarienne sur l'fle. Madagascar est une ile montagneuse que l'on peut sch6matiquement diviser en trois regions clima- tiques: la c6te est, battue par la mousson, les hauts plateaux (1000 A 1400 m), la cote ouest, s6che et chaude. Les moyennes mensuelles des tempe'ratures ho- raires prises sous abri varient beaucoup suivant ces regions: sur la c6te est, 'a Tamatave, elles varient de 20,8°C en juillet A 26,3°C en f6vrier; sur les hauts plateaux, 'a Tananarive, les moyennes mensuelles des tempe'ratures ne d6passent jamais 19°C et varient entre 12,2°C en juillet et 18,9°C en janvier; sur la c6te ouest, A Majunga, elles passent de 25,4°C en juillet A 29°C en avril. Or toutes les enquetes sur la repartition g6ogra- phique de 1'end6mie filarienne (filariose 'a Wuchereria bancrofti) font apparaitre que la maladie est tres in6galement r6partie dans les trois regions distingu6es ci-dessus. Observons la carte (fig. 1) sur laquelle figurent les isothermes de la temp6rature moyenne de fevrier et les cantons oLu ont e't d6pist6s des filariens (Brygoo, * Ces recherches ont beneficie d'une aide financiere de l'Organisation mondiale de la Sante. 1 Charg6 de Recherches au Centre de Tananarive de l'Office de la Recherche Scientifique et Technique Outre-Mer, Tananarive, Republique malgache. 1958; Brygoo & Grjebine, 1957). Elle montre, et c'est la son interet essentiel, qu'il y a tres peu de cantons infestes dans la zone delimitee par l'iso- therme de 20°C, isotherme qui recouvre en grande partie les hauts plateaux. Signalons de plus qu'il s'agit dans ces cantons de depistages isoles et que l'origine de l'infection ne se situe pas obligatoirement sur les hauts plateaux. D'autre part, le petit nombre de cantons infest6s figurant sur la cote ouest peut partiellement s'expliquer par un moindre niveau d'endemicite, par une densite de population faible ainsi que par l'absence de prospection dans de tres vastes zones. Afin de mieux comprendre les raisons de l'inegalite dans la repartition de l'endemie filarienne qui appa- raft malgre tout sur cette carte, il nous a semble essentiel de tester le pouvoir vecteur de quelques moustiques particulierement agressifs pour l'homme et d'apprecier l'influence des conditions climatiques sur le developpement des microfilaires chez les vecteurs reconnus. VECTEURS EFFECTIFS ET EXPERIMENTAUX Especes naturellement infectees par W. bancrofti Anopheles funestus. Lors d'une enquete effectu&e en 1951 a Vangaindrano, Doucet a trouve 8,3% 2333 - 763 - 9 764 J. BRUNHES FIG. I ISOTHERMES DE LA TEMPERATURE MOYENNE DE FtVRIER A MADAGASCAR ET REPARTITION DES CANTONS INFESTtS a ~.26 * 26 26 . 24 0-1~~~~~~ 00 2 60 a Chaque point marque 1'emplacement d'un canton infestd. (I/1/20)d'A. funestus porteurs de filaires infectantes. Malheureusement, ces stades III n'ont pas ete' conserv6s, ni determine's. En 1966-1967, plus au nord, dans la region de Manakara, nous avons disse'que' 214 femelles de cette espece; 7 d'entre elles e'taient porteuses de stades III de W. bancrofti et 6 autres porteuses de stades I et II non identifiables; une des femelles por- tait A la fois des stades II et I.1 2 Ces determinations ont 0effectuees par le Professeur G. S. Nelson, London School of Hygiene and Tropical Medicine. Anopheles gambiae s.l. Sur 239 dissections effec- tu&es en differents points de la c6te est, nous n'avons trouve que trois femelles infectees, l'une par un stade II non identifiable, les deux autres par des stades III de W. bancrofti. Culex pipiens fatigans. Un lot de femelles gorgees, captur6es a domicile dans la ville de Majunga (cote ouest) et ramenees a Tananarive pour obtenir des pontes, nous a donne plusieurs stades infectants de W. bancrofti, apres 14 a 16 jours de captivit6. On peut donc etre certain de l'existence a Majunga d'une transmission par cette espece si la longevite naturelle de Culex p. fatigans atteint une quinzaine de jours. Espeices permettant le developpement de W. bancrofti en laboratoire Les especes mentionnees ci-dessous se sont gorg6es sur un filarien originaire de la c6te est qui presentait, de 20 heures a 21 h 30, 34 a 77 microfilaires par 20 mm3 de sang. Les insectes femelles ont ensuite ete 6leves dans une piece dont la temperature 6tait maintenue a 25°C. Anopheles gambiae B. A Madagascar, les travaux de Chauvet et al. (1964) sur le complexe A. gambiae ont montre que 1'espece B est seule presente sur les hauts plateaux malgaches. Pour nos experiences, nous avons utilise des A. gambiae B 6lev6s en labora- toire et provenant de cette region. Sur les 89 femelles ainsi gorgees et dissequees 14 jours apres, 81 furent trouvees porteuses de stades infectants, soit 91 %. Anopheles gambiae A. A l'inverse de ce que l'on observe pour l'espece B, il n'existe pas de region climatique o'u l'espece A soit seule presente; aussi avons-nous e contraints d'utiliser une methode beaucoup plus complexe que precedemment. Apres s'etre gorgees sur un filarien, les femelles sauvages supposees appartenir a l'espece A furent invitees a pondre. Leur determination definitive fut effectuee par la methode de Chauvet, basee sur l'etude des soies thoraciques des larves au IVe stade. Par cette methode de determination a posteriori, nous avons reconnu avoir fait se gorger 8 femelles d'A. gambiae A; or 5 d'entre elles se sont infectees, soit 63%. Culex p. fatigans (souche de Tananarive). A Majunga, Moreau (1965) a reussi a infecter, sur un filarien originaire de la cote est, 33% de Culex p. fatigans locaux; l'elevage a ete effectue a la tempe- rature du laboratoire. A Tananarive, Tristan et al. (1963) ont aussi obtenu l'infection de Culex p. fatigans. EFFET DE LA TEMPtRATURE SUR L'VOLUTION DE W. BANCROFTI CHEZ LE VECTEUR Pour nos experiences, nous avons utilise des larves recueillies dans l'agglomeration de Tananarive et elevees en laboratoire. Sur 71 femelles gorgees et dissequees apres 14 jours d'observation, 7 seulement ont permis le developpement de stades infectants, soit 10%. Anopheles coustani Laveran. Nous avons obtenu 5 infections sur 8 femelles gorgees. Anopheles mascarensis de Meillon. Les deux seules femelles que nous ayons pu elever en laboratoire et maintenir en vie plus de 14 jours se sont infectees. Culex (C.) antennatus (Becker). Cinq femelles sauvages, gorgees sur filarien, se sont infect6es. Cette espece a ete trouvee en Haute-Volta naturelle- ment porteuse de stades infectants de W. bancrofti (Brengues, communication personnelle). Abondante et agressive sur la cote est de Madagascar, elle doit etre un vecteur secondaire dont il conviendra d'ap- precier l'importance. Espe.ces n'ayant pas permis le d&veloppement de W. bancrofti en laboratoire Gorg&es puis elevees dans les memes conditions que les especes vectrices, trois especes culicidiennes n'ont jamais permis le developpement de stades infectants; il s'agit de 9 Aedes (S.) albopictus (Skuse), 7 Mansonia (M.) uniformis (Theobald) et 6 Culex (C) giganteus Ventrillon. INFLUENCE DE LA TEMPERATURE SUR LA VITESSE DE DEVELOPPEMENT DES MICROFILAIRES DE W. BANCROFTI CHEZ LE MOUSTIQUE Anopheles gambiae B et Culex p. fatigans (souche de Tananarive) ont ete eleves en laboratoire, la premiere espece a partir des meufs, la seconde 'a partir de larves recoltees dans les gites naturels de la banlieue de Tananarive. Apres un je'une de 48 heures pour A. gambiae B et de 72 heures pour Culex p. fatigans, les femelles ont ete invitees a se gorger, entre 20 heures et 21 h 30, sur un filarien originaire de la cote est. Au cours des experiences, ce volontaire presentait de 34 a 77 microfilaires par 20 mm3 de sang. Les femelles gorgees ont ete elevees 'a 20°C, 25°C, 30°C et 35°C; elles avaient en permanence de 1'eau miellee 'a leur disposition. Developpement chez A. gambiae B (tableau 1, fig. 2) A 20°C, les premiers stades II apparaissent 20 jours apres le repas infectant; il faut attendre TABLEAU 1 INFLUENCE DE LA TEMPERATURE SUR LA VITESSE DE DtVELOPPEMENT DE W. BANCROFTI CHEZ A. GAMBIAE B Nombre Date d'apparition de femelles Nombre(en nombre de jours dissequ6es de femelles Tempe- apres le repasinfectant) entre dissequles rature de I'apparition aprd s d'llevage du premier I'apparition du premier du premier et celle du premier stade 11 stade I I I du premier stade III 20'C 20 27 31 37 250 C 11 14 21 89 300 C 8 11 33 30 35° C 11 ? 8a a Ces 8 femelles infect6es etaient porteuses de stades I et 11 ou de stades I ou 11. FIG. 2 INFLUENCE DE LA TEMPERATURE SUR LA VITESSE DU DtVELOPPEMENT DE W. BANCROFTI CHEZ A. GAMBIAE B 50 lc a) . 2 tn ._L .a E a WHO 90801 Apparition des stades 11 Apparition des stades III 765 J. BRUNHES 27 jours pour voir apparaitre les premiers stades III. La coexistence des stades I et II ne dure qu'un jour alors que celle des stades IL et III peut durer 2 jours. A 25°C, les premiers stades II apparaissent 11 jours apres le repas infectant et les premiers stades III a partir du 14e jour. Comme a 20°C, la coexistence des stades I et II dure un jour et celle des stades II et III dure 2 jours. A 30°C, la vitesse de developpement du parasite s 'accelere encore; les stades II apparaissent au bout de 8 jours et les stades III au bout de 11 jours. La coexistence des stades I et II dure 2 jours et celle des stades II et III dure 3 jours. A 35°C, la vitesse de developpement, au lieu de s'accelerer, se ralentit. Les premiers stades II demandent 11 jours pour apparaitre et, bien que nous ayons disseque 14 moustiques entre le I e et le 16e jour apres le repas infectant? nous n'avons trouve aucun stade III. Il semble qu'une temperature aussi elevee provoque, en plus d'un ralentissement de l'evolution, un developpement aberrant des microfilaires; en effet, apres 11 jours d'incubation, nous avons observe des stades normaux et d'autres anormalement gros ainsi que des stades I au debut de leur evolution. Developpement chez cinq autres esp'ces Developpement chez Culex p. fatigans. Nous avons fait s'infecter, puis disseque, plusieurs centaines de Culex p. fatigans provenant de differents endroits de Madagascar et nous avons pu constater que chez cette espece la temperature influait rigoureusement de la meme faron que chez A. gambiae B Eur la vitesse de developpement du parasite. A 20°C, les premiers stades III apparaissent apres 27 jours d'evolution; A 25°C, ils apparaissent au bout de 14 jours et a 30°C au bout de 11 jours. A 35°C, nous observons, comme chez A. gambiae B, un ralentissement tres net de la vitesse de developpe- ment; 15 jours apres le repas infectant, nous n'ob- servons toujours que des stades II. Developpement chez Anopheles gambiae A, Ano- pheles coustani, Anopheles mascarensis et Culex (C.) antennatus. Nous avons egalement infecte puis eleve a la seule temperature de 25°C quatre autres especes de moustiques: A. gambiae A, A. coustani, A. masca- rensis et Culex (C.) antennatus. Nous avons obtenu les premiers stades III 14 jours apres le repas infec- tant, soit apres le meme delai que chez A. gambiae B et Culex p. fatigans. Discussion Le probleme de l'influence du climat sur la trans- mission de W. bancrofti a retenu 1'attention des epidemiologistes travaillant en regions montagneuses ou en zones partiellement temperees. Hu (1939) a observe que les basses temperatures hivemales de Shanghai provoquaient une mortalite importante des microfilaires ingerees par le vecteur. Basu & Rao (1939), qui ont effectue des elevages de moustiques infectes A 15,5°C, 21,10C, 26,60C et 32°C, ont observe que les stades infectants appa- raissaient respectivement au bout de 47, 20-21, 10 et 9-10 jours. La courbe qu'ils auraient pu tracer grace a ces resultats se rapproche de celle que nous avons obtenue. Omori (1958) a montre qu'une temperature de W6°C avait un effet letal sur les microfilaires et les stades II et III. Abdulcader et al. (1965) ont infecte puis eleve des Culex p. fatigans dans une ville montagnarde de Ceylan; la temperature de la piece d'elevage oscillait entre 21VC et 7°C; les dissections effectuees entre le 13e et le 17e jour apres le repas infectant ne leur ont permis de deceler que quelques stades I. Omori (1966) a observe qu'une temperature de 14,6°C bloquait le developpement du parasite; il pense qu'au-dessus de 18°C l'influence de la tem- perature sur la vitesse de developpement peut etre representee par une droite de type y = 0,703 (x - 14°C) dans laquelle << x > est la temperature de l'elevage et < y # la vitesse de developpement. Il signale qu'au-dessus de 30°C la temperature devient defavorable au developpement du parasite. Lors de notre experimentation, nous avons observe que de faibles variations de temperature peuvent se traduire par de notables differences dans la vitesse de developpement: eleve a 20°C, un moustique gorge sur filarien mettra deux fois plus de temps (27 jours) pour devenir infectant qu'un moustique eleve A 25°C (14 jours); si la temperature exterieure est de 30°C, le developpement du parasite ne necessitera plus que 11 jours. L'elevation de la temperature jusqu'a un optimum situe entre 30°C et 35°C accelere donc le developpe- ment du parasite; cet optimum depasse, la vitesse de developpement du parasite se ralentit. II semble d'autre part qu'une temperature trop elev&e pro- voque un developpement aberrant du parasite. Nous pensons que les variations de la vitesse de developpement du parasite en fonction de la temp& rature peuvent s'exprimer par une courbe proche d'une parabole (fig. 2) dont il conviendra ulterieure- 766 EFFET DE LA TEMPERATURE SUR L EVOLUTION DE W. BANCROFTI CHEZ LE VECTEUR ment de preciser le trace pour des temperatures de 17°C, 28°C et 32°C. Elevees i la meme temperature, les six especes culicidiennes qui se sont revel6es vectrices sont devenues infectantes au terme du meme temps de maturation. En consequence, et dans l'attente d'une experimentation qui portera sur un plus grand nombre d'especes, nous pouvons dire que la vitesse de developpement du parasite semble etre indepen- dante de l'espece culicidienne qui I'heberge. INFLUENCE DE LA TEMPERATURE SUR LE TAUX D INFECTION DES MOUSTIQUES Au cours de l'experimentation precedente, nous avons egalement constate que, pour un meme vecteur, un nombre variable d'individus s'infecte suivant les temperatures auxquelles sont effectues les elevages. Nous avons particulierement etudie les variations de la capacite vectrice d'A. gambiae B et de Culex p. fatigans en fonction de la temperature. Variations de la capacite vectrice d'A. gambiae B (tableau 2, fig. 3) Elevees 'a 20°C, 81 % des femelles gorgees sur filarien possedent, 27 'a 28 jours apres, des filaires au stade III. Nous avons observe que les femelles elevees a 25°C s'infectent le plus frequemment (91 %). Par contre, 69% des femelles elevees 'a 30°C ont ete trouvees porteuses de stades III. TABLEAU 2 INFLUENCE DE LA TEMPERATURE SUR LE TAUX D'INFECTION D'A. GAMBIAE Nombre de femelles Temp6rature dissequees Nombre Taux de la piece apres de femelles d'infection d'Wlevage I'apparition infectees (%) du premier stade III 200 C 37 30 81 250 C 89 81 91 30°C 80 55 69 35° C 18 a 7 a 39 a a Sur les 18 femelles dissequees apres 11 jours d'observa- tion, 7 6taient porteuses de stades I ou 11. FIG. 3 INFLUENCE DE LA TEMPERATURE SUR LE TAUX D'INFECTION D'A. GAMBIAE B ET DE CULEX P. FATIGANS 100 75 b-1 _ ,;t 50 x7 25 20uC 250C 300C Temperature 35uC WHO 90802 A. gambiae B Culex p. fatigans L'augmentation de la temperature se montre donc favorable ai l'infection jusqu'a 25°C, puis, au-del'a de 25°C, elle semble la freiner progressivement. Ce phenomene s'amplifie 'a 35°C; sur 18 femelles dissequees apres 11 jours d'observation, seules 7 etaient porteuses de stades II, soit 39%. On peut donc penser que le taux de femelles infectees serait encore moindre si l'observation pouvait etre pouss6e au-del'a de 16 jours jusqu'a l'apparition 6ventuelle de stades 111. L'analyse statistique montre que les taux d'infec- tion obtenus aux differentes temperatures sont signi- ficativement differents. Variations de la capacite vectrice de Culex p. fatigans (tableau 3, fig. 3) Elevees 'a 20°C, 3 femelles seulement sur les 92 gorgees, soit environ 3 %, ont permis le d6veloppe- ment de stades III. Elevees a 25°C, 7 femelles sur les 71 gorgees se sont infectees, soit 10% d'infection. ...O ,1,4 I I :. .. I re n ro n _ 767, J. BRUNHES TABLEAU 3 INFLUENCE DE LA TEMPtRATURE SUR LE TAUX D'INFECTION DE CULEX P. FATIGANS Nombre de femelles Temperature diss6qu6es Nombre Taux de la piece aprbs de femelles d'infection d'6levage I'apparition infectdes (%) du premier stade III 20° C 92 3 3 250 C 71 7 10 300 C 58 22 38 350 C 14a 9 a 64 a Sur les 14 femelles diss6qu6es aprbs 11 jours d'observa- tion, 9 6taient porteuses de stades I ou 11. Elev6es a 30°C, 38% des 58 femelles gorgees per- mettent le developpement du parasite; Culex p. fatigans se revele donc bon vecteur de W. bancrofti. A 35°C, 9 femelles sur les 14 dissequees apres 11 jours d'observation, soit 64%, etaient porteuses de stades II; le role favorable de la temperature sur l'infection semble donc se confirmer. Comme precedemment, I'analyse statistique montre que les taux d'infection obtenus aux diffe- rentes temperatures sont significativement differents. Discussion A. gambiae B atteint le maximum de sa capacite vectrice autour de 25°C; celle-ci semble decroitre ensuite rapidement lorsque s'eleve la temperature. Avec un taux d'infection oscillant entre 70% et 90%, A. gambiae B se montre donc un excellent vecteur de W. bancrofti et ceci quelle que soit la temperature. Basu & Rao (1939) ont mis en evidence l'influence de la temperature sur le taux d'infection de Culex p. fatigans. Ils ont elev6 des moustiques infectes 'a 15,5°C, 21,1°C, 26,6°C et 32°C, et ont observe que le taux d'infection passait alors respectivement de 2,5% a 31,6%, 52,2% et 42 %. Ainsi que nous l'avons nous-memes constate, les basses temperatures sont egalement defavorables 'a l'infection de Culex p. fatigans. Nous avons observe, avec la souche de Tananarive, que lorsque la temperature passe de 20°C a 25°C puis i 30°C, le taux des femelles infectees passe de 3% a 10% puis 'a 38%. Nous constatons donc que la variation du taux d'infection en fonction de la temperature est speci- fique de chaque vecteur. Ceci peut partiellement s'expliquer si l'on considere que ces variations resultent de I'antagonisme de deux composantes sur lesquelles agit la temperature: le pouvoir de resis- tance du moustique parasite et la vitalit6 du parasite. Les resultats de cette lutte entre le parasite et son hote dependent d'une part de chaque variation de la temperature et d'autre part de l'identite des anta- gonistes. CONCLUSIONS Pour limitee qu'elle soit, notre experimentation a montre que de nombreux moustiques anthropophiles sont susceptibles de transmettre W. bancrofti. De nouvelles etudes doivent etre entreprises afin de dresser la liste de tous les vecteurs potentiels et de mieux connaitre leur biologie, car il est certain que nombre d'entre eux doivent voir leur role effectif limite par une longevite trop faible ou une zoophilie marquee. La temperature, par son influence sur la vitesse de developpement du parasite chez le vecteur et sur la capacite vectrice des moustiques, se revele etre un facteur de premiere importance dans la transmission de W. bancrofti. Pratiquement, il conviendrait que soient standar- disees les experiences tendant 'a evaluer le pouvoir vecteur des moustiques; l'emploi d'un certain nombre de temperatures fixes, comme 200C, 250C et 300C, serait n6cessaire pour en appr6cier les varia- tions chez une espece donn6e ainsi que pour effectuer la comparaison des resultats obtenus dans le monde entier. Les conditions climatiques de Madagascar per- mettent d'expliquer partiellement d'une part, l'exis- tence de vastes zones indemnes de filariose comme les hauts plateaux et, d'autre part, l'existence de zones aL transmission intense telles que les regions basses et cotieres, beaucoup plus chaudes. REMERCIEMENTS Nous tenons a exprimer notre tres vive reconnaissance a M. G. Ramalanjaona, Secretaire g6n6ral du Comite de la Recherche scientifique technique malgache, pour l'aide decisive qu'il nous a apportee. 768 EFFET DE LA TEMPE'RATURE SUR L'IVOLUTION DE W. BANCROFTI CHEZ LE VECTEUR 769 SUMMARY NEW DATA ON THE VECTORS OF WUCHERERIA BANCROFTI IN MADAGASCAR: THE INFLUENCE OF TEMPERATURE ON THE RATE OF DEVELOPMENT OF THE PARASITE AND ON THE VECTORIAL INFECTION RATE Madagascar is a mountainous island with 3 distinct climatic zones, and bancroftian filariasis is unevenly distributed over the island. Very few cases occur in areas with a mean February temperature of less than 200C. The 3 main vectors of the parasite in nature are Anopheles funestus, Anopheles gambiae s.l. and Culex pipiens fatigans. Laboratory studies showed that the parasite could develop to the infective stage in the following species: Anopheles gambiae A, Anopheles gambiae B, Anopheles coustani, Anopheles mascarensis, Culex pipiens fatigans and Culex (C.) antennatus. When An. gambiae B and Culex p. fatigans (Tananarive strain) were raised at different temperatures in the laboratory, larvae of Wuchereria bancrofti reached stage III after 27 days at 20°C, after 14 days at 25°C and after 11 days at 30°C, but at 35°C development was slower. A similar rate of development of the parasite was found in 4 other vector species raised at the same tem- peratures. At 20°C, 81 % of the engorged females of An. gambiae B were infective, at 25°C 91 % were infective while at 30°C only 69% carried stage-III larvae. With Culex p. fatigans females raised at the same temperatures, however, the percentages infective were as follows: 20°C, 3%; 25°C, 10%; and 30°C, 38%. The relation between temperature and infection rate is thus specific for each vector and it is suggested that future studies of vectorial capacity should include tests at a range of temperatures. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Abdulcader, W. H. M., Rajakone, P., Tharumarajah, K. & Mahadeva, R. (1965) J. trop. Med. Hyg., 68, 254- 256 Basu, B. C. & Rao, S. Sundar (1939) Indian J. med. Res., 27, 233-249 Brygoo, E. R. (1958) Arch. Inst. Pasteur Madagascar, 26, 23-39 Brygoo, E. R. & Grjebine, A. (1957) Mem. Inst. scient. Madagascar, 9, 252-258 Chauvet, G., Coz, J., Gruchet, H., Grjebine, A. & Lumaret, R. (1964) Mid. trop., 24, 27-44 Doucet, J. (1951) Mem. Inst. scient. Madagascar, 6, 83-1 14 Hu, S. M. K. (1939) Amer. J. Hyg., 29, 67-74 Moreau, J. P. (1965) MMd. trop., 25, 486-490 Omori, N. (1958) Yokohama med. Bull., 9, 382-390 Omori, N. (1966) Progr. med. Parasitol. Jap., 3, 471-507 Tristan, M., Dodin, A. & Brygoo, E. R. (1963) Rev. med. Madagascar, 3, 3-7