Diagnostic immuno-enzymologique (ELISA/ des maladies parasitalires par une microméthode modifiée : 1 : modalités techniques

Bulletin de l'Organisatioi niondiale de la Sante, 56 (4): 609-613 (1978) Diagnostic immuno-enzymologique (ELISA) des maladies parasitaires par une micromethode modifiee. 1. Modalites techniques PIERRE AMBROISE-THOMAS1 & PIERRE T. DESGEORGES 2 Par l'emploi d'un nouveau substrat revelateur, l'orthotolidine, la reaction de micro- ELISA aux anti-globulines conjuguees a laperoxydasepeut eztre tres sensiblement ameliore. La technique propose'e comprend la lecture au spectrophotom&tre, directement dans les plaques de microtitration. Elle a Jte appliquee a' l'etude serologique de diffJrentes maladies parasitaires. Ses principaux avantages sont un important gain de temps (4 heures) et de sensibilite. Ceci permet notamment l'emploi d'anti-globulines 5 fois plus dilues qu'avec les substrats re'velateurs habituels (acide amino-5 salicylique) et surtout une considerable economie en reactifs antige'niques. Les reactions immuno-enzymologiques (titrage avec immunoadsorbant lie' a une enzyme, ou ELISA) associent plusieurs avantages de l'immunofluores- cence indirecte ou de la radio-immunologie en echappant a certains inconv6nients de ces deux methodes (3). Le materiel utilise est en effet d'une extreme simplicite et les reactifs marques sont libre- ment accessibles a tout laboratoire de biologie. Par ailleurs, la sensibilite du test ELISA approche celle de la radio-immunologie et permet l'emploi d'in- fimes quantites d'antig6nes, ce qui explique en par- ticulier l'interet de la methode en parasitologie ofu les r6actifs antigeniques sont particuli&rement rares et coclteux (3, 7). Les resultats peuvent etre appre- cies a l'oeil nu ou mesures pr6cis6ment avec un spectrophotom6tre. Enfin, l'automatisation de toute la reaction ou de certaines de ses sequences est par- faitement realisable.a Cependant, le test ELISA est encore largement perfectible (1). C'est ce que nous avons tente de faire, depuis 1976, par l'etude systematique des differents parametres de la reaction et notamment de nouveaux substrats revelateurs. 1 Professeur de parasitologie a la Faculte de Medecine de l'Universite de Grenoble, France. 2Assistant de parasitologie a la Facult6 de M6decine de l'Universite de Grenoble, France. a Depuis plusieurs ann6es, l'lnstitut national de la Sant6 publique, a Bilthoven, Pays-Bas, dispose d'une installation automatisee pour le serodepistage de la trichinose par 1'ELISA en macromethode. MATERIEL ET METHODE La technique de base D6rivant de celle de Ruitenberg et coll. (4), reprise par Bullock & Walls (1), elle a ete realisee essen- tiellement avec des conjugues a la peroxydase que, notamment pour les raisons rappelees par Bullock et coll. (1), nous avons preferes aux anti-globulines mar- quees par la phosphatase alcaline. Les diff6rents temps de la reaction sont les suivants. Apres titrage prealable, l'antigene est dilue dans du tampon car- bonate a 0,05 mol/litre, de pH 9,6, puis depose a raison de 100 ,ul dans les alveoles de plaques de microtitration. Apres incubation, les plaques sont lavees pendant 3 fois 5 minutes dans du serum physiologique additionn6 de 0,5 ml de Tween 20 par litre. Dans chaque cupule, on repartit alors 100 ,ul des diverses dilutions des serums etudies en tampon PBS, pH 7,2, avec 0,5 ml de Tween 20 et 10 g de serumalbumine bovine (BSA) par litre. L'incubation est suivie de 3 nouveaux lavages identiques aux pre- cedents, puis on repartit 100 ,ul par cupule d'anti- globulines conjuguees a la peroxydase prealablement portees 'a leur dilution optimale b dans le m8me diluant que pour les serums. Apres contact et nou- veaux lavages, on depose dans chaque alveole 100 ,ul d'une solution d'acide amino-5 salicylique (A-5 S) b Peroxidase conjugated IgG fraction rabbit anti- human IgG (heavy chain specific). Laboratoires Cappel, Cochranville, Etats-Unis d'Amerique. 3724 -609- 610 P. AMBROISE-THOMAS & P. T. DESGEORGES pr6paree extemporan6ment.a On arrete la reaction apres 30 minutes par addition de 15 ,ul de soude 3 N. La lecture est faite a 450 nm. Initialement, cette lec- ture 6tait effectuee dans la cuve d'un spectrophoto- metre, ce qui exigeait le soutirage du liquide contenu dans chaque cupule. Une importante am6lioration pratique a consiste en l'emploi d'un photometre per- mettant la mesure des r6sultats directement dans les plaques de microtitration et 1'enregistrement de ces mesures.b Les parame'tres etudies Les antigenes. Au total, 17 antig6nes parasitaires ont ete testes au cours de notre etude: 8 antig6nes prepares au laboratoire (Toxoplasma gondii, Fasciola hepatica, Echinococcus granulosus, Candida albicans A et B, Aspergillus fumigatus somatique et m6ta- bolique, Cryptococcus neoformans); 2 antigenes pro- venant d'autres centres de recherche (Plasmodiumfal- ciparum, Institut Nuffield, Londres; Trichinella spi- ralis, Institut national de la Sante publique, Bilt- hoven, Pays-Bas); 7 antigenes du commerce (Toxo- plasma gondii, Entamoeba histolytica et Echinococcus granulosus, Behring; Fasciola hepatica, Merieux; Echinococcus granulosus et Schistosoma mansoni, Toxoplasma gondii, Institut Pasteur). La teneur en prot6ines de chaque antig6ne a et6 dosee a 280 nm par rapport a une gamme etalon de proteine humaine standard.C Par des titrages en damiers, on a ensuite determine pour chaque variante technique du test ELISA la quantite optimale de proteines antigeniques. La sensibilisation des plaques de microtitration* Comme Bullock & Walls (1), on a utilis6 des plaques de polystyrene (Cooke Microtiter M129 A) dont la sensibilisation par les antigenes a 6t6 etudiee a dif- ferentes temperatures (4°C, temperature du labora- toire, et 37°C, pendant des temps variant de 1 a 12 heures, avec ou sans agitation et ventilation). Les se'rums. I1 s'agit de plus de 500 s6rums hu- mains comprenant des t6moins n6gatifs, ainsi que des serums homologues des diff6rents antig6nes employ6s a Peser 80hg d'A-5 S (Merck). Les dissoudre dans 100 ml d'eau distill6e a 700 C. Laisser refroidir et ajuster A pH 6 avec NaOH. Filtrer. Au moment de l'emploi, ajouter extemporan6ment 50 ,ul de H,0 i 30 volumes (9%). b Spectrophotom6tre Vernon. Appareil type PHI V pourvu d'un dispositif m6canique permettant le positionne- ment rapide et l'avance des plaques de microtitration ainsi que 1'enregistrement graphique des densit6s optiques. Lyon-Labo, Lyon, France. c Prot6ine humaine standard. Sigma Ref. 540-10. et trouves positifs par d'autres tests serologiques (immunofluorescence indirecte, hemagglutination conditionnee et/ou immunoelectrophorese). Les ren- seignements cliniques et parasitologiques concernant tous ces serums 6taient malheureusement d'in6gale valeur si bien que l'essentiel des 6tudes compar6es a concerne la toxoplasmose (18 s6rums), l'amibiase (17 serums), la trichinose (17 serums), l'hydatidose (17 serums) et l'aspergillose (19 serums). Chaque s6rumaettest6a differentes dilutions (1/20, 1/40, etc., 1/5120), les titrages 6tant dans certains cas r6pet6s 5 fois ou plus. Pour chaque variante de la tech- nique, on a retenu comme optimales les conditions experimentales donnant la plus forte difference de densit6 optique (DO) entre les diffTrents temoins positifs et les s6rums n6gatifs pris a la meme dilu- tion (1/80). Par ailleurs, deux techniques ont ete considerees comme quantitativement comparables si elles donnaient les memes titres d'anticorps pour les serums t6moins. Ce titre correspondait a la plus forte dilution donnant une densit6 optique sup6rieure ou egale a celle des t6moins n6gatifs dilues a 1/20. Les conjugue's et substrats. Si on excepte quelques essais avec des conjugues a la phosphatase alcaline, nous avons surtout employ6 des anti-globulines mar- qu6es A la peroxydase dont la concentration d'em- ploi a W exp6rimentalement determinee dans chaque cas. Comme substrat revelateur de la peroxydase, on a transitoirement 6tudi6 1'orthodianisidine.2 HCl et surtout l'acide amino-5 salicylique.H102 (A-5 S) et l'orthotolidine (OT). Tres chromog6nique, ce der- nier substrat est de pr6paration plus simple que l'A-5 S.4 Il r6v&1e par une coloration bleue la presence de peroxydase. Les lectures. Elles ont ete effectu6es au spectro- photom6tre Vernon, directement dans les plaques de microtitration avec des longueurs d'ondes de 450 nm pour I'A-5 S et de 630 nm pour l'OT. La longueur du trajet optique mesure (hauteur de substrat chromo- gene dans chaque alveole) est, dans nos conditions operatoires, de 3 mm. Par ailleurs, plusieurs series de lectures ont ete r6alisees 'a I'aeil nu par diff6rents observateurs, successivement ou a 5-10 min d'inter- valle. d Dichlorhydrate d'orthotolidine (OT) Merck, ou bien orthotolidine Sigma ou Prolabo. Ce substrat r6v6lateur est extemporan6ment pr6pare de la fagon suivante: dissoudre 21,2 Zg d'OT dans 1 ml de dim6thylformamide. Compl6ter a 100 ml avec du tampon ac6to-acetique rigoureusement a pH 3,7 et ajouter au moment de l'emploi 50 pl de H,O, a 30 volumes (9%). MALADIES PARASITAIRES: ELISA Tableau 1. Immunoperoxydase: les diffdrents temps de la reaction avec l'orthotolidine ou I'acide amino-5 salicylique comme substrats r6v6lateurs Ortho- Acide amino-5 tolidine salicylique Sensibilisation des plaques Lavage Incubation des s6rums Lavage 1 nuit h4*C 1 nuit 34 C 3 x 5 min 3 x 5 min 30 min 120 min 3 x 5min 3 x 5min Incubation du conjugu6 marqu6 30 min Lavage Incubation du substrat Arrit de la coloration Temps total d'incubation et lavage 180 min 3 x 5min 3 x 5min 40 min Tableau 2. Concentrations en protdines des solutions antig6niques pour Il test de micro-ELISA b la peroxydase avec diff6rents substrats Substrat AntiganeAntigbnertotoidne Acide amino-5Orthotolidine salicylique Toxoplasme (Institut Pasteur) 5 i g/ml 40 s g/ml Toxoplasme (Behring) 10 p g/ml 40 p g/ml Trichine (Bilthoven) 5 p gg/ml 20 pu g/ml Hydatique (Grenoble) 2 p g/ml 5 p g/ml Aspergillus (Grenoble) 5 p g/ml 20 pg/ml 30 min - arrgt avec NaOH (3 mol/litre) 1 nuit + 1 nuit + 2 h 25 min 6 h 15 min + d6p6t de NaOH R1SULTATS ET DISCUSSION Execution de la reaction Les meilleurs resultats ont Wt6 obtenus a la tem- perature du laboratoire, sauf pour la sensibilisation des plaques effectuee 'a 4°C. II faut souligner que le temps d'incubation du substrat doit etre imperativement realise a l'obscu- rite et a une temperature ne d6passant pas 20°C. Pour toute temp6rature sup6rieure, il est indispen- sable de verifier la cinetique de la coloration pour determiner le moment optimal des lectures. Pour l'OT et F'A-5 S, les differents temps de la reaction sont indiques dans le tableau 1, l'OT permettant au total un gain de temps de pres de 4 heures. Concentrations d'antigenes et d'anti-globulines neces- saires Dans t'ensemble, les quantites d'antig6nes neces- saires sont de 4 'a 8 fois plus faibles pour le test avec OT. Le tableau 2 resume les resultats obtenus dans une comparaison portant sur 5 types differents de reactifs antigeniques. Par ailleurs, le conjugue anti-globulines A la peroxy- dase peut etre employe a une dilution S fois plus faible si le substrat est l'OT (1/2500 au lieu de 1/500 avec F'A-5 S, pour le conjugu6 employ6). Dans chaque cas, cette dilution optimale du conjugud a ete deter- minee experimentalement comme donnant les titres les plus eleves avec les serums temoins positifs et des <blanks * (temoins conjugues + substrats) dont la DO etait nulle ou negligeable. Lecture des resultats Cine'tiques de la coloration. Les cinetiques de la coloration avec l'A-5 S et avec l'OT sont indiquees dans la figure 1. Pour l'orthotolidine, il est inutile d'arreter la coloration par addition de soude caus- tique. En effet, cette coloration augmente rapidement d'intensite jusqu'a la 40e minute, puis decroit spon- 1,5 - OT : (A 630 nm) A-5 s: (450 nm) 0. 0 O aOH 0,5 / / 0 50 100 WHO 78322 Temps (min) Fig. 1. Micro-ELISA b la peroxydase. Cin6tique de la coloration avec l'orthotolidine (OT) et l'acide amino-5 salicylique (A-5 S). 611 P. AMBROISE-THOMAS & P. T. DESGEORGES tan6ment au-dela de la 50e minute. C'est dans cet intervalle de temps que doivent etre effectu6es les lectures. Ce dMlai peut paraitre court. II est large- ment suffisant avec le spectrophotometre utilise, qui permet sans difficulte de mesurer et d'enregistrer en 5 minutes les DO dans les 96 alveoles d'une plaque de microtitration. En pratique, la duree des lectures est d'ailleurs toujours inferieure aL l'intervalle de temps separant la fin de la r6action dans deux plaques de titration successivement manipul6es, compte tenu de la r6partition des diff6rents reactifs intervenant dans la r6action. Par ailleurs, plusieurs series de tests ont et6 lues a l'oeil nu, donnant dans tous les cas (repetition des lectures a quelques minutes d'in- tervalle par le meme observateur ou bien lectures par des personnes differentes) des titres inchang6s pour les serums t6moins positifs ou, dans moins de 5° des cas, des variations ne depassant pas un degr6 de la gamme de dilution. Sensibilite de la reaction. Elle peut etre appreciee par les diftfrences de DO obtenues pour des serums t6moins positifs ou negatifs. Ceci a et6 pr6cis6ment etudie surtout pour 5 maladies - toxoplasmose, amibiase, trichinose, hydatidose et aspergillose - dans les conditions experimentales et notamment avec les concentrations d'antig6nes precedemment indiquees. Pour rendre plus stricte la sp6cificitM des r6sultats obtenus (tableau 3), ces mesures ont et6 r6alis6es sur des serums positifs dilues 'a 1/80 et sur des serums n6gatifs (7 iL 10 dans chaque cas) dilu6s i 1/20 seulement. Dans tous les cas, la sensibilite du test apparalt comme fortement augment6e avec l'orthotolidine, qui conduit i la difflrence de DO beaucoup plus importante entre les positifs et les Tableau 3. Diff6rences moyennes de densit4s optiques entre s6rums tdmoins positifs et n6gatifs dilu6s A 1/80 (test de micro-ELISA avec l'orthotolidine ou t'acide amino-5 salicylique) Orthotolidine Acide amino-5salicylique Toxoplasmose 0,48 0,29(18 s6rums) (0,34 a 0,73) (0,15 a 0,53) Amibiase 0,94 0,41 (17 s6rums) (0,58 A 1,20) (0,31 A 0,89) Trichinose 0,42 0,18 (17 s6rums) (0,23 A 1,05) (0,06 A 0,74) Hydatidose 0,82 0,25(17 sArums) (0,35 a 1,04) (0,13 A 0,25) Aspergillose 0,90 0,14(19 s6rums) (0,81 A 1,16) (0,09 b 0,21) negatifs et permet par consequent une lecture et une interpretation bien plus faciles des resultats. CONCLUSION Au total, l'emploi de l'orthotolidine comme nou- veau substrat des reactions de micro-ELISA La la peroxydase parait avantageux a plusieurs egards. Par rapport La l'acide A-5 S, ce revelateur permet en effet un important gain de temps et de sensibi- lite du test ainsi qu'une economie considerable de reactifs antigeniques. Ce dernier avantage est parti- culierement important en parasitologie oiu la plupart des antigenes sont rares et coltteux. C'est ainsi qu'il est possible, par cette m6thode, d'etudier cinq dilu- tions differentes d'un s6rum avec 1-5 ,tg seulement de prot6ines antigeniques. Ceci rendra maintenant accessibles certains serodiagnostics jusqu'ici financie- rement inabordables par d'autres methodes avec l'emploi d'antig6nes purifies ou meme de fractions antigeniques specifiques. Dans la mesure oiu il n'exige aucun materiel par- ticulier et oiu ses resultats peuvent etre lus a l'aeil nu, ce test est parfaitement utilisable dans de petits laboratoires simplement equipes. Son emploi pour des enquetes sero-epidemiologiques it partir de micro- prelevements sanguins peut se heurter cependant encore a certaines difficultes (activite peroxydasique du sang total). Inversement la reaction peut, dans les laboratoires specialises, etre assez facilement automatisee, totale- ment ou partiellement. Sa lecture au spectrophoto- mWtre apporte des donn6es precises qui, dans cer- taines limites, peuvent rendre inutile la realisation de gammes completes de dilutions. Cependant, comme le soulignent justement Bullock & Walls (1), il est certainement illusoire de considerer comme suffisante une mesure de DO a une seule dilution des serums. En effet, c'est suivant une sinusoIde et non sur une droite que se r6partissent les DO obtenues pour les dilutions successives d'un echantillon serique. Pour obtenir des donnees quantitatives acceptables, il sera donc probablement n6cessaire de realiser des mesures sur 2 ou 3 dilutions differentes, ce qui, de toute fagon, peut correspondre a une economie conside- rable par rapport aux actuelles gammes de dilutions. C'est a la determination de ces <dilutions-senti- nelles * que nous nous attachons actuellement, tout comme a l'etude des conditions dans lesquelles des plaques de microtitration pourraient etre sensibilisees i l'avance par des antigenes parasitaires et conser- vees dans des conditions les rendant immediatement pretes a l'emploi. 612 MALADIES PARASITAIRES: ELISA 613 REMERCIEMENTS Nous remercions tres vivement M. D. Monget, Laboratoire de l'Institut national des Sciences appliquees, Lyon, France, pour ses conseils et son assistance technique en matiere d'enzymologie. Les antig6nes Plasmodium fakciparum et Trichinella spiralis nous ont ete aimablement fournis, respectivement, par le Dr A. Voller, Nuffield Institute of Comparative Medicine, Londres, et M. E. J. Ruitenberg, Institut national de la Sant6 publique, Bilthoven, Pays-Bas. Nous devons aL l'amitie du Professeur M. Quilici, Laboratoire de Parasitologie, Faculte de Medecine de Marseille, les liquides hydatiques ayant permis la preparation des antigenes Echinococcus granulosus. Enfin, ce travail a Wte effectue avec la collaboration technique de Mile M. M. Lombard. SUMMARY DIAGNOSIS OF PARASMC DISEASES BY MEANS OF ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) USING A MODIFIED MICROMETHOD. 1. TECHNICAL ASPECTS The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has many of the advantages of indirect immunofluorescence and radioimmunology but could still be greatly improved. For this reason the authors studied a new peroxidase substrate-orthotolidine-and a new reading method using a Vernon spectrophotometer allowing a direct reading to be taken in the well of the microtitration plate. The method was compared with a method using 5-amino- salycilic acid as the substrate to visualize the peroxidase. Compared with 5-aminosalycilic acid, orthotolidine made it possible to use 4-8 times less antigen, a 5-times greater dilution (1:2500) of the conjugate labelled with peroxidase, and a much shorter period of incubation; with orthotolidine it was also unnecessary to stop the coloration of the substrate by adding sodium bicarbonate. In fact, the intensity of coloration increased up to 40 min and then decreased spontaneously. With a spe- cially adapted spectrophotometer it was easy to automate the reading of the reaction during this period. The sensitivity of the reaction was studied for five parasitic diseases. The 17 or so positive sera tested for each of the five diseases were diluted 1:80 and the 10 negative sera were diluted 1:20. In all cases the sensi- tivity of the test appeared to be markedly enhanced by orthotolidine, which gave rise to a greater difference in optical density between the positive and negative sera and allowed the results to be read and interpreted more easily. 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