Étude de l'immunité humorale et cellulaire après vaccination antitétanique chez l'enfant africain malnutri et paludéen : 2 : étude in vitro des réponses cellulaires non spécifiques et spécifiques à l'anatoxine tétanique

Bulletin de l'Organisation mondiale de la Sante, 60 (4): 597- 604 (1982) Etude de l'immunite humorale et cellulaire apres vaccination antitetanique chez 1'enfant africain malnutri et paludeen. 2. Etude in vitro des reponses cellulaires non specifiques et specifiques 'a 'anatoxine tetanique* J. J. BALLET,1 M. AGRAPART,2 L. MONJOUR,3 F. BOURDILLON,4 M. KARAM,4 J. M. KYELEM,5 & P. STOECKEL 6 L 'efflcacite de la vaccination antite'tanique a generalement ete evaluee par l'etude de la reponse en anticorps. A l'occasion d'une etude de cette reponse chez 414 enfants voltaiques Jg6s de un d trois ans, nous avonspu aussi re6aliser surplace une etude desfonc- tions cellulaires in vitro. Les donnetes obtenues montrent que la malnutrition moddrde et l'infestation palud6enne n'exercent pas d'effet significatifsur la distribution des re'ponses lymphocytaires aux mitogenes, excepte' dans les cultures de six jours ou' les r6ponses au mitogene de la phytolaque (pokeweed) sont augmentdes. Les r6ponses sp6'cifiques d I'ana- toxine tetanique sont detectables six semaines apres la primovaccination chez plus de 70% des enfants et, apres un rappel, chez plus de 95%. Les comparaisons entre les groupes d'enfants indiquent, dans ce cas aussi, l'absence d'influence de la malnutrition moderee et de l'infection paludeenne sur la distribution des re'ponses lymphocytaires specifiques. Cette premiere etude des reponses cellulaires d'une population de'finie apres vaccination montre enfin qu'il est possible de rdaliser des cultures cellulaires en grand nombre dans les conditions d'un laboratoire non spdcialis,d. On sait que l'infestation parasitaire et l'6tat nutri- tionnel exercent une influence sur l'immunit6 cellu- laire. L'6tude des r6ponses cellulaires en fonction de l'Age chez les sujets atteints de malnutrition ou parasites est donc d'une grande importance pratique pour permettre, non seulement de mieux comprendre les m6canismes des deficits immunitaires secondaires * Cette 6tude a pu Wre r6alisee en partie grace aux subventions de la Mutuelle g6n6rale de l'Education nationale, de l'INSERM, et de la Soci6t6 franqaise d'Immunologie. ' Charge de recherches a l'Institut national de la Sant6 et de la Recherche m6dicale, Laboratoire d'Immunochimie et d'Immuno- pathologie (INSERM U 108), H8pital Saint-Louis, 75475 Paris Cedex 10, France. 2 Technicienne a l'INSERM, HBpital Saint-Louis, Paris, France. 3 Chef de travaux, Assistant des HBpitaux, Laboratoire de Parasitologie, CHU Piti6-Salp6triere, Paris, France. 4 M6decin 6pid6miologiste, Laboratoire de Parasitologie, CHU Piti6-Salp6tri&re, Paris, France. 5 Ministre de la Sante et des Affaires sociales, Ouagadougou, Republique de Haute-Volta. Decede entre-temps. 6 Directeur g6n6ral, Association pour la M6decine pr6ventive, 5 boulevard du Montparnasse, 75006, Paris, France. a la malnutrition et aux parasitoses, mais aussi d'6tablir l'influence de ces facteurs sur les reponses specifiques aux antigenes vaccinaux. La production d'anticorps diriges contre des antigenes proteiques, tels I'anatoxine tetanique, par les cellules de la lign6e plasmocytaire est sous le contr8le direct des cellules de la lign&e lymphocytaire T, responsable des manifestations de l'immunite cellulaire. A l'occasion de la campagne de vaccination anti- tetanique men&e dans la region de Garango (Haute- Volta), nous avons pu adapter sur place les methodes de culture de lymphocytes a l'etude des reponses cellulaires, y compris les reponses specifiques a l'antigene tetanique, chez 303 enfants ages de 1 a 3 ans. Ce travail a e entrepris afin a) d'6tablir si a cet age les r6ponses cellulaires non specifiques sont per- turb&es dans des situations contr8l6es de mal- nutrition et d'infection palud&enne, et b) d'6valuer dans quelle mesure ces facteurs influencent les reponses cellulaires specifiques a un antigene vaccinal proteique, l'anatoxine tetanique. 4211 597- 598 J. J. BALLET ET AL. MATERIEL ET MITHODES Sujets Parmi 414 enfants dont l'immunite humorale a ete exploree (1), 303 ont pu etre etudies, une partie du sang preleve ayant pu etre consacree aux etudes cellu- laires. PrOl6vement des plasmas et isolement des mono- nuclMaires du sang Les prelevements sanguins ont ete centrifuges des leur arrivee au laboratoire (300 g pendant 10 min); apres avoir recueilli les trois quarts superieurs du plasma, et les avoir congeles pour l'etude ulterieure des anticorps, on a aspire le quart inferieur et la partie adjacente du sediment erythrocytaire. Les manipulations ont e effectuees A la temperature ambiante (30 °C), les cellules etant maintenues dans un bain glace ( + 4 °C). Le materiel sterile utilise etait en partie en matiere plastique A usage unique, en partie reutilisable et resterilise chaque jour A l'aide d'un autocuiseur. A la paillasse, la sterilite des mani- pulations etait assuree par l'utilisation d'un bec Bunsen (butane). La fraction de sang riche en leuco- cytes etait diluee deux fois avec de la solution de Hanks reconstituee avec l'eau distillee sterile et placee sur un gradient de Ficoll-metrizonate.° Le gradient etait alors centrifuge pendant 30 min a 400 g, et l'on recueillait les mononucleaires qui avaient sedimente a l'interface. Apres trois lavages avec de la solution de Hanks, les cellules etaient compt&es a l'hemocytometre et leur viabilite verifiee (exclusion du bleu trypan). Cultures cellulaires Les mononucleaires etaient remis en suspension a une concentration de 106/ml dans du milieu de culture RPMI 1640b contenant 10% de serum humain d6complement6 provenant de donneurs AB Rh-positifs, des antibiotiques (<antibiotic-anti- mycotic solution>>)b a la dilution finale de 1:100, et de la glutamineb a la dilution finale de 1:100. Cette suspension etait repartie dans des microplaques pour culturesC A raison de 200 000 cellules par cupule. Les microplaques etaient plac6es dans des caissons etanches dont l'humidification interieure est assuree par des boi^tes de Petri ouvertes contenant de l'eau, et dans lesquels une concentration de CO2 de l'ordre de 5% 6tait obtenue A l'aide de deux bougies allum6es au moment de la fermeture. Les caissons etaient places dans une etuve bacteriologique A 37 'C. a Lymphoprep, Pharmacia, (78) Le Chesnay, France. b Gibco, Glasgow, Ecosse. c Microtest II, Falcon B.D., Oxnard, CA, Etats-Unis d'Am& rique. MitogMnes et antigMnes La phytoh6magqlutinine, le mitogene de la phyto-laque (pokeweed) et l'anatoxine tetanique' ont ete ajoutes aux cultures (A raison de 20 jl/cupule) aux concentrations finales respectives de 1:600, 1:50, et 10 ug/ml. Mesure de la prolif6ration cellulaire On ajoutait, 18 heures avant de recueillir les cellules, 0,074 MBq (2 ACi) de thymidine tritieef(activite specifique: 148 MBq/Mmol-4 mCi/Amol) aux cultures (A raison de 20 ,l/cupule). Les cellules etaient recueillies a la micropipette: 100 Ml etaient preleves dans chaque cupule de la plaque apres remise en suspension des cellules, et deposes sur un filtre circulaire Whatman 3MM (diametre: 2,4 cm) suspendu a une epingle fichee sur un support; apres dessiccation, les filtres etaient places dans de l'acide trichloracetique a 100 g/litre pendant une heure, puis de nouveau seches et conserves dans des boi^tes etanches contenant du dessiccatif. Ulterieurement, au laboratoire de l'H8pital Saint-Louis, les filtres etaient laves, et la radio-activite mesuree avec un compteur A scintillation liquide. Pour chaque essai, deux cultures differentes ont e faites. Les resultats (moyenne des comptes de deux cultures) sont expri- mes en coups par minute (cpm) de thymidine triti&e incorporee rapportes a 106 cellules mises en culture. Lorsqu'un stimulant a ete ajoute aux cultures, on a exprime l'incorporation de thymidine tritiee qu'il a induite par la valeur Acpm rapportee A 106 cellules mises en culutre. Acpm represente l'incorporation (cpm) dans les cellules de la culture stimulee moins l'incorporation (cpm) dans les cellules de la culture non stimulee. La comparaison des distributions observees dans les divers groupes d'enfants a ete faite par le test de Kolmogorov-Smirnov (2). RESULTATS Isolement des mononuclMaires Les prelevements faits sur 311 enfants sont par- venus au laboratoire dans les conditions prevues; parmi ces prelevements, 2 etaient inutilisables et 6, de volume insuffisant, n'ont permis qu'une etude partielle. Les 303 autres, d'un volume compris entre 2 et 7 ml, ont permis d'obtenir en moyenne 11,8 millions de mononucleaires par donneur (entre 2 et 56 millions). Lorsque la viabilite cellulaire a ete veri- d Lederle, Madrid, Espagne. e Massachusetts Biological Laboratories, Boston, MA, Etats- Unis d'Amerique. J' Commissariat & l'Energie atomique, Saclay, France. IMMUNITE APRtS VACCINATION ANTITETANIQUE. 2. fiee, plus de 95 7o des mononucleaires excluaient le bleu trypan. Les conditions de prelevement ont donc permis d'obtenir, pour la plupart des enfants, le minimum de 2,4 millions de cellules necessaires a l'etude prevue. L'organisation du laboratoire a permis a l'un d'entre nous de realiser les cultures de 16 a 24 prelevements quotidiens pendant un mois et demi. R&alisation des cultures Les reponses proliferatives ont ete mesurees, pour chaque sujet, au troisieme jour de culture pour la phytohemagglutinine (PHA) et le mitogene de la phytolaque, et au sixieme jour pour le mitogene de la phytolaque et l'anatoxine tetanique. Douze cupules de microplaque ont donc ete utilisees par donneur, soit plus de 3600 au total. Sur l'ensemble des cultures, seules douze cupules (soit moins de 0,4%) ont subi une contamination bacterienne. Incorporation spontan6e de thymidine tritiete En l'absence de toute stimulation, l'incorporation spontanee de thymidine tritiee a ete de 3877 ± 2705 cpm/106 cellules (cultures de 3 jours), et de 2649± 1301 cpm/106 cellules (cultures de 6 jours), ce qui confirme le maintien d'une viabilite cellulaire satisfaisante dans les conditions de culture utilisrees. Re6ponses prolife'ratives aux lectines au troisieme jour de culture Dans les cultures stimulees par la PHA et recoltees au troisieme jour, l'incorporation moyenne induite par la lectine a ete de 145 304±81 679 cpm/106 cellules, contre 33 336 ± 24 777 cpm/106 cellules pour les cultures stimulees par le mitogene de la phytolaque. La figure 1 indique la distribution des reponses dans l'ensemble de la population etudiee: elles sont decelables dans la quasi-totalite des cas, et leur distribution n'est pas significativement diffe- rente selon qu'il y a eu une ou deux injections de vaccin (P>0,05). De meme, ni la malnutrition, ni l'infestation paludeenne ne modifient la distribution des reponses a la PHA et au mitogene de la phyto- laque (P>0,05). Reponses proliferatives induites par le mitogene de la phytolaque au sixieme jour de culture L'incorporation de thymidine induite par le mito- gene de la phytolaque a e en moyenne de 27 169±32 130 cpm/106 cellules, mais les reponses etaient nettement plus elev&es chez les sujets ayant requ deux administrations de vaccin (P<0,001) (Fig. 2). Cette difference est particulierement nette chez les sujets paludeens (P<0,001); elle est moins marquee chez les sujets non paludeens, et moins marquee aussi chez les sujets atteints de malnutrition (P< 0,05) que chez ceux dont l'etat nutritionnel etait bon (P<0,001) (Fig. 3). R6ponses prolif6ratives sp&ifiques induites par l'antigMne tdtanique Cette etude a permis d'etablir qu'une reponse pro- liferative specifique pouvait etre detectee apres primovaccination par l'anatoxine tetanique (dans 67% des cas dans les conditions de notre enquete). La proliferation induite (Acpm) a ete de 206 ± 762 cpm/106 cellules, en moyenne. Apres deux injections, les reponses sont en moyenne plus elevees (1201 ± 1601 cpm/106 cellules, P<0,001) et il n'y a alors plus que 7,1 % des sujets chez lesquels on ne peut deceler de reponse. Bien que les nombres soient trop faibles pour permettre une interpretation valide, une population de sujets ((hauts r6pondeurs>> semble apparaitre (Acpm entre 60 000 et 11 000 cpm/106 cellules) (Fig. 3). Ni apres une seule, ni apres deux injections il n'y a de difference significative entre les distributions des reponses des populations en bon etat et en mauvais etat de nutrition, ou paludeenne et non paludeenne quant aux reponses specifiques A l'antigene (P<0,05) (Fig. 3). DISCUSSION Au cours d'une vaccination antitetanique de masse dans une region rurale de Haute-Volta, et a l'occa- sion de prelevements sanguins effectues chez 414 enfants pour verifier le taux des anticorps seriques, nous avons pu realiser sur place une etude in vitro de l'immunite cellulaire. La connaissance, pour chaque enfant, de l'etat de sante et des conditions de vaccination nous a permis d'etablir des compa- raisons significatives entre groupes, en fonction du nombre d'injections de vaccin (une ou deux), de l'existence ou de l'absence prouvees d'une infesta- tion paludeenne, et de l'etat de nutrition apprecie en fonction de criteres objectifs. Un seul prelevement sanguin par enfant a ete necessaire, l'utilisation de microtechniques de culture cellulaire ne demandant que de faibles quan- tites de sang. Notre travail demontre que des resultats significatifs peuvent etre obtenus dans les conditions d'un laboratoire non specialise, modifie en vue de manipulations steriles. Dans l'ensemble, l'incidence sur les resultats des conditions de trans- port des prelevements et des conditions de culture a e du meme ordre que ce que l'on observe dans un contexte urbain developpe. A titre de comparaison, les valeurs obtenues dans un laboratoire specialise chez cent donneurs normaux dans des conditions 599 J. J. BALLET ET AL. 80 70 0 50 40 30 20 10 0 sO 70 60 50 40 30 20 10 = C s0 R 70 ° B0 450 30 z 20 o10 PS C0 0. 0 U cc S. 80 70 U 50 40 30 20 10 0 70 40 30 10 .0 PHYTOHEMAGGLUTININE - POPULATION TOTALE (N=294) 80 70 '60 50 40 30 20 10 0 -101 5 10 15 20 25 30 35 40 AcpmxlO4/106cell - SUJETS MALNUTRIS (N=63) _t . . -101 5 10 15 20 25 30 35 40 AcpmxlO41O06cell SUJETS BIEN NUTRIS (N=127) I -101 5 10 15 20 25 30 35 40 ACpmxl104/16cell I-. SUJETS PALU0tENS (N=97) S-|ewEzS 6 -101 5 10 15 20 25 30 35 40 AcpmxlO4/106ce11 K- SUJETS NON PALU0gENS (N=134) T. I I. ->> '-e',----- 80 70 60 50 40 30 20 10 80 60 50 40 30 20 10 0 80 70 M0 50 40 30 20 10 0 60 70 60 50 40 30 20 10 MITOGtNE DE LA PHYTOLAGUE POPULATION TOTALE (N=290) -101 5 10 15 20 25 Acpm xl104/1lO6cull SUJETS MALNUTRIS (N=63) -101 5 10 15 20 25 Acpmx SUJETS BIEN NUTRIS (N=125) F~~~~~~&p X 14/06 1l -101 5 10 15 20 25 tcpmxlf4/lO6cel SUJETS PALUDSENS (N94) I~~~~~~~~~~~~4 It:::::ll -101 5 10) 15 20 25 tcPmxlctclO6celI SUJETS NON PALUOUENS (N=134) -101 5 10 15 20 25 30 35 40 tcpmx104/106celI -101 5 10 15 20 25 Acpmx104i6c1 R PONSES PROLIFiRATIVES LYMPHOCYTAIRES o 82349 Fig. 1. Distribution des reponses prolifhratives lymphocytaires (en Acpm/106 cellules mises en culture) aux lectines (cultures de 3 jours) chez 1'ensemble des enfants 6tudi6s et dans les groupes en bon et en mauvais Mtat nutritionnel, et paludhen et non paludeen. N = nombre d'enfants dans chaque groupe. - * - -5 - - | | | u - I I ;. ; 600 IMMUNITt APRtS VACCINATION ANTITATANIQUE. 2. 70 0 50 40 30 20 10 POPULATION TOTALE (1N=290) 101 5 10 15 20 25 ACPMX1O4/1t1311gl UNE INJECTION VACCINALE (N111371 101.5... 10 1 20 2i .... ... 0 1 0 2 cp 0/ 6cl 70 so 11 so -40 20- 10 0 -1 0 1 DEUX INJECTIONS VACCINALES (N=153) ......... ,..- 5 10 15 20 25 atpnx i4/106ieti R*PONSES PROLIFtRATIVEI UNE INJECTION Suits malnutris (N=20J M VACCINALE Suists bion nutris (N=S3) -101 5 10 15 20 25 Acpmxl UNE INJECTION Suaits paludhns (1N31) VACCINALE Sujets non peludisns (N=71) J 70 50 30 - -101 5 10 15 20 25 tcpmnxit/ioI il DEUX INJECTIONS Sujet mlnutris (N=41) VACCINALES Suje bien nutris (N41) CM 70 60 40- 20- 10 0 -101 5 10 15 20 25 ncpmxl104/l06cII DEUX INJECTIONS SuiNt pahudhns (NW=4) VACCINALES Sujts non phluidns (N4=65) : 70 501 40- 20:- 10 -101 5 10 15 20 25 ecpmx tltm41O5oU- *I VMDUnfVTA IbC@ W0 82347 Fig. 2. Distribution des r6ponses prolif6ratives lymphocytaires (en Acpm/1 06 cellules mises en culture) aux mito- gAnes de la phytolaque (cultures de 6 jours) chez 1'ensemble des enfants et en fonction du nombre d'injections vacci- nales, de I'6tat nutritionnel et de l'infection paludhenne. N = nombre d'enfants dans chaque groupe. 70 s 50 30 20 10 0 8 S I--5 ,.. 2 5 w C C Sa. 70 so 50 40 30 20 10 0 601 P 165rUvWV IAIl"C6 0. J. BALLET ET AL. UNE INJECTION VACCINALE (N=139) 80 70 OD 50 40 30 20 10 0 UNE INJECTION Sumis mulnutris (N=20) VACCINALE Sujets biun nutris (N=64) L .UNE INJECTION VACCINALE AL 80 70 60 50 40 30 20 10 0ILfl;K*- I- I -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 a cpm x 1041106 Sujots paludins (N=32) 1 Sujets non pkludens (N=71) : 80 70 so 50 40 30 20 10 peI 0 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 acpmxlO4/106 DEUX INJECTIONS VACCINALES (N=154) ..... .,_ -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 910 11 &CpmXlO4/106 OEUX INJECTIONS Sujets mainutris (N42) VACCINALES Sujets bion nutris (N=61) E: ti-L -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 910 11 acpmxl04/106 DEUX INJECTIONS Sujets puluddens (N465) VACCINALES Suiets non paluddens (N=64) 'L S~~~_n -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 910 11 Lcpmx104/106 REPONSES PROLIF RATIVES LYMPHOCYTAIRES wMO 82348 Fig. 3. Distribution des rAponses prolifAratives lymphocytaires (en Acpm/1 06 cellules mises en culture) I'antig&ne t6tanique (cultures de 6 jours) chez 1'ensemble des enfants 6tudi6s et en fonction du nombre d'injections vaccinales, de l'6tat nutritionnel et de l'infection paludhenne. N = nombre d'enfants dans chaque groupe. comparables de culture et de marquage des cellules ont 6t6 en moyenne les suivantes au troisieme jour de culture: cultures non stimul6es: 4650 ± 1770 cpm; stimul6es par la PHA: 231 819 ± 130 cpm; stimul6es par la phytolaque: 51 205 ± 34 447 cpm; et au sixiame jour: cultures non stimul6es: 2740 cpm ± 1266 cpm; stimul6es par la phytolaque: 24 862 cpm ± 27 912 cpm (pour 106 cellules mises en cul- ture). L'ensemble des donn6es obtenues dans notre enquete peuvent donc etre consid6r6es comme comparables aux donn6es ant6rieures. Les r6ponses prolif6ratives A la PHA et au mito- gene de la phytolaque observees au deuxieme ou troi- sieme jour de culture sont li6es A la pr6sence d'un nombre suffisant de cellules T fonctionnelles, comme en t6moigne leur diminution quantitative ou meme leur abolition au cours des d6ficits immuni- taires cellulaires importants (3). La distribution des r6ponses aux lectines, qui ont 6t6 d6celkes chez la quasi-totalite des sujets de notre enquete, n'est pas modifiee de fafon significative dans les groupes en 6tat de malnutrition ou palu- d6en. Une d6pression mod6r6e de ces r6ponses et 6galement une diminution mod6ree du nombre de 80 so70 40 50 40 30 20 10 0 80 70 0.0 c 50 ' 40 w o 30 Z 20 10 70 c0 50 40 30 20 10 0 I W A ' Y , .................. X . . __ 1 _-'ZA ,.,602 . IMMUNITt APRtS VACCINATION ANTITtTANIQUE. 2. cellules T circulantes ont ete observees chez les paludeens adultes (4, 5). Notre constatation d'une reponse aux lectines quantitativement normale chez des enfants infestes n'exclut pas une certaine diminu- tion de leurs lymphocytes T circulants (observations personnelles de deficits immunitaires primitifs); cependant, il serait important de verifier compara- tivement si cette relative conservation des fonctions T chez nos sujets est en rapport avec leur age et/ou la duree relativement limit&e de leur exposition au parasite. Nos resultats suggerent egalement que l'administration prealable ou simultanee d'antipalu-' diques dans le groupe considere comme non palu- deen n'a pas modifie sensiblement les reponses, mais des etudes complementaires comportant des sujets temoins seraient n6cessaires pour mieux connafitre ces effets (6). Au cours des denutritions severes, une diminution des reponses aux lectines a ete observee (7), mais les effets des d6nutritions moderees (poids corporel entre 6007o et 70% de la norme du poids pour l'age) demeurent limites (8). C'est ce que confirme notre etude, qui montre, dans son ensemble, que le nombre de cellules T fonctionnelles circulantes n'est pas notablement perturbe par les parametres parasi- taires et nutritionnels. La proliferation induite par le mitogene de la phytolaque au sixieme jour de culture fait intervenir les cellules B, dont la reponse depend de la presence auxiliaire de cellules T fonctionnelles (9). Les re- ponses plus elev6es observees apres deux vacci- nations sont a rapprocher de l'augmentation de l'activite et/ou du nombre de cellules B specifiques mises en evidence dans les semaines qui suivent l'immunisation (10). Le fait que ce phenomene est plus marque chez les palud6ens peut etre lie a l'acti- vation lymphocytaire <polyclonale> observee au cours de cette parasitose (11). Les reponses proliferatives aux antigenes mesurees in vitro au sixieme jour explorent une fonction lymphocytaire T specialisee, qui est tres generale- ment perturbee au cours des deficits meme partiels de l'immunite cellulaire (12). Pour l'antigene teta- nique, elle implique une fonction macrophagique adequate (13). Notre choix des delais d'etude apres immunisation a e fond& sur les donnees d'etudes limit&es effectu6es pr6cedemment (14). La cinetique du developpement des reponses cellulaires n'ayant pas e't prealablement etablie, il est cependant possible que nous n'ayons pas mesure les reponses les plus elevees. Nos donn&es etablissent que des reponses proliferatives specifiques pouvaient etre mises en evidence 6 a 8 semaines apres immunisation primaire. La notion de primovaccination, assur&e dans l'ensemble par l'age des sujets et l'absence de vaccination anterieure connue, doit tenir compte, comme en ce qui concerne la r6ponse en anticorps, de la possibilite de l'acquisition d'une immunite o naturelle > decelable au niveau cellulaire. En l'absence de groupe etudie avant vaccination, nos donn6es ne permettent pas d'en evaluer l'impor- tance. Dans les conditions de notre &tude, l'immuni- sation a entra.ne l'apparition de cellules T specifiques chez pres de 70% des primovaccin6s, et chez la plupart des sujets ayant recu deux injections. Ces resultats, recueillis chez l'enfant de 11 mois a 3 ans, completent les etudes anterieures qui montraient que les reponses cellulaires specifiques sont peu alterees par des etats moderes d'infestation et de denutrition, alors que la denutrition entraine une atrophie des zones lymphoides thymodependantes (15) et une alteration des reponses cellulaires aux antigenes (16). Le fait que nous ayons constat6 dans notre enquete que les reponses primaires sont peu modifiees par les facteurs paludisme et d6nutrition nous paralt une justification supplementaire de la pratique des vaccinations des la petite enfance, dans la mesure oiu ces facteurs peuvent jouer ult6rieure- ment un r8le plus important sur les reponses primaires. Dans l'ensemble, ce travail nous a permis d'adapter avec succes les methodes de culture cellu- laire aux conditions d'un laboratoite non sp6cialis6 en milieu africain. L'etude des reponses lymphocy- taires a d6montr6 qu'une infestation par Plasmo- dium falciparum ou une d6nutrition mod6r6e ne s'accompagnait pas, chez de jeunes enfants en milieu rural, d'anomalies importantes des fonctions cellu- laires T in vitro, y compris les reponses sp6cifiques A un antig6ne proteique. Elle a permis d'observer au niveau cellulaire l'Ntablissement d'une immunite specifique detectable des la primovaccination chez un nombre important de sujets. Les methodes que nous avons utilis6es, et qui peuvent etre adaptees A d'autres types de cultures, permettent d'aborder au niveau cellulaire les mecanismes des anomalies des reponses immunitaires observees au sein de populations humaines. REMERCIEMENTS Nous remercions de leur aide le Dr Triau, Institut Mrieux, Lyon, France; le Dr Daguillard, I.C.I.G., Villejuif, France; le Dr Griscelli, Hopital des Enfants-Malades, Paris, France. 603 604 J. J. BALLET ET AL. SUMMARY HUMORAL AND CELLULAR IMMUNITY AFTER TETANUS IMMUNIZATION IN MALNOURISHED OR MALARIA-INFECTED AFRICAN CHILDREN. 2. IN VITRO STUDY OF SPECIFIC AND NON-SPECIFIC CELLULAR RESPONSES TO TETANUS TOXOID During a mass-immunization programme against tetanus in a rural area of Upper Volta, and using blood samples collected for the measurement of antibody levels, an in vitro study of cellular immune responses was performed in 303 children, 11 months-3 years of age. Lymphocyte culture techniques were adapted for use under field laboratory conditions. For each child, prolifer- ative responses to lectins (phytohaemagglutinin and poke- weed mitogen) were studied after 3 days of culture and responses to pokeweed mitogen and tetanus toxoid after 6 days. Cellular responses were compared among groups of chil- dren in order to determine the influence of nutritional conditions and malarial infection on non-specific and anti- gen-specific responses after a primary or booster immun- ization with tetanus toxoid. In 3-day lymphocyte cultures, responses to lectins were similarly distributed in both well nourished and moderately malnourished groups, and in those infected and not infected with malaria. No influence of the number of toxoid injections was observed. In 6-day cultures, responses to pokeweed mitogen were significantly higher in the children who received two immun- izations, especially among malnourished and malaria- infected children. It was observed that tetanus-specific lymphocyte proliferation could be detected in 69% of children after primary immunization. In the group that received a booster injection, responses were present in more than 92% of children. In both cases, the distribution of res- ponses was not affected by moderate malnutrition or malaria infection. Our data demonstrate also that it is possible to carry out in the field in vitro studies of cellular immune responses on large numbers of subjects. BIBLIOGRAPHIE 1. MONJOUR, L. ET AL. Bulletin de l'Organisation mondi- ale de la Sante', 60: 589- 596 (1982). 2. YOUNG, I. T. Journal of histochemistry and cyto- chemistry, 25: 935-941 (1977). 3. HOROWITZ, S. D. & HONG, R. The pathogenesis and treatment ofimmunodeficiency. B&ile, S. Karger, 1977, p. 61. 4. GREENWOOD, B. H. ET AL. Lancet, 1: 169-172 (1972). 5. WELLS, R. A. ET AL. Clinical and experimental immu- nology, 35: 202 - 209 (1979). 6. THONG, Y. H. 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