Utilisation d'anticorps monoclonaux pour le diagnostic rapide des virus respiratoires : mémorandum d'une réunion de l'OMS

Memoranda/Memorandums Utilisation d'anticorps monoclonaux pour le diagnostic rapide des virus respiratoires: Memorandum d'une reunion de I'OMS* Une trousse de d6pistage au moyen d'anticorps monoclonaux (utilisant l'immunofluorescence) pour la recherche directe des antig6nes viraux du virus respiratoire syncytial, des virus grippaux A et B et des virus paragrippaux (types 1, 2 et 3) ainsi que d'un ad6novirus, a 6t6 mis au point par I'OMS. En 1990 et 1991, 16 laboratoires situ6s dans diff6rentes parties du monde ont 6te invit6s a tester cette trousse en pratique clinique. L'objet de ce m6morandum est de r6sumer, outre les r6sultats obtenus, les discus- sions et les recommandations de la consultation OMS pour la surveillance mondiale des virus respira- toires qui s'est tenue a Geneve du 25 au 27 mars 1992. Introduction Les virus sont des causes bien connues d'infection des voies respiratoires hautes et basses, et sont parti- culierement importants chez le nourrisson et le jeune enfant, chez lesquels ils peuvent etre 'a l'origine de pathologies severes et meme de la mort. I1 est donc souhaitable de disposer de techniques simples per- mettant une identification rapide des virus pour assu- rer une bonne prise en charge du patient. En outre, des vaccins destines 'a prevenir les infections provo- quees par le virus le plus frequent, le virus respiratoi- re syncytial (VRS) sont 'a l'etude, et un effort sem- blable est fait pour le virus place au deuxieme rang par son importance, le virus paragrippal de type 3. Le besoin d'un vaccin, comme d'ailleurs son succes, doit etre dvalue en s'appuyant sur des methodes de surveillance epidemiologique susceptibles d'etre lar- gement appliquees et n'exigeant pas un soutien de laboratoire important. L'immunofluorescence repond * Ce Memorandum est tire du rapport d'une consultation de l'OMS pour la surveillance mondiale des virus respiratoires qui s'est tenue A Genbve du 25 au 27 mars 1992. Participants: Dr M. Grandien, Laboratoire national de bacteriologie, Stockholm, Subde; Dr N.S. Khairullah, University of Malaya, Kuala Lumpur, Malaisie; Dr C.R. Madeley, Royal Victoria Infirmary, Newcastle upon Tyne, Angleterre. Secr6tariat OMS: Dr P.-H. Lambert, Divi- sion des Maladies transmissibles; Dr Y. Pervikov, Division des Maladies transmissibles (Secr6taire). Tires a part: Services d'Appui en microbiologie et immuno- logie, Division des Maladies transmissibles, Organisation mon- diale de la Sant6, 1211 Genbve 27 (Suisse). La version originale de I'article est parue en anglais dans le Bulletin de l'Organisa- tion mondiale de la Sant6, 70 (6): 699-703 (1992). Tir6 a part No 5367 a des exigences, mais n'a pu etre jusqu'ici massive- ment employee en 1'absence de reactifs de qualite satisfaisante. L'arrivee des anticorps monoclonaux a permis de contoumer cet obstacle et en 1986 l'OMS a cree un projet pour la mise au point d'une trousse de diagnostic par les anticorps monoclonaux, utili- sable pour transferer l'usage de l'immunofluores- cence vers tous les laboratoires de sante publique du monde. C'est ainsi que l'OMS a commence 'a collec- ter des anticorps monoclonaux susceptibles d'etre utilises dans une trousse de depistage des antigenes viraux directement dans les echantillons cliniques. En 1987-1988, des anticorps diriges contre le VRS, les virus grippaux A et B, les virus paragrippaux 1, 2 et 3 et un adenovirus ont et6 selectionnes comme reactifs potentiels parmi le groupe des anticorps ini- tialement examines. Ils ont ensuite ete evalu6s par huit laboratoires situes en Europe, aux Etats-Unis d'Amerique et en Asie, tous tres experimentes dans l'utilisation de l'immunofluorescence. Leurs resultats ont ete examines par une premiere equipe de travail et rapportes en 1988.a La conclusion principale est que, compares aux methodes de reference, les anti- corps monoclonaux groupes detectent les antigenes viraux dans les prelevements cliniques avec une grande sensibilite et specificite. En regle generale, il faut s'attendre a une sensibilite legerement plus faible avec les anticorps monoclonaux groupes qu'avec les bons immunsesums polyclonaux, mais a WHO Informal Consultation on Monoclonal Antibodies for Res- piratory Virus Diagnosis, 23-24 September 1988. Document non publie WHO/MIM/MAB/88.1. Bulletin de l'Organisation mondiale de la Sant6, 71 (2): 151-155 (1993) a Organisation mondiale de la Sante 1993 151 M6morandum cet inconvenient est compense par la facilite de lec- ture des preparations realisees avec les anticorps monoclonaux. Plusieurs conjugues anti-souris ont ete evalues avant que l'un d'eux, fabrique dans le com- merce, soit choisi et inclus dans la trousse. Etude actuelle Apres cette premiere evaluation, des laboratoires situes dans differentes parties du monde et pratiquant deja en routine le diagnostic des infections virales respiratoires ont ete invites a tester la trousse en pra- tique clinique. Ces laboratoires utilisaient depuis longtemps en routine des antiserums polyclonaux du commerce (par immunofluorescence ou des metho- des immuno-enzymatiques) ou l'isolement en culture cellulaire. En 1990 et 1991 il leur a ete demande de comparer dans la mesure du possible la trousse proposee leur methode habituelle. La demande etait accompagnee d'un protocole d'utilisation de la trousse. Un atelier 'a l'intention des laboratoires partici- pants de I'Amerique du Sud a ete organise par l'OPS/OMS 'a Montevideo (Uruguay) en mai 1991, pour obtenir a la source des donnees sur l'utilisation de cette trousse. Resultats Seize laboratoires situes dans les six Regions OMS (Afrique, Ameriques, Asie du Sud-Est, Europe, Mediterranee orientale et Pacifique occidental) ont pris part a l'etude.b Dans un premier stade des dilu- b NO 1, Department of Pathology, Singapore General Hospital, Singapour (Investigateur: Ling Ai Ee); NO 2, Department of Medi- cal Microbiology, University of Malaya, Kuala Lumpur, Malaisie (Dr N. Khairullah); NO 3, Department de Virologie, Institut natio- nal de la Sante, D6partement des Sciences medicales, Bangkok, Thailande (P. Thatwatsupha); NO 4, Commonwealth Serum Laboratories, Victoria, Australie (R. Shaw); NO 5, National Institu- te of Virology, Indian Council of Medical Research, Poona, Inde (B.L. Rao); NO 6, H6pital national de Sendai, Division de la recherche clinique, Centre de recherche sur les virus, Sendai, Japon (Y. Numazaki); NO 7, Departement de microbiologie, Uni- versite de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentine (M. Avila); NO 8, Instituto Carlos Malbran, Buenos Aires, Argentine (V. Savy); NO 9, Instituto Adolfo Lutz, Sao Paulo, Bresil (S. Takimoto); NO 10, Instituto Evandro Chagas, Belem, Bresil (W. Mello); No 11, Institut de Sante publique, Section de virologie clinique, Santia- go, Chili (M. Vicente); NO 12, Laboratoire central de Sante publique, Montevideo, Uruguay (M.H. de Peluffo); NO 13, Centre national de microbiologie, Virologie et immunologie sanitaires, Madrid, Espagne (P.P. Brena); NO 14, Laboratoire central de virologie, Centre medical Chaim Sheba, Tel-Hashomer, Israel (N. Varsano); NO 15, Centre Pasteur du Cameroun, Yaounde, Cameroun (D. Pignon); NO 16, H6pital Charles Nicolle, Tunis, Tunisie (A. Slim). tions de travail des reactifs de la trousse (anticorps monoclonaux groupes et conjugue) ont ete evaluees dans ces laboratoires sur des cellules en culture infectees ou des pr6levements cliniques. Les resultats obtenus, pour lesquels la variabilite est considerable, sont indiques au tableau 1. Comparees aux resultats signales par la premiere equipe de travailc certaines dilutions de travail sont plus grandes et d'autres plus petites que les dilutions attendues. Dans une certaine mesure cet ecart pourrait traduire des differences de qualite de la microscopie de fluorescence ou des materiels utilises, autres que ceux foumis avec la trousse. Avec les reactifs peu dilues on risque d'obtenir des reactions non specifiques indesirables et avec les reactifs tres dilues une perte de sensibilite est possible. Dans la mesure oiu les tests sur des pre- parations de cultures cellulaires donnent moins de reactions colorees non specifiques que sur les prele- vements cliniques, on risque d'estimer 'a tort que les reactifs tres dilues sont satisfaisants. Certains laboratoires, les numeros 15 et 16 par exemple, n'ont pas pu aller au-del'a des tests prelimi- naires sur un petit nombre d'echantillons; ils ont neanmoins trouve que les reactifs etaient satisfai- sants. Les donnees comparees des autres laboratoires sur la qualite des anticorps monoclonaux sont indi- quees au tableau 2. Dans la partie I de ce tableau, on compare le resultat obtenu avec les anticorps mono- clonaux et les antiserums polyclonaux, en immuno- fluorescence et avec d'autres methodes. Chaque case du tableau, a la croisee d'un laboratoire et d'un virus teste, comporte quatre nombres; le premier et le qua- trieme indiquent le degre de concordance entre les deux methodes, tandis que le deuxieme et le troisie- me indiquent le degre de discordance en faveur de l'un ou l'autre des 2 reactifs; les ecarts entre les resultats demandent a etre expliques. L'une des explications possibles est que les reactifs polyclo- naux utilises par les participants ont ete prepares dans le commerce soit sur l'animal soit sur vesicule vitelline d'aeuf feconde; certains reactifs ainsi fabri- ques se montrent non specifiques et peu sensibles. La partie II du tableau 2 compare les resultats obtenus avec les anticorps monoclonaux de l'OMS et avec l'isolement en culture cellulaire. On observe un petit nombre de resultats discordants, dont les causes possibles sont multiples: la sensibilite des cultures 'a certains virus peut varier, l'immunofluorescence peut encore donner des resultats positifs avec les preleve- ments recueillis pendant la phase tardive de l'infec- tion lorsque l'anticorps fabrique localement peut inhiber l'infectiosite du virus; enfin, l'infectiosite du prelevement peut avoir disparu pendant le transport. c Voir note de bas de page a, p. 151. 152 WHO Bulletin OMS. Vol 71 1993 Utilisation d'anticorps monocionaux pour le diagnostic rapide des virus respiratoires Tableau 1: Dilutions de travail des r6actifs utilis6s par les laboratoires participant A I'Mtude NO du Virus test6 Conjugue Laboratoire b VRS Grippe A Grippe B Paragrippal Adeno anti-souris 1 5000 1000 10 000 1000 1250 150 2 40 40 40 40 40 40-80 3 10 10 10 10 10 5-10 4 NR c 200 200 NR NR 40 5 25 25 25 NR 25 50 6 50 50 50 50 500 20 7 10 20 20 10 10 15d 8 80 500 500 80 100 80 9 1000 40 300 200 100 10 10 600 100 100 400 150 50 11 100 30 30 100 200 60-100 12 40 100 100 40 40 50 13 200 200 300 300 300 30 14 20 20 20 20 20 15 Intervalle 10-5000 10-1000 10-10 000 10-1000 10-1250 15-150 a VRS = virus respiratoire syncytial; Grippe A = virus grippal A; Grippe B = virus grippal B; Paragrippal = virus paragrippal; Adeno = adenovirus. b Les laboratoires NO 15 et 16 ont soumis un tres petit nombre de donnees qui ont e incluses ici. c NR = non realise. d Non titre. @ Conjugue sigma anti-souris. Tableau 2: Comparaison des r6sultats obtenus en immunofluorescence et avec la trousse OMS utilisant les anti- corps monocionaux, sur des pr6iAvement cliniques Virus teste NO du Virus Virus Virus Laboratoire VRS grippal A grippal B paragrippal Adenovirus Partie la 2 12/0/0/88 b 4/0/3/58 1/0/0/64 0/0/8/57 0/0/2/63 3 18/0/1/119 0/0/0/138 0/0/1/137 2/0/4/132 2/0/0/136 7 21/3/9/56 0/0/3/86 4/0/11/74 2/0/3/84 4/1/0/84 9 6/0/2/39 1/1/7/39 0/2/0/41 0/0/0/8 0/0/1/14 11 69/1/0/228 24/1/4/102 34/0/0/344 14/1/10/320 45/0/0/251 12 96/5/1/138 12/1/0/231 NRc 6/0/6/240 7/1/5/250 13 50/2?/2?/82 d NR NR 7/0/0/129 2/0/0/134 44/2?/6/84 NR NR NR NR 14 8/2/2/26e NR NR NR 2/1/2/12 Partie 11' 1 0/0/0/1 9 24/0/0/0 14/0/0/0 NR NR 2 9/0/21/135 7/0/0/58 1/0/0/64 11/0/0/119 1/0/2/121 7 25/5/5/54 1/3/2/83 5/1/10/73 0/0/5/84 3/1/1/84 8 14/1/8/23 NR NR 4/0/3/7 8/2/2/12 12 49/4/16/110 7/2/4/368 1/9/1/370 0/0/0/68 3/1/0/64 13 12/0/10/44 0/0/0/66 0/0/0/66 4/0/1/61 2/0/0/64 14 8/3/2/125 0/0/0/110 3/2/0/105 4/2/0/124 3/8/1/126 a La partie compare les resultats obtenus en immunofluorescence avec des anticorps polyclonaux, en immunofluorescence avec des anticorps monoclonaux du commerce, puis avec une methode immuno-enzymatique (ELISA). b Les quatre nombres s6par6s par des barres obliques indiquent respectivement le nombre d'echantillons P+M+, P+M-, P-M+, P-M- (P = anticorps polyclonal, M = anticorps monoclonal). c NR = non realise. d Autres anticorps monoclonaux. e ELISA. f La partie 11 compare les r6sultats obtenus aux r6sultats de l'isolement en culture de cellules. 9 Les quatre nombres separ6s par des barres obliques indiquent respectivement les nombres d'6chantillons C+M+, C+M-, C-M+, C-M- (C = culture de cellules, M = anticorps monoclonal). WHO Bulletin OMS. Vol 71 1993 153 M6morandum Les resultats donnes dans les deux parties du tableau montrent que le nombre de positifs obtenu dans les anticorps monoclonaux est plus grand qu'avec les autres techniques. Cet ecart n'a pas a l'heure actuelle requ d'explication satisfaisante, mais en ce qui conceme la majorite des prelevements, la trousse de depistage par les anticorps monoclonaux soutient la comparaison avec les autres methodes de recherche examinees. Au cours de l'etude, les anticorps monoclonaux ont ete utilises sur un tres grand nombre de preleve- ments cliniques (tableau 3). La frequence des reac- tions positives est comparable 'a celle obtenue ailleurs; elle est cependant faible pour les virus para- grippaux et l'adenovirus. Discussion et conclusions En regle generale, les donnees obtenues jusqu'ici confirment les conclusions anterieures, 'a savoir que les reactifs contenus dans la trousse ont une grande sensibilite et une grande specificite. Celle-ci peut donc etre utilisee dans les laboratoires de diagnostic ou le personnel a l'experience de l'immunofluores- cence. De plus, l'immunofluorescence utilisant des anticorps monoclonaux a l'avantage de permettre le diagnostic en l'absence de certains equipements ou quand les cultures de cellules ne sont pas praticables. Pour que les resultats de l'immunofluorescence soient fiables et de bonne qualite, deux points essen- tiels sont 'a considerer: i) il faut recueillir et preparer des prelevements qui contiennent un nombre suffi- sant de cellules infectees intactes; ii) il faut que l'observateur soit capable de distinguer dans les cel- lules l'immunofluorescence propre au virus des reac- tions non specifiques. L'immunofluorescence est preferable 'a d'autres techniques dans la mesure oCu elle fournit une information en retour sur la qualite du prdl'evement; cependant, la reconnaissance d'une fluorescence virale vdritable demande une formation et une certaine experience. Cette aptitude est acquise plus facilement et plus rapidement si les resultats de la fluorescence sont valides au moyen d'autres tech- niques, cultures de cellules par exemple- la trousse foumit neanmoins des reactifs specifiques donnant des resultats plus faciles 'a lire qu'avec les immunse- rums du commerce qui existaient auparavant. Des moyens de controle sont cependant necessaires pour veiller 'a ce que les donnees qui seront recueillies soient fiables. On pourra notamment inviter les labo- ratoires participants 'a adresser pour confirmation aux laboratoires de reference, des doubles representatifs des lames positives et negatives non colorees, prepa- rees a partir du materiel clinique. I1 est souhaitable que la procedure soit surveillee par l'OMS. Une telle approche a l'avantage que la technique par immuno- fluorescence qui est decrite ici peut etre mise en oeuvre et &re l'objet d'un controle de qualite dans des laboratoires oCu les cultures cellulaires ou d'autres methodes sont impraticables. Tableau 3: Proportion de resultats positifs obtenus avec la trousse OMS utilisant les anticorps monoclonaux sur des pr6lbvements cliniques, en fonction du laboratoire et du virus Virus testes NO du Virus Virus Virus Laboratoire VRS grippal A grippal B paragrippal Ad6novirus 1 649/2086a 46/2167 11/2167 30/2127 24/2118 2 30/165 7/165 1/165 11/165 3/165 3 19/138 0/138 1/138 6/138 2/138 7 30/89 3/89 15/89 5/89 4/89 8 22/46 - - 7/14 10/24 9 8/47 8/48 0/43 0/8 1/15 1 1 69/298 28/131 34/378 24/345 45/296 12 65/179 11/381 2/381 0/68 3/68 13 50/136 0/66 0/66 7/136 2/136 14 10/138 0/110 3/110 4/130 4/138 +b 6/130 24/130 0/130 10/130 4/130 ++b 58/696 7/696 10/696 15/696 4/696 Total 1016/4148 144/4121 77/4363 119/4046 106/4013 % de positifs 24,5 3,5 1,8 2,9 2,6 a Les chiffres indiquent le rapport du nombre de prelbvements positifs au nombre de prelevements examines. b R1sultats obtenus en 1991-1992 avec le deuxieme lot de la trousse OMS. + = Dr J. Hang, Folkehelse, Oslo, Norv6ge. ++ = Dr B. Marten, Institute of Medical Research, Goroka, Papouasie-Nouvelle-Guinee. WHO Bulletin OMS. Vol 71 1993154 Utilisation d'anticorps monoclonaux pour le diagnostic rapide des virus respiratoires Les resultats de l'etude sont interessants et la technique pourrait ulterieurement etre etendue a d'autres laboratoires; avant d'en arriver Ia, il serait cependant souhaitable de s'interroger sur certaines variations observees. Par exemple, si les memes reactifs ont ete utilises dans le meme but dans tous les laboratoires, les dilutions de travail employees sont extremement differentes. Les raisons invoquees ne sont pas claires et devront etre analysees en vue d'obtenir une plus grande fiabilite. Recommandations Les participants a la consultation ont formule les recommandations suivantes: * Les reactifs de la trousse doivent etre foumis sans interruption. Avant d'etre mis en circulation, les nou- veaux lots seront soumis 'a un controle de qualite par des laboratoires de reference experimentes. L'OMS devra conserver des echantillons des lots precedents aux fins de comparaison. * Pour obtenir des donnees epidemiologiques desti- nees a etayer la mise au point du vaccin, un anticorps monoclonal specifique du virus paragrippal type 3 sera ajoute a la trousse. * II sera en outre souhaitable d'inclure dans la trous- se un anticorps monoclonal specifique de la rougeo- le, si l'on envisage de maximiser son efficacite dans les regions oiu la rougeole est encore frequente. * I1 est hautement souhaitable que la standardisation des techniques soit amelioree. On precisera dans la trousse l'etendue des dilutions recommandees pour chacun des reactifs et on y adjoindra des renseigne- ments sur la collecte, le transport et la preparation des prelevements. Chaque fois que possible, l'epi- fluorescence avec filtres interferentiels sera utilis6e avec le bleu d'Evans en coloration de fond. Le prele- vement de choix reste le depot de cellules extraites des secretions nasopharyngees (aspirats). * On verifiera regulierement au moyen de cultures cellulaires infectees que le microscope et le conjugue sont techniquement bien adaptes. * Pour developper le controle de qualite, les echanges d'echantillons (positifs et negatifs, sous forme de lames preparees) et d'informations entre les laboratoires seront encourages. Ces preparations peu- vent etre colorees ou non, et etre utilisees pour l'enseignement et la formation aussi bien que pour le developpement du controle de qualite. De plus, des doubles des preparations seront envoyes periodique- ment aux laboratoires de reference pour verifier que la qualite du diagnostic est maintenue. * I1 est vivement conseille de donner une formation complementaire a tous les participants, et particuli'e- rement aux laboratoires sans grande experience de l'immunofluorescence. * Les personnels ayant une bonne experience de l'immunofluorescence sont invites a rendre visite a leurs collegues moins experimentes afin d'assurer le transfert des connaissances; il serait bon de reunir a cette occasion des groupes de discussion intraregio- naux. Remerciements Le Dr A. Kendal (actuellement au Bureau r6gional de l'OMS pour l'Europe de Copenhague) a assur6 de 1987 a 1991 la coordination du projet de mise au point de cette trousse OMS de diagnostic utilisant les anticorps monoclo- naux, alors qu'il travaillait aux Centers for Disease Control a Atlanta, GA, Etats-Unis d'Am6rique. WHO Bulletin OMS. Vol 71 1993 155