Préparation de la solution mère de Giemsa

VERSION 1 – DATE EFFECTIVE : 01/01/2016 PRÉPARATION DE LA SOLUTION MÈRE DE GIEMSA DIAGNOSTIC MICROSCOPIQUE DU PALUDISME MODES OPÉRATOIRES NORMALISÉS – DMP-MON-02 1. OBJECTIF ET CHAMP D’ACTION Fournir une description détaillée de la procédure à suivre afin de préparer une solution mère de Giemsa pour la coloration de routine des frottis minces et des gouttes épaisses pour le diagnostic du paludisme. Cette procédure ne peut être modifiée qu’avec l’approbation du coordonnateur national pour l’assurance de la qualité du diagnostic microscopique du paludisme. Toutes les procédures exposées ici sont obligatoires pour tous les techniciens de la microscopie travaillant dans les laboratoires nationaux de référence, dans les laboratoires des hôpitaux ou dans les laboratoires médicaux de base au sein des établissements sanitaires où sont effectués des examens microscopiques pour le diagnostic du paludisme. 2. HISTORIQUE Le Giemsa est le colorant le plus fréquemment utilisé pour la coloration des étalements de sang permettant de poser un diagnostic de paludisme. Il est disponible dans le commerce sous la forme d’un produit prêt à l’emploi, bien que la qualité fluctue selon sa provenance. Afin que la coloration soit toujours d’excellente qualité et que l’on dispose d’un produit normalisé, on peut demander au laboratoire de référence du programme national de lutte contre le paludisme de le préparer et de le distribuer aux hôpitaux ou aux laboratoires médicaux de base au sein des établissements sanitaires où sont effectués des examens microscopiques pour le diagnostic du paludisme. Si l’on observe quelques règles simples lors de la production de la solution mère de Giemsa, le colorant produit au niveau national ou au niveau des régions/provinces peut être d’une qualité supérieure à celui que l’on trouve dans le commerce. 3. FOURNITURES, MATÉRIEL ET ÉQUIPEMENTS Afin de préparer 500 ml de colorant de Giemsa, vous aurez besoin du matériel suivant : • 3,8 g de colorant de Giemsa ou de Giemsa en poudre (de préférence certifié par la Commission de coloration biologique (Biological Stain Commission), afin d’être sûr d’utiliser un très bon produit répondant aux normes de qualité) ; • 250 ml de méthanol absolu, pur, d’excellente qualité, sans acétone ; • 250 ml de glycérol pur d’excellente qualité ; • billes de verres solides, nettoyées au méthanol, de 3 à 5 mm de diamètre, 50 à 100 pièces ; • une spatule ou une cuillère de dosage ; • du papier conçu pour la pesée ; • une éprouvette graduée ; • un entonnoir en verre ou en plastique ; • un flacon en verre brun ou de couleur sombre pouvant être rebouché hermétiquement, propre et sec, d’une capacité de 500 ml (si vous n’en avez pas à disposition, vous pouvez utiliser un flacon d’une taille correspondante en verre dur ou en polyéthylène transparent, chimiquement propre et sec, que vous devrez cependant emballer dans du papier de couleur foncée) ; • une balance analytique d’une sensibilité de 0,01 g ; et • un agitateur, le cas échéant. 2DMP–MON–02 : PRÉPARATION DE LA SOLUTION MÈRE DE GIEMSA 4. CONSIGNES DE SÉCURITÉ • Le méthanol et le colorant de Giemsa sont inflammables et très toxiques en cas d’ingestion ou d’inhalation. Évitez tout contact et inhalation. Quand on ne les utilise pas, ils doivent être conservés dans une armoire fermée à clé. • Les précautions universelles doivent être observées – y compris pour ce qui est de l’utilisation d’équipements de protection individuelle adéquats comme les gants, les lunettes de protection et la blouse de laboratoire. 5. PROCÉDURE SCHÉMA DESCRIPTION DE L’ACTIVITÉ 1. Placez env. 50 billes dans un flacon. 2. Pesez 3,8 g de poudre de Giemsa et versez-la dans le flacon. 3. Versez environ 100 ml de méthanol avec précaution. 4. Rebouchez le flacon et agitez-le de manière circulaire pendant 2-3 min. 5. Ajoutez 250 ml de glycérol au mélange et agitez pendant 3-5 min. 6. Ajoutez les 150 ml de méthanol restants. 7. Revissez le bouchon du flacon. 8. Continuez à remuer le mélange pendant 2-3 min à six reprises au cours du premier jour. 1. Placez une cinquantaine de billes de verre nettoyées au méthanol dans un flacon en verre brun ou de couleur sombre. 2. Pesez 3,8 g de poudre de Giemsa à l’aide d’une balance analytique et versez-la dans le flacon contenant les billes à l’aide d’un entonnoir. 3. Avec précaution, versez 100 ml de méthanol environ, en vous assurant que tout le colorant sec se soit déposé dans le flacon. 4. Rebouchez le flacon et agitez-le ensuite pendant 2 à 3 minutes de manière circulaire afin de commencer à dissoudre les cristaux de colorant. 5. Ajoutez 250 ml de glycérol au mélange au moyen de l’entonnoir et agitez à nouveau pendant 3 à 5 min. 6. Ajoutez les 150 ml de méthanol restants au mélange au moyen de l’entonnoir, en vous assurant que le reste du méthanol entraîne tout le glycérol restant dans l’entonnoir. 7. Revissez le bouchon du flacon. 8. Continuez ensuite à remuer le mélange de la même manière, pendant 2 à 3 minutes à chaque fois, à environ six reprises au cours du premier jour. 3DMP–MON–02 : PRÉPARATION DE LA SOLUTION MÈRE DE GIEMSA 9. Agitez chaque jour pendant au moins 7 jours. 10. Étiquetez le flacon de façon claire et consignez votre activité dans le registre de contrôle de la qualité. 11. Revissez le capuchon de la bouteille et conservez-la dans un endroit frais, à l’abri de la lumière directe du soleil. 9. Agitez chaque jour pendant 2 à 3 min à chaque fois, à environ six reprises, pendant au moins sept jours. Le cas échéant, un agitateur peut être utilisé. 10. Étiquetez le flacon de façon claire en indiquant le numéro du lot, le nom de la personne ayant préparé la solution mère, la date à laquelle la solution a été préparée et la date de péremption, et consignez votre activité dans le registre de contrôle de la qualité. Solution mère de Giemsa Lot No : 2015-01 Préparé par : Nom, prénom Date de la préparation : 17 août 2015 Date de péremption : 17 août 2017 #2015-01 indique l’année de préparation et le numéro de la solution. 11. Resserrez le bouchon du flacon pour éviter l’absorption des vapeurs d’eau contenues dans l’air et conservez-la dans un endroit frais, à l’abri de la lumière directe du soleil. 6. REMARQUES • Le flacon doit toujours être conservé en le rebouchant hermétiquement afin d’éviter l’absorption de vapeurs d’eau et l’évaporation ainsi que l’oxydation du colorant en cas d’humidité ambiante élevée. Si le flacon est bien bouché et protégé de l’humidité, le colorant de Giemsa restera plus longtemps stable à température ambiante. • Conservez le mélange dans un flacon en verre brun, dans un endroit frais, sec, ombragé et à l’écart de la lumière directe du soleil. Si vous utilisez un flacon en verre transparent, emballez-le dans du papier épais et de couleur foncée pour empêcher la pénétration de la lumière. • NE REMUEZ PAS le flacon de colorant de Giemsa au cours des 24 heures précédant l’utilisation afin d’éviter de remettre en suspension des particules précipitées qui se déposeront sur les étalements de sang au moment de la coloration et risquent de masquer des détails importants au moment de l’examen microscopique. • NE CONTAMINEZ PAS la solution mère de Giemsa avec de l’eau ; la moindre quantité d’eau en- traînera une dégradation du colorant, le rendant progressivement inefficace. • Pour les besoins de la journée, mesurez et filtrez de petites quantités de solution, à mettre dans un flacon fermant hermétiquement (de 25 à 50 ml), de façon à éviter de contaminer la solution mère. • NE METTEZ PAS et N’UTILISEZ PAS de pipette mouillée ou sale dans la solution mère. • NE REMETTEZ PAS le reste de solution non utilisée dans le flacon de solution mère ou dans le flacon dont vous vous servez pour l’usage quotidien ; en dehors de son flacon, le colorant doit être utilisé rapidement ou jeté. 7. CONTRÔLE DE LA QUALITÉ ET DOCUMENTATION • Effectuez un test de contrôle de la qualité : · pour chaque nouveau lot de solution mère préparé, · avant d’utiliser la solution pour la coloration de Giemsa, · avant de l’envoyer à des laboratoires pour qu’elle soit utilisée et · sur le terrain, après réception de la part d’un laboratoire national de référence. • Consignez vos informations dans le registre de contrôle de la qualité. Voir DMP-MON 3c, Contrôle de la qualité de la solution mère de Giemsa et de l’eau tamponnée pour la coloration de routine d’étalements de sang à la recherche du paludisme. 4DMP–MON–02 : PRÉPARATION DE LA SOLUTION MÈRE DE GIEMSA 8. MODES OPÉRATOIRES NORMALISÉS CONNEXES DMP-MON 3c : Contrôle de la qualité de la solution mère de Giemsa et de l’eau tamponnée DMP-MON-04 : Préparation d’une solution de travail de Giemsa 9. RÉFÉRENCES Storey J. Standard operating procedures for Giemsa malaria microscopy. 2012 (non publié). OMS. Techniques de bases pour le diagnostic microscopique du paludisme – Partie I : Guide du stagiaire. Genève, 2015. Centers for Disease Control and Prevention. Laboratory diagnosis of malaria. Staining for malaria parasites. Atlanta, Georgia; 2013 (http://www.cdc.gov/dpdx/resources/pdf/benchAids/malaria/malaria_ staining_benchaid.pdf, accessed 14 December 2015). 10. HISTORIQUE DU DOCUMENT Date (mois/année) Version Commentaires Personne responsable (nom, prénom) Janvier 2016 1 Examiné et finalisé par des experts, édité et mis en page Gonzales, Glenda Fonctionnaire technique WPRO WHO/HTM/GMP/MM/SOP/2016.02 © Organisation mondiale de la Santé 2016. Tous droits réservés.