Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures

Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures [Master protocol for surveillance of pfhrp2/3 deletions and biobanking to support future research] ISBN 978-92-4-000849-6 (version électronique) ISBN 978-92-4-000850-2 (version imprimée) © Organisation mondiale de la Santé 2020 Certains droits réservés. La présente publication est disponible sous la licence Creative Commons Attribution – Pas d’utilisation commerciale – Partage dans les mêmes conditions 3.0 IGO (CC BY NC-SA 3.0 IGO ; https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/igo). Aux termes de cette licence, vous pouvez copier, distribuer et adapter l’œuvre à des fins non commerciales, pour autant que l’œuvre soit citée de manière appropriée, comme il est indiqué ci dessous. Dans l’utilisation qui sera faite de l’œuvre, quelle qu’elle soit, il ne devra pas être suggéré que l’OMS approuve une organisation, des produits ou des services particuliers. L’utilisation de l’emblème de l’OMS est interdite. Si vous adaptez cette œuvre, vous êtes tenu de diffuser toute nouvelle œuvre sous la même licence Creative Commons ou sous une licence équivalente. Si vous traduisez cette œuvre, il vous est demandé d’ajouter la clause de non responsabilité suivante à la citation suggérée : « La présente traduction n’a pas été établie par l’Organisation mondiale de la Santé (OMS). L’OMS ne saurait être tenue pour responsable du contenu ou de l’exactitude de la présente traduction. L’édition originale anglaise est l’édition authentique qui fait foi ». Toute médiation relative à un différend survenu dans le cadre de la licence sera menée conformément au Règlement de médiation de l’Organisation mondiale de la propriété intellectuelle. Citation suggérée. Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures [Master protocol for surveillance of pfhrp2/3 deletions and biobanking to support future research]. Genève : Organisation mondiale de la Santé ; 2020. Licence : CC BY-NC-SA 3.0 IGO. Catalogage à la source. Disponible à l’adresse http://apps.who.int/iris. Ventes, droits et licences. Pour acheter les publications de l’OMS, voir http://apps.who.int/bookorders. Pour soumettre une demande en vue d’un usage commercial ou une demande concernant les droits et licences, voir http://www.who.int/about/licensing. Matériel attribué à des tiers. Si vous souhaitez réutiliser du matériel figurant dans la présente œuvre qui est attribué à un tiers, tel que des tableaux, figures ou images, il vous appartient de déterminer si une permission doit être obtenue pour un tel usage et d’obtenir cette permission du titulaire du droit d’auteur. L’utilisateur s’expose seul au risque de plaintes résultant d’une infraction au droit d’auteur dont est titulaire un tiers sur un élément de la présente œuvre. Clause générale de non responsabilité. Les appellations employées dans la présente publication et la présentation des données qui y figurent n’impliquent de la part de l’OMS aucune prise de position quant au statut juridique des pays, territoires, villes ou zones, ou de leurs autorités, ni quant au tracé de leurs frontières ou limites. Les traits discontinus formés d’une succession de points ou de tirets sur les cartes représentent des frontières approximatives dont le tracé peut ne pas avoir fait l'objet d'un accord définitif. La mention de firmes et de produits commerciaux ne signifie pas que ces firmes et ces produits commerciaux sont agréés ou recommandés par l’OMS, de préférence à d’autres de nature analogue. Sauf erreur ou omission, une majuscule initiale indique qu’il s’agit d’un nom déposé. L’Organisation mondiale de la Santé a pris toutes les précautions raisonnables pour vérifier les informations contenues dans la présente publication. Toutefois, le matériel publié est diffusé sans aucune garantie, expresse ou implicite. La responsabilité de l'interprétation et de l'utilisation dudit matériel incombe au lecteur. En aucun cas, l’OMS ne saurait être tenue responsable des préjudices subis du fait de son utilisation. Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | iii Clauses de non-responsabilité 1. L’OMS a rédigé ce protocole original, qu’il est recommandé de suivre. Il servira de guide pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique dans les pays d’endémie du paludisme. Toutefois, l’OMS ne reconnaît aucune responsabilité dans le cadre des études menées par des tiers conformément à ce protocole. 2. Les études menées par des tiers ne sauraient être considérées comme des « études OMS ». Les approbations locales et/ou nationales nécessaires doivent être obtenues au préalable. Titre Site(s) d’étude Site 1 : Nom, ville, district et province Site 2 : Nom, ville, district et province Site 3 : Nom, ville, district et province (Au besoin, ajouter des sites supplémentaires, ou inclure uniquement les canton/département et joindre une annexe répertoriant les établissements de soins concernés.) Date de soumission du protocole jj/mmm/aaaa Numéro de protocole Numéro de protocole unique/numéro de version Investigateur principal Nom : Diplôme : Établissement : Adresse : rue, ville, code postal, pays Tél. : E-mail : Co-investigateurs (insérer des noms supplémentaires, si nécessaire) Nom : Diplôme : Établissement : Adresse : rue, ville, code postal, pays Tél. : E-mail : Établissements participants (au besoin, insérer des établissements supplémentaires) Nom : Adresse postale complète : rue, ville, code postal, pays Tél. : E-mail : Dates d’étude prévues De mmm/aaaa à mmm/aaaa Promoteur Ministère de la Santé, pays Adresse postale complète : rue, ville, code postal, pays Tél. : E-mail : Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | iv Résumé du projet Objectifs Cette enquête vise à déterminer si la prévalence locale des mutations des gènes hrp2/3 de P. falciparum (pfhrp2/3) à l’origine de faux négatifs aux tests de diagnostic rapide (TDR) a atteint un seuil pouvant justifier une modification locale ou nationale de la stratégie de diagnostic. Les objectifs sont les suivants : 1. Mesurer la prévalence des suspicions de faux négatifs au TDR de la protéine II riche en histidine (HRP2) chez les patients symptomatiques consultant dans des établissements de soins publics pour une infection à P. falciparum détectée par examen microscopique ou TDR de la lactate déshydrogénase de P. falciparum (Pf-LDH) ; 2. Déterminer la densité parasitaire et la fréquence des délétions des gènes pfhrp2/3 au sein de cette cohorte ; 3. Estimer la valeur prédictive des faux négatifs au TDR HRP2 concernant les délétions des gènes pfhrp2/3 dans différents contextes ; 4. Identifier les provinces où la prévalence des délétions des gènes pfhrp2/3 entraînant des faux négatifs aux TDR de P. falciparum est supérieure ou égale à 5 %, justifiant un changement de stratégie. La mise en banque de matériel biologique vise à favoriser les recherches épidémiologiques ultérieures sur le paludisme et la mise au point et/ou l’amélioration de produits de santé, notamment de produits ciblant les parasites porteurs de délétions des gènes pfhrp2/3. Sites de surveillance Établissements de soins publics présélectionnés représentatifs des divers modes de transmission et de la diversité géographique du pays Population cible Personnes satisfaisant la définition du cas suspect de paludisme Type d’enquête Transversale, multicentrique Critères d’évaluation principaux 1. Prévalence des suspicions de faux négatifs au TDR HRP2 chez les patients symptomatiques atteints de paludisme à P. falciparum 2. Prévalence des délétions des gènes pfhrp2/3 chez les patients symptomatiques atteints de paludisme à P. falciparum obtenant un faux négatif au TDR HRP2 3. Prévalence des délétions des gènes pfhrp2/3 entraînant des faux négatifs aux TDR HRP2 pour l’ensemble des cas symptomatiques confirmés de paludisme à P. falciparum Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | v Critères d’évaluation secondaires (facultatifs) 1. Densité parasitaire mesurée par amplification en chaîne par polymérase (PCR) quantitative et/ou examen microscopique en cas de suspicion de faux négatifs au TDR HRP2. 2. Nouvelles données sur l’épidémiologie des délétions des gènes pfhrp2/3, notamment sur leur diversité génétique et la présence d’une pharmacorésistance ; nouveaux outils et outils améliorés pour le diagnostic des parasites porteurs de délétions des gènes pfhrp2/3. Taille de l’échantillon Il est recommandé d’utiliser une taille d’échantillon de 370 cas confirmés d’infection à P. falciparum par domaine d’échantillonnage (soit 37 par établissement de soins) pour déterminer si la prévalence des délétions du gène pfhrp2 est supérieure ou non à 5 %. La confirmation moléculaire des délétions du gène pfhrp2 chez les cas faux négatifs suspects devra être réalisée une fois les 370 cas d’infection à P. falciparum recrutés. Méthode d’échantillonnage Une enquête transversale mesurera la prévalence des cas suspects et des cas confirmés de délétions des gènes pfhrp2/3 entraînant des faux négatifs au TDR HRP2 dans au moins 10 établissements de soins présélectionnés par domaine d’échantillonnage, par exemple par province exposée au paludisme. Chaque établissement de soins devra inclure 37 cas confirmés d’infection à P. falciparum. Collecte des données 1. Identifier les provinces à inclure dans l’étude. 2. Sélectionner au moins 10 établissements de soins en vue des tests (la taille de l’échantillon dans chaque établissement pourra varier en fonction des contraintes logistiques et budgétaires). Tous les établissements où des TDR sont utilisés seront éligibles. À l’inverse, l’accès aux examens microscopiques n’est pas obligatoire. 3. Dans la population cible (cas suspects de paludisme), prendre en charge les cas selon les procédures habituelles et obtenir le consentement éclairé des patients (ou leur assentiment, selon l’âge de la majorité et les lignes directrices fédérales dans le pays de recrutement) pour la réalisation d’un TDR supplémentaire et le prélèvement d’une goutte de sang séchée (DBS) en vue des analyses en laboratoire et de la mise en banque de matériel biologique/de la conservation à long terme pour les besoins de la recherche épidémiologique et diagnostique ultérieure sur le paludisme. 4. Relever les antécédents cliniques, notamment l’âge, le sexe, les tests de diagnostic récents du paludisme, les traitements antipaludiques et les voyages. 5. Tester simultanément tous les patients consentants suspects de paludisme au moyen d’un TDR HRP2 recommandé par l’OMS et d’une méthode autre que HRP2 (par exemple, TDR Pf-LDH [TDR distinct à ligne test unique ou à lignes tests multiples] ou examen microscopique de qualité éprouvée) au sein de l’établissement de Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | vi soins et prélever au moins deux gouttes de sang sur papier-filtre ou cartes Protein Saver. 6. Consigner les données démographiques et les antécédents cliniques ainsi que tous les résultats de tests dans le cahier de recherche formalisé. 7. Administrer le traitement antipaludique sur la base des résultats de (l’un des) TDR et/ou de l’examen microscopique et conformément aux lignes directrices nationales. 8. Conserver les TDR utilisés à des fins de contrôle de la qualité et au minimum deux DBS de chacun des patients infectés par Pf consentants en vue de l’analyse moléculaire +/- sérologique. 9. Le recrutement pourra prendre fin dès lors que le diagnostic de paludisme à P. falciparum aura été confirmé chez 370 personnes (dans l’idéal, environ 37/site parmi les 10 sites d’une province donnée) et que ces cas auront été consignés sur la feuille de pointage. 10. Expédier l’ensemble des formulaires de consentement, des feuilles de pointage, des cahiers de recherche formalisés et des échantillons au centre de coordination central. 11. Le personnel du laboratoire central examinera les cahiers de recherche formalisés et identifiera les cas suspects de délétions des gènes pfhrp2/3 puis hiérarchisera les DBS correspondantes en vue de l’analyse moléculaire +/- sérologique. 12. Effectuer une analyse supplémentaire des données sur la base de la hiérarchisation et des ressources disponibles, à savoir échantillons positifs pour HRP2 et échantillons négatifs pour HRP2 et pf-LDH (possibilités décrites en Annexe 1). 13. Jeter l’ensemble des TDR, lames de microscopie et des DBS une fois les résultats de l’enquête finalisés et publiés, sauf si les sujets ont donné leur consentement pour la conservation à long terme des DBS. Plan statistique et analytique La prévalence des suspicions de faux négatifs au TDR HRP2 et des délétions des gènes pfhrp2/3 sera établie par domaine d’échantillonnage (par exemple, à l’échelle de la province), avec des intervalles de confiance (IC) à 95 % pour chaque estimation ponctuelle. Il sera possible de pondérer les estimations ponctuelles et les IC à 95 % en fonction de la taille relative de l’établissement ou de la circulation des patients. Les différences entre les estimations ponctuelles pour les diverses caractéristiques démographiques et les divers niveaux de transmission ou entre d’autres variables collectées pourront être déterminées par test du X2 et/ou régression logistique, au choix. Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 1 1. Généralités et justification Les kits de test de diagnostic rapide (TDR) sont particulièrement intéressants pour le diagnostic immédiat du paludisme. Un diagnostic rapide permet de raccourcir les délais d’instauration du traitement, en particulier en milieu rural. Les TDR sont des tests immunochromatographiques sur membrane capables de détecter les antigènes du parasite Plasmodium dans le sang [1]. Les TDR actuels permettent de détecter trois antigènes : la protéine II riche en histidine (HRP2), la lactate- déshydrogénase (LDH) et l’aldolase. La protéine HRP2 est fabriquée en grande quantité uniquement par P. falciparum et constitue la cible des TDR les plus couramment utilisés. Bien que les anticorps présents sur la bandelette réactive soient dirigés contre l’antigène HRP2, il existe un risque de réaction croisée avec un autre antigène de la famille HRP, la protéine HRP3, compte tenu de la similitude des séquences d’acides aminés [2]. Les TDR ciblant HRP2 sont généralement plus sensibles et thermostables que les TDR détectant la LDH ou l’aldolase [3]. Alors que les TDR HRP2 sont habituellement les plus sensibles des TDR du paludisme à P. falciparum [3], des souches de parasites portant des délétions dans les gènes codant HRP2 ou la protéine apparentée HRP3 ont récemment été identifiées. Les souches porteuses de délétions des gènes pfhrp2 et pfhrp3 ne sont pas détectées par les TDR HRP2 [4]. Ceux-ci détectent parfois, malgré tout, les souches porteuses uniquement de délétions du gène pfhrp2, en particulier lorsque la densité parasitaire est forte, en raison de la réactivité croisée des anticorps avec les épitopes de HRP3 [4]. En 2010, Gamboa et coll. [5] ont décrit pour la première fois l’identification de parasites P. falciparum porteurs de délétions des gènes pfhrp2/3 dans le bassin de la rivière Amazone, au Pérou. Des analyses rétrospectives ultérieures menées dans différents sites de la région du Loreto de l’Amazone péruvienne ont montré une prévalence accrue des parasites porteurs de délétions de gènes entre les spécimens collectés de 1998 à 2001 (20,7 %) et ceux collectés de 2003 à 2005 (40,6 %) [5]. La prévalence des parasites porteurs de délétions des gènes pfhrp2/3 présente une variabilité locale marquée. Des études menées dans d’autres pays, notamment en Inde [6], au Mali [7], au Honduras [8], au Ghana [9], en Colombie [10, 11], au Myanmar [12], au Surinam [13], en Guyane [8] et au Sénégal [14], ont obtenu des estimations nettement inférieures de la prévalence. Néanmoins, le plan des études manquait parfois de rigueur. Selon des données récemment publiées, la prévalence des délétions doubles des gènes pfhrp2 et pfhrp3 en Érythrée était très élevée (80 %) et imposait un changement urgent de stratégie, celle-ci reposant uniquement sur le TDR HRP2 [15]. Une absence d’expression de la LDH ou de l’aldolase n’a jamais été décrite chez les parasites, ces cibles étant des enzymes essentielles à leur métabolisme et à leur survie. Lorsque les examens microscopiques ne sont pas disponibles ou envisageables en raison de contraintes temporelles ou du manque de ressources, il est impératif de traiter le paludisme en se basant sur les résultats des TDR. Une surveillance de la précision des résultats de TDR est donc essentielle. Les principales causes de faux négatifs aux TDR sont en rapport avec la qualité et les performances du produit, avec les conditions de transport et de stockage, avec des erreurs humaines ou avec une densité parasitaire inférieure à la limite de détection. Cependant, les délétions des gènes codant l’antigène cible ne doivent pas être négligées [4]. Pour éviter une nouvelle crise telle que la crise érythréenne de 2016, l’OMS recommande que les pays où des cas de délétions des gènes pfhrp2/3 ont été signalés et les pays voisins surveillent ces délétions, en particulier chez les patients symptomatiques [3]. Ce document vise à proposer un protocole normalisé qui permettra aux pays d’endémie du paludisme à P. falciparum de déterminer la prévalence des parasites porteurs de délétions des gènes pfhrp2/3 entraînant des faux négatifs au TDR HRP2 chez les patients symptomatiques. Les méthodes exposées ici permettront de cartographier la distribution de ces délétions, d’estimer la valeur prédictive des suspicions de faux négatifs au TDR HRP2 concernant les délétions des gènes et d’identifier les zones pouvant nécessiter un changement de stratégie. Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 2 2. Objectifs de l’enquête et de la recherche Cette enquête vise avant tout à déterminer si la prévalence locale des délétions des gènes hrp2/3 de P. falciparum à l’origine de faux négatifs au TDR HRP2 chez les patients symptomatiques infectés par le parasite a atteint un seuil pouvant justifier un changement local ou national des TDR du paludisme. Les objectifs sont notamment les suivants : 1. Mesurer la prévalence des suspicions de délétions des gènes pfhrp2/pfhrp3 chez les patients symptomatiques infectés par le parasite consultant dans des établissements de soins publics. 2. Déterminer la densité parasitaire et la fréquence des délétions des gènes pfhrp2/3 au sein de cette cohorte. 3. Estimer la valeur prédictive des suspicions de faux négatifs au TDR HRP2 concernant les délétions de gènes pfhrp2/3 dans différents contextes. 4. Identifier les provinces de cette cohorte ayant une prévalence de délétions des gènes pfhrp2/3 supérieure ou égale à 5 %, ceci justifiant l’abandon de la stratégie reposant uniquement sur les TDR HRP2 pour la détection de P. falciparum. 5. Favoriser les recherches épidémiologiques ultérieures sur le paludisme ainsi que les activités de recherche et développement de produits destinés au dépistage du paludisme. 3. Sites d’étude/population cible Cette activité de surveillance s’intéressera aux patients suspects de paludisme consultant dans des établissements de soins publics. Des résultats négatifs au TDR HRP2, mais positifs au TDR Pf-LDH ou à l’examen microscopique, doivent évoquer de possibles délétions des gènes pfhrp2/3 qui expliqueraient les faux négatifs. La détection de la HRP2 étant au cœur de la stratégie de diagnostic, l’OMS incite fortement les pays exposés à évaluer la prévalence de ces délétions de gènes chez P. falciparum. Les zones de surveillance prioritaires (i) montrent une discordance entre les résultats de TDR HRP2 et d’examen microscopique, (ii) font état de signalements non représentatifs ou sporadiques de délétions des gènes pfhrp2/3 à l’échelle nationale et (iii) sont proches d’une zone où des délétions des gènes pfhrp2/3 ont été fréquemment identifiées. Dans ces pays, les établissements de soins publics situés dans toutes les provinces où le paludisme à P. falciparum est transmis doivent être inclus. Les établissements éligibles à l’inclusion dans l’étude doivent, dans l’idéal, être représentatifs de l’étendue géographique de transmission du paludisme dans l’ensemble de la province. 3.1 Critères d’inclusion • Satisfaire la définition du cas suspect de paludisme 3.2 Critères d’exclusion • Recrutement précédent dans l’enquête 4. Méthodes d’enquête 4.1 Plan Une enquête transversale sera utilisée pour mesurer les critères d’évaluation principaux. Les établissements de soins testeront systématiquement les cas suspects de paludisme au moyen d’un TDR HRP2 et d’une autre méthode (à savoir, TDR Pf-LDH ou examen microscopique) et prélèveront Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 3 au moins deux DBS. La fréquence des suspicions de faux négatifs au TDR HRP2 chez les patients symptomatiques atteints de paludisme à P. falciparum constitue le critère d’évaluation principal no 1. Les tests moléculaires effectués sur les DBS des suspicions de faux négatifs au TDR HRP2 détermineront la prévalence des délétions des gènes pfhrp2/3 dans cette cohorte (critère d’évaluation no 2) et dans la cohorte incluant tous les cas symptomatiques confirmés d’infection à P. falciparum (critère d’évaluation no 3). 4.2 Indicateurs des critères d’évaluation principaux Les indicateurs suivants serviront de critères d’évaluation principaux pour l’enquête : 1. Prévalence des suspicions de faux négatifs au TDR HRP2 (à savoir, résultat négatif au TDR HRP2, mais résultat positif au TDR Pf-LDH ou à l’examen microscopique de Pf et résultat positif à la PCR de Pf) chez les patients symptomatiques atteints de paludisme à P. falciparum. 2. Prévalence des délétions des gènes pfhrp2/3 chez les patients symptomatiques atteints de paludisme à P. falciparum obtenant un faux négatif au TDR HRP2. 3. Prévalence des délétions des gènes pfhrp2/3 entraînant des faux négatifs aux TDR HRP2 pour l’ensemble des cas symptomatiques confirmés de paludisme à P. falciparum. L’étude identifiera le pourcentage de patients présentant des suspicions de faux négatifs au TDR HRP2 au moyen de tests diagnostiques réalisés dans les établissements de soins par deux méthodes de test (TDR HRP2 associé à l’examen microscopique ou au TDR pf-LDH1). Pour économiser du temps et des ressources, les tests moléculaires +/- sérologiques visant à confirmer l’infection à P. falciparum et à identifier les délétions des gènes pfhrp2/3 seront initialement réalisés uniquement sur les DBS prélevées chez des personnes dont les résultats au TDR HRP2 sont soupçonnés être des faux négatifs. L’obtention de résultats de diagnostic discordants peut être due à d’autres facteurs, notamment des faux positifs sur les lignes tests du TDR Pf-LDH (pouvant être liés à une réactivité croisée avec des espèces autres que falciparum) ou de faibles densités parasitaires, inférieures ou égales à la limite de détection des TDR HRP2 et Pf-LDH. En outre, cet indicateur peut passer à côté d’une véritable délétion des gènes pfhrp2/3 dans des situations particulières (voir le tableau 3 ci-dessous). Tout d’abord, les personnes ne seront pas identifiées d’une part si la densité parasitaire est faible et non détectée par le TDR Pf-LDH ou l’examen microscopique et d’autre part si des délétions des gènes pfhrp2/3 empêchent la détection par le TDR HRP2. Deuxièmement, le TDR HRP2 peut malgré tout détecter certaines infections à délétion pfhrp2 en raison de la réactivité croisée des anticorps tests avec HRP3. Enfin, le protocole de test ne détectera pas les délétions des gènes pfhrp2/3 chez les patients co-infectés par des clones exprimant HRP2, sauf si des techniques récentes, telles que le séquençage parallèle massif et la PCR numérique, sont utilisées. Cet indicateur représente donc la limite inférieure de la prévalence réelle des délétions des gènes pfhrp2/3. 4.3 Indicateurs pour les critères d’évaluation secondaires (facultatif) 1. Densité parasitaire mesurée par PCR quantitative et/ou examen microscopique en cas de suspicion de faux négatifs au TDR HRP2. 1 Les TDR utilisés doivent contenir des lignes tests spécifiques de Pf-LDH et non des lignes tests pan-pLDH. Ainsi, seules les infections à P. falciparum seront détectées et les espèces autres que falciparum (Pv, Pm, Po) ne seront pas identifiées, afin d’éviter l’obtention de résultats discordants (négatifs pour HRP2, positifs pour pan-pLDH). Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 4 2. Meilleure compréhension des délétions des gènes pfhrp2/3, par exemple parenté génétique et/ou pharmacorésistance, adéquation des outils de diagnostic à la détection des parasites porteurs de délétions des gènes pfhrp2/3 et nouveaux outils et/ou outils améliorés. 4.4 Taille de l’échantillon La taille de l’échantillon doit permettre d’obtenir des estimations suffisamment précises des faux négatifs au TDR HRP2 dus à des délétions des gènes pfhrp2/3 à l’échelle du domaine visé par l’enquête (province, état ou autre) dans les pays qui mettent en œuvre ce protocole. Les estimations de la taille de l’échantillon s’appuient sur les pourcentages obtenus par échantillonnage aléatoire simple, avec un effet du plan d’échantillonnage (deft) = 1,5 (pour tenir compte des observations corrélées avec celles des établissements de soins concernant les délétions des gènes pfhrp2/3) et une probabilité de commettre une erreur de type 1 = 95 % (test unilatéral), de telle manière que l’intervalle de confiance à 95 % ne chevauche pas le seuil de 5 %. Un effet du plan d’échantillonnage différent de 1,5 peut être utilisé s’il existe des données sur les délétions des gènes pfhrp2/3 (ou tout autre critère d’évaluation pertinent) qui sont exploitables pour estimer cet effet. La taille de l’échantillon s’appuie sur l’estimation des indicateurs des critères d’évaluation no 1 et 2,2 à condition que la borne supérieure de l’IC à 95 % ne chevauche pas le seuil de 5 % lorsque la prévalence observée de faux négatifs au TDR HRP2 dus à des délétions des gènes pfhrp2/3 est inférieure à 5 % (ce qui indique que le taux observé de délétions des gènes pfhrp2/3 est inférieur à 5 % avec une confiance de 95 %) et à condition que la borne inférieure de l’IC à 95 % ne chevauche pas le seuil de 5 % lorsque la prévalence observée est supérieure à 5 % (ce qui indique que le taux observé de délétions des gènes pfhrp2/3 est supérieur à 5 % avec une confiance de 95 %). Pendant l’analyse statistique, les établissements de soins seront inclus en tant qu’effet aléatoire pour que les estimations de la prévalence et les IC à 95 % soient ajustés sur la variabilité de la probabilité de détecter un cas de paludisme dans un établissement de soins. Pour démontrer que la prévalence des délétions des gènes pfhrp2/3 (entraînant des faux négatifs aux TDR) chez les patients symptomatiques infectés par P. falciparum est inférieure ou supérieure à 5 %, une taille d’échantillon basée sur une prévalence de 3,2 % (n = 370) ou 8,0 % (n = 318) attendue au sein de la population, respectivement, sera utilisée par domaine d’échantillonnage. Sur la base de la formule précédente, il est donc recommandé d’utiliser un échantillon d’au moins 370 personnes atteintes d’infection à P. falciparum par domaine d’échantillonnage (par exemple, province ; 37 par établissement de soins, 10 établissements par domaine d’échantillonnage). Au sein d’un domaine, les établissements de soins doivent être sélectionnés sur la base d’une probabilité proportionnelle à la taille, en fonction du nombre de personnes prises en charge pour fièvre ou suspicion de paludisme. Lorsque la prévalence des délétions du gène pfhrp2 s’approche du seuil de 5 %, la taille de l’échantillon nécessaire pour détecter si cette prévalence est supérieure ou inférieure au seuil augmente, jusqu’à atteindre une taille maximale dépassant 30 000 cas de paludisme à P. falciparum par domaine pour une estimation dans un intervalle de 5 % +/- 0,2 %, selon la formule précédente. 2 Pourcentage de patients obtenant des suspicions de faux négatifs au TDR HRP2 (résultats positifs au TDR Pf-LDH ou à l’examen microscopique et négatifs aux tests HRP2) parmi tous les patients atteints de paludisme à P. falciparum ; proportion de patients obtenant des suspicions de faux négatifs au TDR HRP2 et présentant des délétions des gènes pfhrp2/3 parmi tous les patients atteints de paludisme à P. falciparum.       −  2 2 )1)(( D PPZ deftn Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 5 Il est donc recommandé de mener l’enquête en premier lieu sur un échantillon de 370 cas par domaine. Une analyse moléculaire doit ensuite être réalisée sur les échantillons DBS suspects de délétions des gènes pfhrp2/3, ainsi qu’une analyse statistique, incluant le calcul de la prévalence avec un IC à 95 %. L’analyse conduira à l’un des trois résultats suivants pour chaque province : Résultat 1 : Le pourcentage estimé est inférieur à 5 % et la limite supérieure de l’IC à 95 % est inférieure à 5 %. Dans ce cas, la proportion de parasites porteurs de délétions des gènes pfhrp2/3 entraînant des faux négatifs au TDR HRP2 chez les patients symptomatiques infectés par Pf est inférieure à 5 % (significativité élevée). Résultat 2 : Le pourcentage estimé est supérieur à 5 % et la limite inférieure de l’IC à 95 % est supérieure à 5 %. Ce résultat signifie que la proportion de parasites porteurs de délétions des gènes pfhrp2/3 entraînant des faux négatifs au TDR chez les patients symptomatiques infectés par Pf est supérieure à 5 % (significativité élevée). Résultat 3 : L’analyse statistique ne permet pas de conclure (seuil de 5 % inclus dans l’IC à 95 %) si la prévalence des délétions des gènes pfhrp2/3 entraînant des faux négatifs au TDR chez les patients symptomatiques infectés par Pf est supérieure ou inférieure ou non à 5 %. 4.5 Échantillonnage En règle générale, dans chaque province, un échantillon aléatoire systématique d’au moins 10 établissements de soins doit être sélectionné dans la liste exhaustive des établissements, être stratifié par type d’établissement et inclure une mesure de la taille de l’établissement (par exemple, nombre de patients vus en ambulatoire pour une fièvre ou une suspicion de paludisme dans l’établissement au cours d’un mois standard). Dans chaque province, les établissements devront être sélectionnés en fonction de leur taille relative de manière à ce que l’échantillonnage soit basé sur la probabilité proportionnelle à la taille (PPT). Si le budget l’autorise, plus de 10 établissements de soins par province peuvent être utilisés pour recruter l’échantillon requis dans les comtés de très faible endémie. Ceci permettra des estimations plus précises et limitera le temps nécessaire pour atteindre les cibles en matière de recrutement. Créer une carte des domaines d’échantillonnage sélectionnés dans les différentes zones épidémiologiques et de la proportion d’établissements de soins au sein de chaque zone. Créer un tableau qui répertorie tous les établissements de soins intervenant dans le recrutement par domaine d’échantillonnage. 4.6 Collecte des données et travail sur le terrain Les étapes générales suivantes devront être suivies pour la collecte des données. Elles sont présentées dans une figure. [Remarque : chaque pays devra mettre au point son propre mode opératoire normalisé (MON) pour adapter ces étapes à sa situation et à ses besoins particuliers.] Le programme national de lutte contre le paludisme (PNLP) doit identifier les provinces à inclure dans l’enquête. Cette sélection reposera sur l’évaluation des provinces les plus exposées au risque de délétions des gènes pfhrp2/3 ou, à défaut, inclura une sélection aléatoire des comtés par zone épidémiologique. Les provinces à transmission faible, moyenne ou élevée doivent être prises en compte. À l’inverse, les provinces exemptes de transmission du paludisme doivent être exclues. Les tailles d’échantillons pourraient être atteintes plus rapidement dans les zones à transmission moyenne à élevée. Cependant, la plus forte prévalence attendue des infections multiclonales peut masquer la présence de parasites porteurs de délétions des gènes pfhrp2/3. Ce risque serait moindre dans les zones à faible transmission, qui doivent donc être incluses. Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 6 1. Dans chaque province du pays, sélectionner un nombre défini d’établissements de soins publics (au moins 10) qui utilisent des TDR du paludisme en pratique courante pour inclusion dans l’enquête. • Le nombre d’établissements par province à inclure dans l’échantillon devra tenir compte du nombre moyen attendu de patients suspects de paludisme consultant dans l’établissement chaque semaine et du taux de positivité moyen au test dans la zone cible afin d’établir le nombre hebdomadaire attendu de cas positifs. En règle générale, l’objectif visé est d’achever le travail sur le terrain et d’atteindre une taille d’échantillon d’au moins 370 échantillons positifs sur une période de 8 semaines. • Les établissements de soins inclus dans l’échantillon doivent être sélectionnés dans une liste exhaustive (base de sondage) par province au moyen d’un échantillonnage systématique aléatoire reposant sur une PPT [17] (et proportionnelle à la taille des strates de type d’établissement dans chaque domaine). La base de sondage doit inclure une estimation de la taille (nombre de personnes atteintes de fièvre ou suspects de paludisme) et du type de l’établissement (par exemple, public, privé, niveau, etc.). • Remarque : si des contraintes budgétaires ou logistiques empêchent la sélection et l’inclusion des établissements par échantillonnage aléatoire, un échantillon choisi à dessein (ou de commodité) pourra être utilisé. Toutefois, les estimations des délétions des gènes pfhrp2/3 à l’échelle de la province ne seront alors pas statistiquement représentatives de cette province. 2. Procédures d’enquête et analyse des données a. Les patients sont triés selon les procédures habituelles. Son consentement/assentiment sera demandé à tout patient suspect de paludisme, selon le prestataire de soins habituel (par exemple, un médecin, un infirmier), sur la base des lignes directrices nationales (annexes 3 et 4). b. Seules les personnes ayant donné leur consentement devront signer le formulaire de consentement éclairé et recevront un exemplaire de la note d’information correspondante, ainsi que leur ID d’enquête/échantillon, qui leur servira si elles changent d’avis et souhaitent mettre fin à leur participation ou ne souhaitent plus que leurs échantillons soient conservés. c. Les patients qui auront donné leur consentement seront interrogés sur leur maladie et testés simultanément par deux TDR distincts, conformément au mode d’emploi, dont le TDR HRP2 utilisé dans le programme national de lutte et un TDR Pf-LDH. Par ailleurs, au moins deux gouttes de sang seront prélevées sur papier-filtre/cartes Protein Saver. d. Les autres patients recevront les soins habituels et ni leur nom ni leur identité n’apparaîtront dans les documents d’enquête. Un ID unique sera affecté au formulaire de consentement non rempli afin de permettre le suivi du nombre total de patients suspects de paludisme ayant donné leur consentement et ne l’ayant pas donné vus dans l’établissement. Ce nombre sera consigné sur la feuille de pointage de l’étude (annexe 2). Tous les formulaires de consentement éclairé seront conservés sous clé, en lieu sûr. e. Le TDR HRP2 et les TDR pf-LDH satisfont les critères d’achat de l’OMS et ont été homologués par le ministère de la Santé. Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 7 • Un TDR Pf-LDH qui remplit les critères d’achat de l’OMS (tableau 1) ou un examen microscopique peut être utilisé pour établir le diagnostic secondaire. Aucun TDR ne satisfait actuellement les critères de performance de l’OMS concernant la détection de P. falciparum sur la seule base de la ligne test pf-LDH. [16] Par conséquent, pour les besoins de l’enquête, les pays peuvent exceptionnellement sélectionner des TDR ciblant Pf-LDH qui (i) ont été évalués lors des tests OMS des produits de TDR du paludisme ; ii) remplissent les critères de performance de détection des parasites P. falciparum exprimant HRP2 et (iii) ont un score de détection sur le panel (PDS) > 90 à une densité de 2000 p/µL et des taux de faux positifs et de résultats non valables < 2 % (voir le tableau 1). • Si l’examen microscopique est utilisé, préparer un frottis mince de sang et un frottis en goutte épaisse selon les lignes directrices nationales, en conformité avec les MON de l’OMS pour l’examen microscopique des cas de paludisme.3 3 www.wpro.who.int/mvp/lab_quality/mm_sop/en/ Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 8 TABLEAU 1. TDR ne ciblant pas HRP2 utilisables dans le cadre de l’enquête et caractéristiques de performance correspondantes, d’après les séries 1-8 des tests OMS des TDR du paludisme Critères de performance (les critères satisfaits sont surlignés en vert) : A : Score de détection sur le panel (PDS) de P. falciparuma ≥ 75 % à 200 parasites/µL B : Score de détection sur le panel (PDS) de P. vivaxa ≥ 75 % à 200 parasites/µL C : Taux de faux positifs (FP) par rapport aux échantillons négatifs pour toute pathologie < 10 % D : Taux de résultats non valables (IR) < 5 % E : Score de détection sur le panel (PDS) de P. falciparum non porteurs de délétions du gène pfhrp2 > 75 % à 200 parasites/µL (dans les zones où les délétions du gène pfhrp2 sont répandues) Panels de P. falciparum exprimant HRP2, de P. vivax et de cas négatifs pour le paludisme Panel de P. falciparum n’exprimant pas HRP2 Produit Fabricant PDSa FP IR Satisfait aux critères d’achat de l’OMSh PDS Satisfait aux critères d’achat de l’OMS pour la détection de P. falciparum avec délétions des gènes pfhrp2/3k Peut être utilisé avec un TDR HRP2, en tant qu’outil de dépistage pour les enquêtes sur les délétions du gène pfhrp2l Série Ab Bc Cd De Ei Pf @2000 p/µLj Pf seulement CareStart™ Malaria Pf (HRP2/pLDH)f RMSM- 02571 Access Bio Inc. 82 (81/40)f s.o. 0,5 0,0 Non (non préqualifié par l’OMS) 12,5 (0/12,5)f 100 Non Oui 8 SD BIOLINE Malaria Ag P.f (HRP2/pLDH)f 05Fk90 Standard Diagnostic Inc. (Alere) 90 (88/71)f s.o. 0,0 0,1 Ouig 32,5 (0/32,5)f 100 Non Oui 8 Pf, Pf et Pv SD BIOLINE Malaria Ag P.f/P.f/P.vf 05FK120 Standard Diagnostic Inc. (Alere) 89 (89/62)f 97,1 0,0 0,0 Ouig 20 (0/20)f 100 Non Oui 8 IN – inconnu ; Pf, Plasmodium falciparum ; Pv, Plasmodium vivax a - Un échantillon n’est considéré comme positif que si tous les TDR des deux lots lus par le premier technicien, dans le temps minimum de lecture spécifié, sont positifs. b - Série 1, n = 79 ; série 2, n = 100 ; série 3, n = 99 ; série 4, n = 98 ; série 5, n = 100 ; série 6, n = 100 ; série 7, n = 100 ; série 8, n = 100 c - Série 1, n = 20 ; série 2, n = 40 ; série 3, n = 35 ; série 4, n = 34 ; série 5, n = 35 ; série 6, n = 35 ; série 7, n = 35 ; série 8, n = 35 d - Série 1, n = 168 ; série 2, n = 200 ; série 3, n = 200 ; série 4, n = 232 ; série 5, n = 236 ; série 6, n = 208 ; série 7, n = 220 ; série 8, n = 208 e - Série 1, n = 954 ; série 2, n = 1240 ; série 3, n = 1204 ; série 4, n = 1192 ; série 5, n = 1214 ; série 6, n = 1210 ; série 7, n = 1210 ; série 8, n = 1210 f - Le PDS présenté dans le tableau est basé sur une ligne test positive pour Pf (HRP2 ou pf-LDH). Les résultats fournis entre parenthèses correspondent aux PDS basés uniquement sur les lignes tests HRP2 et pf-LDH, respectivement. g - Désigne un produit préqualifié par l’OMS (au 15 février 2019), voir les mises à jour à l’adresse : www.who.int/diagnostics_laboratory/evaluations/pq-list/malaria/public_report/en/ h - www.who.int/malaria/news/2019/rdt-procurement-criteria/en/ i - Série 8, n = 40 (18 délétions doubles : pfhrp2-/pfhrp3- ; 22 délétions simples : pfhrp2-/pfhrp3+) j - Résultats (PDS) de l’évaluation ponctuelle des TDR pf-LDH, série 8 incluse, par rapport au panel à forte densité de résultats négatifs HRP2 : n = 40 (18 délétions doubles : pfhrp2-/pfhrp3- ; 22 délétions simples : pfhrp2-/pfhrp3+) k- Ces résultats doivent être pris en compte lors de l’achat de TDR à destination des zones de prévalence des délétions pfhrp2-/pfhrp3+ ou de délétions pfhrp2-/pfhrp3-. l - Les TDR comportant des lignes tests pf-LDH distinctes obtenant un PDS > 90 % dans les échantillons de 2000 parasites porteurs de délétions du gène pfhrp2/µL peuvent être utilisés pour dépister les délétions du gène pfhrp2 conformément à ce modèle de protocole d’enquête de l’OMS. Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 9 Le prestataire de soins attribuera un ID d’enquête unique à chaque patient suspect de paludisme ayant donné son consentement, dans l’ordre chronologique, qu’il consignera dans le cahier de recherche formalisé (annexe 5) et sur la feuille de pointage de l’enquête. L’agent de santé notera dans le cahier de recherche les réponses aux questions, notamment sur l’âge, le sexe, les tests de diagnostic du paludisme récemment réalisés, les traitements et les voyages. • L’agent de santé (médecin traitant ou technicien de laboratoire) identifiera ensuite 2 TDR différents ou 1 TDR, une lame pour examen microscopique, ainsi qu’un papier- filtre ou une carte Protein Saver pour les DBS, au moyen des étiquettes jointes au cahier de recherche formalisé (en utilisant le même ID que dans le cahier). Il réalisera les tests, notera les résultats dans le cahier de recherche formalisé (annexe 5, rubriques 5-7) et informera directement le patient des résultats (médecin) ou orientera le patient vers le médecin traitant (technicien de laboratoire) afin que le patient obtienne un traitement en cas de résultats positifs au TDR principal ou secondaire ou à l’examen microscopique, conformément aux lignes directrices nationales. Des résultats positifs à l’un des TDR doivent déclencher une prise en charge, ces deux TDR ayant été préqualifiés par l’OMS. Si nécessaire, l’examen microscopique peut être utilisé à la place des TDR du paludisme. Les résultats négatifs au TDR doivent être pris en charge conformément aux lignes directrices nationales. 3. Tous les TDR utilisés et, le cas échéant, les lames de microscopie de chaque patient suspect de paludisme ayant donné son consentement seront conservées en lieu sûr, à l’abri de l’humidité, jusqu’à la fin de l’enquête, à des fins de contrôle de la qualité. 4. Au moins deux DBS (50 µL par goutte) sur papier-filtre ou carte Protein Saver doivent être placées en lieu sûr, à l’abri de la poussière et de l’humidité, pendant 3-4 heures jusqu’à ce qu’elles sèchent. • Une fois secs, les papiers-filtres/les cartes seront placés dans un sachet en plastique imperméable avec le déshydratant (fourni dans l’emballage du TDR). Ce sachet devra être identifié avec l’ID de l’enquête si l’étiquette n’est pas déjà collée dessus. 5. Une fois que la taille d’échantillon souhaitée de personnes infectées ayant donné leur consentement aura été atteinte dans chaque établissement, les cahiers de recherche formalisés et les TDR et DBS correspondants seront compilés et envoyés au centre de coordination central. Les cahiers, feuilles de pointage, TDR ou DBS ne contiendront aucun nom ou autre identifiant unique. Le seul lien entre le nom du patient et l’ID d’enquête figurera sur le formulaire de consentement des personnes ayant donné leur consentement. 6. Dès réception des cahiers/TDR/DBS, le chef de l’équipe d’enquête devra passer en revue les rubriques du cahier contenant les résultats de TDR (annexe 5, rubriques 5-7, S1), identifier les DBS prioritaires pour l’analyse moléculaire +/- sérologique, en particulier en cas de résultats négatifs au TDR HRP2 et positifs au TDR pf-LDH et, en fonction des ressources, un sous- ensemble de cas ayant des résultats positifs et de cas obtenant des résultats négatifs au TDR HRP2 (voir annexe 1 : données complémentaires), et identifier les DBS à rejeter. a. D’après le nombre de résultats discordants aux TDR ou aux tests par TDR-examen microscopique, la proportion de cas d’infection à P. falciparum présentant des faux négatifs au TDR HRP2 (évoquant des délétions potentielles des gènes pfhrp2/3) pourra être calculée au sein de l’établissement de soins ou de la province, selon la formule ci-dessous. Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 10 7. Conditionner et expédier les DBS (au moins 2) pour les tests de confirmation de l’infection à P. falciparum et l’analyse moléculaire +/- sérologique des délétions des gènes pfhrp2/3 à un laboratoire de référence partenaire de l’OMS. Les échantillons doivent être expédiés selon un Accord de transfert de matériel (ATM) et, dans l’idéal, une DBS sera conservée en permanence dans le laboratoire de référence national pour l’enquête. a. La confirmation moléculaire des délétions des gènes pfhrp2/3 comme cause des faux négatifs aux TDR est nécessaire pour s’assurer que les résultats discordants n’ont pas d’autre origine que les délétions des gènes pfhrp2/3. Ces autres raisons peuvent inclure des erreurs humaines, des faux positifs sur les lignes tests Pf-LDH ou des faux positifs à l’examen microscopique, ou encore des échantillons situés à la limite de détection des TDR, qui peuvent dans certains cas entraîner une réaction suffisante pour générer une ligne test positive, mais pas de manière systématique. La contribution de ces autres causes aux résultats discordants est variable. b. La confirmation sérologique des délétions des gènes pfhrp2/3 peut également être réalisée par test immunologique, en particulier en cas de non-concordance entre les résultats de TDR et de PCR. 8. Une fois le nombre réel de cas porteurs de délétions des gènes pfhrp2/3 entraînant des faux négatifs aux TDR HRP2 connu, le critère d’évaluation principal de l’étude peut être calculé pour chaque domaine d’échantillonnage, par exemple par province. 9. L’analyse statistique de la proportion calculée à l’étape 8 ci-dessus inclura le calcul des résultats d’IC à 95 % correspondants. L’analyse conduira à l’un des trois résultats suivants pour chaque province : a. Résultat 1 : Le pourcentage estimé est inférieur à 5 % et la limite supérieure de l’IC à 95 % est inférieure à 5 %. Dans ce cas, la proportion de parasites porteurs de délétions des gènes pfhrp2/3 entraînant des faux négatifs au TDR chez les patients symptomatiques est inférieure à 5 % (significativité élevée). b. Résultat 2 : Le pourcentage estimé est supérieur à 5 % et la limite inférieure de l’IC à 95 % est supérieure à 5 %. Ce résultat signifie que la proportion de délétions des gènes pfhrp2/3 entraînant des faux négatifs au TDR chez les patients symptomatiques infectés par Pf est supérieure à 5 % (significativité élevée). c. Résultat 3 : L’analyse statistique ne permet pas de conclure (seuil de 5 % inclus dans l’IC à 95 %) si la prévalence des délétions des gènes pfhrp2/3 entraînant des faux négatifs au TDR chez les patients symptomatiques infectés par Pf est supérieure ou inférieure ou non à 5 %. Proportion de cas d’infection à P. falciparum avec faux négatifs au TDR HRP2 en raison de délétions des gènes pfhrp2/3 = Nbre de patients atteints d’une infection à P. falciparum confirmée avec délétions des gènes pfhrp2/3 et résultats négatifs au TDR HRP2 Nbre cas d’infection à P. falciparum confirmés (soit par TDR, soit par examen microscopique) Proportion de cas d’infection à P. falciparum avec suspicions de délétions des gènes pfhrp2/3 = Nbre cas Pf avec résultats de TDR ou de TDR-examen microscopique discordants Nbre cas d’infection à P. falciparum confirmés (soit par TDR, soit par examen microscopique) Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 11 10. Si le résultat 2 est obtenu, les délétions du gène pfhrp2 sont répandues (borne inférieure de l’IC à 95 % > 5 %) dans une province. Les programmes nationaux doivent alors basculer vers des TDR qui ne reposent pas uniquement sur HRP2 pour la détection de P. falciparum, avec une hiérarchisation par prévalence des délétions du gène pfhrp2 dans les différentes provinces. a. Un seuil de 5 % a été sélectionné car il s’agit du pourcentage autour duquel la proportion de cas manqués par les TDR HRP2 en raison de l’absence d’expression de HRP2 peut être supérieure à la proportion de cas qui seraient omis par des TDR moins sensibles ciblant la pLDH. b. Un changement national est suggéré, car les modèles mathématiques montrent que les parasites sans gène pfhrp2 se propagent4 lorsque les TDR utilisés ciblent uniquement HRP2, exerçant ainsi une pression de sélection, et car l’utilisation de plusieurs TDR au sein d’un même pays peut compliquer l’achat et la formation. 11. Si le résultat 1 est obtenu dans toutes les provinces, il est recommandé au pays correspondant d’établir un mécanisme de suivi, avec un renouvellement de cette étude tous les deux ans. 12. Si le résultat 3 est obtenu dans une ou plusieurs provinces, diverses solutions sont possibles dans le pays concerné, selon les ressources disponibles : a. établir un mécanisme de suivi, avec un renouvellement de cette étude tous les deux ans (identique au Résultat 1) ou b. recommencer l’étude l’année suivante c. continuer le dépistage des patients pour obtenir une taille d’échantillon plus importante, qui permettra de mesurer plus précisément la prévalence réelle des délétions du gène pfhrp2. Le tableau 2 présente les tailles d’échantillon permettant de déterminer si la prévalence réelle des délétions du gène pfhrp2 est supérieure ou inférieure au seuil de 5 % à l’échelle du domaine étudié (par exemple, de la province). 13. Après finalisation et publication des résultats de l’enquête, seules les DBS des personnes ayant donné leur consentement, précision figurant sur le papier-filtre ou la carte Protein Saver, le sac Ziploc et le cahier de recherche formalisé, peuvent être stockées à long terme. Tout autre matériel en rapport avec l’enquête (TDR, lames de microscopie et DBS) doit être jeté. Les formulaires de consentement, qui établissent le lien entre le nom des patients et leur ID d’enquête, doivent être conservés par le ministère de la Santé. Le propriétaire de la biobanque ne doit pas posséder d’informations établissant le lien entre l’ID des patients et les échantillons. 14. Personnel de l’enquête Toutes les activités doivent être supervisées par l’investigateur principal. Un coordinateur d’étude doit être désigné. Il est recommandé de nommer au moins un superviseur par province concernée par l’enquête. Dans chaque établissement de soins sélectionné pour l’enquête, un à deux membres du personnel d’enquête doivent être formés pour consigner les résultats des tests de diagnostic du paludisme de tous les cas suspects, recruter les participants à l’enquête en vue du stockage des échantillons à long terme, conformément au protocole, collecter les TDR +/- lames de microscopie, prélever les DBS sur papier-filtre, mener les entretiens par questionnaire et stocker et conditionner correctement tous les échantillons/cahiers de recherche en vue de leur expédition au laboratoire. Le 4 Gatton M.L., Dunn J., Chaudhry A., Ciketic S., Cunningham J., Cheng Q.. « Use of PfHRP2-only RDTs rapidly selects for PfHRP2-negative parasites, with serious implications for malaria case management and control. » J Infect Dis. 2017. doi: 10.1093/infdis/jix094. Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 12 superviseur ou une personne disposant de l’expertise nécessaire se chargera de la gestion des données après leur collecte, de la création des variables indicatrices et de l’analyse des données. Dans l’idéal, cette personne doit être nommée au niveau central. TABLEAU 2. Tailles d’échantillon permettant de déterminer si la prévalence réelle des délétions du gène pfhrp2 est supérieure ou inférieure au seuil de 5 % à l’échelle du domaine étudié (la province) Pourcentage de délétions du gène pfhrp2 confirmés entraînant des faux négatifs au TDR HRP2 Nombre minimal de personnes atteintes d’une infection à P. falciparum confirmée à inclure par domaine afin d’estimer la taille d’échantillon nécessaire pour garantir que l’intervalle de confiance à 95 % (test unilatéral) n’inclut pas la prévalence de délétions des gènes pfhrp2/3 de 5 % % n 3,0 205 3,2 260 3,4 369 3,6 487 3,8 757 4,0 1082 4,2 2016 4,4 3484 4,6 11 133 4,8 32 202 5,0 5,2 34 739 5,4 10 240 5,6 4379 5,8 2457 6,0 1590 6,2 1123 6,4 841 6,6 658 6,8 531 7,0 459 7,2 386 7,4 331 7,6 287 7,8 253 8,0 224 8,2 205 Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 13 TABLEAU 3. Résumé des résultats des combinaisons de tests et limites de la méthode incluant uniquement des personnes qui obtiennent des résultats discordants au TDR HRP2 (positifs pour le TDR Pf-LDH ou l’examen microscopique ET négatifs au TDR HRP2) TD R H R P 2 TD R P f- LD H o u e xa m e n m ic ro sc o p iq u e A n al ys e m o lé cu la ir e e ff e ct u é e Interprétation des résultats et limites de la détection des délétions des gènes pfhrp2/3 + + Non • Il peut s’agir d’une infection par des parasites porteurs de délétions du gène pfhrp2, mais avec détection de HRP3 par le TDR HRP2 • Il peut s’agir d’une infection multiclonale par des parasites porteurs et des parasites non porteurs de délétions des gènes pfhrp2/3 + - Non • Faux positifs au TDR HRP2 (ou HRP2 persistante après disparition de l’infection) • Il peut s’agir d’une infection par des parasites porteurs de délétions du gène pfhrp2, mais avec détection de HRP3 par le TDR HRP2, ou d’une infection multiclonale par des parasites porteurs et des parasites non porteurs de délétions des gènes pfhrp2/3 ET • Faible densité parasitaire inférieure ou égale à la limite de détection des TDR Pf-LDH et/ou de l’examen microscopique - + Oui • Faux positifs au TDR Pf-LDH ou à l’examen microscopique • Faible densité parasitaire égale à la limite de détection des TDR (réactivité variable selon les lignes tests) - - Non • Une infection à faible densité non détectée par les deux TDR, avec absence d’identification des délétions des gènes pfhrp2/3, ne peut être écartée 4.7 Stockage des échantillons Tous les TDR et lames pour examen microscopique des patients suspects de paludisme ayant donné leur consentement, portant uniquement l’ID d’enquête, doivent être stockés dans des sacs en plastique imperméables aux gaz jusqu’à la fin de l’enquête et de l’analyse des données. En effet, ce matériel pourrait être nécessaire en cas d’incohérence dans les données ou pour fournir de l’ADN supplémentaire. Ce matériel devra être jeté une fois le rapport d’enquête terminé. Les DBS sur papier-filtre identifiées par l’ID d’enquête et une coche ou la mention (Pas de SLT [stockage à long terme] ou Pas de BB [mise en banque de matériel biologique]) seront stockées dans un sac en plastique imperméable portant la même étiquette, avec le déshydratant issu de l’emballage du TDR, à température ambiante, dans les établissements de soins, jusqu’à leur transport vers le laboratoire de référence central. Elles seront alors triées pour être soumises à une analyse moléculaire (incluant un séquençage de l’ADN) +/- une analyse sérologique dans un laboratoire participant qualifié (contacter malaria_rdt@who.int pour obtenir des liens vers des laboratoires précis). Une fois les résultats de l’enquête analysés et publiés, toute DBS, tout sang ou tout ADN résiduel dans les DBS après les tests moléculaires et immunologiques devra être jeté, sauf si le consentement/l’assentiment du patient a été obtenu. Pour le stockage à long terme, les DBS doivent être congelées à -20 °C ou -70 °C. Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 14 4.7.1 Stockage à long terme des gouttes de sang séché : biobanque Les délétions des gènes pfhrp2/3 n’étant apparues que récemment, leur étiologie, les tendances et les mutations génétiques associées pouvant conférer des avantages ou des désavantages en matière de survie restent peu connues. De nouveaux outils sont nécessaires pour détecter ces parasites porteurs de délétions. La mise à disposition de matériel biologique avec délétions des gènes pfhrp2/3 pourrait ainsi accélérer la mise au point et l’évaluation de produits. Le matériel biologique prélevé pendant l’enquête pourrait servir à préparer de futures recherches et, par conséquent, le consentement au stockage à long terme/à la mise en banque du matériel biologique résiduel est demandé. Au moment où ils donneront leur consentement, tous les patients recevront une note d’information portant un ID d’enquête unique ainsi que les coordonnées de l’investigateur principal de l’étude et du laboratoire national de référence pour le paludisme. Les patients pourront contacter ces entités pour demander le retrait de leur matériel de la biobanque. En cas de perte de la note d’information et de l’ID d’enquête unique, seul l’investigateur principal, détenteur de l’accès protégé par mot de passe aux formulaires de consentement signés et aux ID d’enquête correspondants, pourra établir le lien entre les échantillons et les patients. En vue du stockage à long terme, les personnes coordonnant l’enquête doivent indiquer comment ils envisagent d’utiliser ultérieurement le matériel ; à qui ce matériel sera confié (par exemple, ministère de la Santé, institut de recherche) et de quelle façon la confidentialité sera préservée ; de quelle façon la qualité du matériel sera contrôlée ; de quelle façon le donneur peut retirer son autorisation et dans quelles circonstances les donneurs doivent être recontactés. Ces exigences sont présentées dans la Ligne directrice 11 des Lignes directrices internationales d’éthique pour la recherche en matière de santé impliquant des participants humains. 4.8 Stockage et gestion des données Les cahiers de recherche formalisés et les feuilles de sondage n’incluent aucune information unique/identifiable. Le nom des patients figure uniquement sur les formulaires de consentement et d’assentiment et sera conservé sous clé pendant et après l’étude. Seuls le médecin-recruteur, le coordinateur d’étude et l’investigateur principal y auront accès. Les données électroniques doivent être protégées par un mot de passe. Elles seront saisies en double, dans les établissements de la province et dans le laboratoire central. Un logiciel sera utilisé pour la gestion et l’analyse des données, avec un guide de codage pour toutes les variables d’étude. Les données seront apurées au fur et à mesure, après comparaison des entrées en double et rectification des erreurs. Toutes les données collectées seront associées à un numéro d’identification unique établissant le lien entre les données épidémiologiques et les données de laboratoire, et conservées dans des fichiers sécurisés, protégés par mot de passe. Pendant l’enquête, tous les dossiers papier collectés seront conservés sous clé, en lieu sûr, notamment dans le centre de coordination central. Les données sont classées en grandes catégories : données de patients individuels, données sur le paludisme, données de laboratoire et données de consentement. En dehors du formulaire de consentement, rien ne permet d’établir le lien entre l’ID d’enquête et le nom d’un patient ou des caractéristiques uniques identifiables. Le chiffrement sera obligatoire sur toutes les tablettes et tous les dispositifs de capture de données électroniques utilisés pour la collecte. L’autorisation devra être obtenue avant toute réutilisation de données. Les gestionnaires de données internes et leurs assistants seront formés à tous les processus de saisie et de gestion des données. Leurs fiches de formation seront conservées et archivées pour permettre des contrôles d’assurance de la qualité des données. Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 15 Tous les prestataires de soins des sites participants devront être formés à la collecte des données d’étude. Le personnel sera sensibilisé à l’importance d’appliquer des protocoles et des procédures uniformes de recrutement des patients et de collecte des données. La stratégie d’assurance de la qualité visera essentiellement à encadrer la sélection des sujets et des sites participant à l’enquête, la collecte des données et les procédures de gestion. Les techniques de vérification des données incluront des contrôles logiques, par intervalle et de cohérence. La validation des données sera réalisée par des mécanismes de saisie des données électroniques, notamment des masques de saisie et des règles de logique et de validation conditionnelles. Le personnel surveillant sera sensibilisé à la justification et à l’importance des processus de vérification et de validation des données au moyen d’exemples précis décrivant les répercussions possibles sur les résultats d’étude. Des analyses statistiques intermédiaires permettront la détection et la correction d’erreurs, notamment en identifiant les variations des taux de recrutement, les écarts au protocole, les doublons de données saisies ou les valeurs de données incorrectes. Ces résultats seront transmis hebdomadairement à l’ensemble du personnel concerné pendant toute la durée de la collecte transversale des données. La conservation des données au format papier et électronique permettra en outre une contre-vérification de la précision des données. 4.9 Analyses de laboratoire 4.9.1 Tests de diagnostic rapide Des tests de diagnostic rapide seront réalisés conformément aux instructions des fabricants. 4.9.2 Caractérisation moléculaire La caractérisation moléculaire devra être réalisée dans un laboratoire expérimenté en techniques d’analyses moléculaire +/- sérologique du paludisme, adhérent au programme d’évaluation externe de la qualité (EEQ) de l’OMS pour les tests d’amplification des acides nucléiques (TAAN) du paludisme ou à tout autre programme de méthodes d’analyse moléculaire du paludisme. La PCR quantitative doit être privilégiée par rapport aux méthodes non quantitatives d’amplification des acides nucléiques, en particulier si la densité parasitaire n’est pas mesurée par examen microscopique. Les méthodes proposées ci-dessous dérivent de la publication de Cheng et coll., mais peuvent varier selon le laboratoire de référence [4]. 4.9.2.1 Extraction et contrôle de la qualité de l’ADN Pour vérifier la qualité de l’ADN, une aliquote d’ADN doit être utilisée pour amplifier les gènes msp1, msp2 et glurp, conformément aux protocoles standard publiés [18]. 4.9.2.2 Diagnostic moléculaire des espèces Des paires d’amorces spécifiques doivent être utilisées pour quatre ou cinq réactions d’amplification distinctes spécifiques de P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale et P. knowlesi. 4.9.2.3 Caractérisation des séquences et des délétions des gènes pfhrp2 et pfhrp3 dans les échantillons Des suggestions de séquences d’amorçage, de conditions de PCR et de tailles attendues des produits d’amplification ont été publiées [4]. Les gènes pfhrp2 et pfhrp3 doivent être caractérisés par amplification de deux segments géniques. Un segment s’étend de la fin de l’exon 1 au début de l’exon 2, intron de chaque gène inclus. L’autre segment englobe la totalité de l’exon 2, qui code la région répétée riche en histidine-alanine de chaque protéine. Les tests de PCR doivent inclure les Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 16 contrôles appropriés, notamment de l’ADN issu de souches de laboratoire porteuses de délétions connues, telles que DD2 (délétion du gène pfhrp2) et HB3 (délétion du gène pfhrp3). Si une amplification du gène pfhrp2 est possible, la séquence du produit d’amplification de l’exon 2 sera déterminée et traduite en séquence d’acides aminés. Cela permettra de classer la protéine HRP2 de Pf en type A, type B ou type C/groupe de structure limite, selon le nombre de répétitions de type 2 et type 7 multipliées (voir ci-dessus). Si l’amplification des gènes pfhrp2 et/ou pfhrp3 est impossible malgré une qualité satisfaisante de l’ADN (voir rubrique 4.9.2), démontrée par l’amplification d’autres séquences de gènes non répétitifs, des délétions des gènes peuvent être supposées. Pour confirmer et caractériser plus finement les délétions subtélomériques, les gènes situés immédiatement en aval et en amont des gènes pfhrp2 et/ou pfhrp3 peuvent être amplifiés (facultatif) : gène HPC230 situé à environ 5,5 kb en amont et gène HSP70 situé à environ 6,5 kb en aval du gène pfhrp2 ; gène HPC475 situé à environ 1,7 kb en amont et gène ACL situé à environ 4,4 kb en aval du gène pfhrp3. 4.9.3 Sérologie Une détection ultrasensible de HRP2 et pLDH par multiplexage ou ELISA sur DBS peut être utilisée pour étayer les résultats du génotypage, en particulier si les résultats obtenus par TDR et PCR sont discordants. 4.10 Procédures d’analyse des données Après double saisie des données (voir rubrique 4.8) et résolution des erreurs, la prévalence des faux négatifs au TDR HRP2 (sur la base du diagnostic) qui pourraient être dus à des délétions des gènes pfhrp2/3 (indicateur de résultat 1) sera déterminée à l’échelle du domaine/de la province, avec des IC à 95 % établis pour toutes les estimations ponctuelles. Ce processus doit reprendre le format du tableau « factice » fourni (annexe 6). Les estimations à l’échelle provinciale du résultat 1 seront ensuite ventilées par groupe d’âge, sexe, village et traitement antipaludique récent, afin d’observer l’émergence de profils potentiels. Il sera possible de pondérer les estimations ponctuelles et les IC à 95 % par taille relative de l’établissement ou circulation des patients. Les différences entre les estimations ponctuelles pour les diverses variables démographiques ou entre d’autres variables collectées pourront être étudiées par test du X2 et/ou régression logistique, au choix. Une fois les analyses de laboratoire achevées, la prévalence des délétions des gènes pfhrp2/3 sera estimée par génotypage +/- sérologie dans la cohorte suspecte (indicateur de résultat 2) à l’échelle provinciale et nationale (critère de résultat 3), avec des IC à 95 % pour toutes les estimations ponctuelles. Ce processus doit reprendre le format du tableau « factice » fourni (annexe 6). Le résultat 3 sera ensuite ventilé par province, groupe d’âge, sexe, village et traitement antipaludique récent, afin d’observer l’émergence de profils potentiels. Il sera possible de pondérer les estimations ponctuelles et les IC à 95 % en fonction de la taille relative de l’établissement ou de la circulation des patients, ainsi que de la taille relative de la province pour les estimations à l’échelle nationale. Les différences entre les estimations ponctuelles pour les diverses variables démographiques ou entre d’autres variables collectées pourront être étudiées par test du X2 et/ou régression logistique, au choix. Enfin, la dernière analyse inclura : • Le nombre total de cas suspects de paludisme dépistés • Le taux de positivité du TDR par établissement de soins • La performance comparative des TDR et des lignes tests de TDR en matière de détection de P. falciparum Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 17 4.11 Diffusion des résultats À la fin de l’étude, l’investigateur principal soumettra un rapport d’étude, avec un compte rendu des principaux résultats. Ce rapport sera communiqué dans le cadre du programme national de lutte contre le paludisme ainsi qu’au ministère de la Santé. Il permettra de rédiger des recommandations et le ministère de la Santé pourra ainsi prendre des décisions éclairées concernant l’actualisation des lignes directrices actuelles. Les données seront également communiquées dans le cadre du Programme mondial de lutte antipaludique de l’OMS de manière à pouvoir être intégrées à la Carte des menaces du paludisme (https://apps.who.int/malaria/maps/threats/) et au Rapport sur le paludisme dans le monde. • Indiquer si l’étude doit être présentée lors d’un congrès scientifique ou publiée. • Indiquer la manière dont les résultats seront diffusés aux patients de l’étude. • S’il s’agit d’une étude communautaire, mentionner par quels moyens la communauté sera informée et comment il est prévu de pérenniser la participation de cette communauté. 5. Calendrier de l’étude Le temps nécessaire au recrutement du nombre souhaité de participants à l’enquête dépendra : 1) du nombre de patients suspects de paludisme reçus chaque semaine dans chaque établissement ; 2) du taux de positivité du test (c’est-à-dire du nombre de positifs parmi les cas suspects de paludisme) dans chaque établissement ; et 3) de la taille d’échantillon nécessaire pour détecter si la prévalence observée de faux négatifs au TDR HRP2 dus à des délétions des gènes pfhrp2/3 est supérieure ou inférieure au seuil de 5 % (voir rubrique 4.4). Avant la mise en œuvre de ce protocole, les équipes du PNLP et de surveillance doivent prévoir le temps nécessaire au recrutement du nombre souhaité de participants dans chaque province et planifier le recrutement en conséquence. Le tableau 4 propose un exemple de calendrier. Attention : le mois de début dépendra du contexte local de transmission. TABLEAU 4. Exemple de calendrier d’étude Année Activités J F M A M J J A S O Approbation du Comité de protection des personnes (CPP) Mise au point de la base de sondage Sélection des provinces et des établissements Achat de toutes les fournitures d’enquête Participation de la communauté (si nécessaire) Recrutement et formation des collecteurs de données Collecte des données dans les établissements Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 18 Saisie des données Analyse de laboratoire Analyse des données Présentation des conclusions 6. Sujets humains 6.1 Généralités Tous les investigateurs suivront une formation sur le déroulement éthique des recherches impliquant la personne humaine, les objectifs de l’étude, les méthodes de communication efficace avec les participants à l’étude et la collecte de données de haute qualité. Cette formation insistera sur l’importance du consentement éclairé et sur la méthode de discussion sur les formulaires de consentement. Par ailleurs, l’équipe de l’étude recevra une formation spécifique selon les tâches qui lui incombent (par exemple, techniques d’entretien, collecte des échantillons et confidentialité des données). Avant tout travail sur le terrain, la documentation nécessaire sera remise aux comités d’éthique/comités de protection des personnes concernés. Cela inclut les cahiers de recherche, les procédures de mitigation des risques proposées pendant la collecte des données, ainsi que les formulaires de consentement et les plans de gestion des données, pour garantir la confidentialité et la sécurité des données. Tous les participants à la recherche seront invités à donner leur consentement personnel (ou leur assentiment, selon l’âge de la majorité et les lignes directrices fédérales dans le pays de recrutement) à participer. Le consentement au stockage à long terme/à la mise en banque de matériel biologique est distinct du consentement à participer à l’enquête. Dans tous les cas, le consentement est libre, et les participants ont le droit de refuser et de retirer leur consentement à tout moment. Le consentement éclairé de tous les participants sera obtenu à la fois oralement et par écrit, dans la langue locale préférée (annexe 3). Dans le cadre du processus de consentement, l’enquête et la mise en banque de matériel biologique seront expliquées et le formulaire de consentement sera lu à chaque personne ou remis aux participants afin qu’ils le lisent eux-mêmes. Des questions seront posées aux participants afin de s’assurer de leur compréhension. L’aspect libre de la participation sera souligné, ainsi que la possibilité, pour les participants, de retirer leur consentement à tout moment et de refuser de répondre aux questions. Le formulaire de consentement décrira de manière détaillée le plan de l’enquête, la mise en biobanque et les analyses prévues, y compris le stockage des données. Si les participants donnent leur accord, ils seront invités à signer le formulaire de consentement ou d’assentiment ou, s’ils sont analphabètes, à apposer l’empreinte de leur pouce en association avec la signature d’un témoin indépendant, selon les lignes directrices nationales. Pour les enfants n’ayant pas atteint l’âge légal, le consentement d’au moins un parent ou tuteur devra être obtenu. Cela est suffisant compte tenu des risques minimes. Par ailleurs, l’assentiment de l’enfant (annexe 4) devra être obtenu selon l’âge de la majorité et les lignes directrices fédérales dans le pays de recrutement, en plus du consentement d’un parent ou tuteur. Les enfants donnant leur assentiment devront signer en regard de leur nom ou apposer l’empreinte de leur pouce, accompagnée de la signature d’un témoin indépendant, sur le formulaire d’assentiment. Lorsque les sujets âgés de moins de 18 ans sont considérés comme des « mineurs mûrs » (correspondant parfois à des mineures enceintes, des sujets mineurs mariés ou chefs de famille, selon le contexte propre au pays) et qu’ils sont aptes à donner leur consentement en leur propre nom, l’assentiment ne sera pas Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 19 demandé. Des exemples de formulaires de consentement et d’assentiment sont inclus dans les annexes 3 et 4. La difficulté de lecture du formulaire de consentement ne doit pas dépasser le niveau d’un élève de dernière année de collège. Toutes les personnes menant les entretiens suivront une formation approfondie sur la procédure de consentement et chaque formulaire devra être contresigné (ou validé par une marque particulière) par un membre de l’équipe pour confirmer que tous les participants ont donné leur consentement. Un exemplaire de la note d’information sera remis à chaque sujet et l’attestation de consentement sera conservée par l’équipe d’enquête. Le nom et les coordonnées (téléphone et adresse) des investigateurs figureront sur tous les formulaires de consentement. Les participants pourront ainsi les contacter pour poser d’éventuelles questions ou s’ils souhaitent que leurs échantillons soient retirés de la biobanque. 6.2 Risques pour les sujets humains Cette activité de surveillance et de mise en banque de matériel biologique n’expose les participants qu’à un risque minime. La quantité de sang prélevée est très faible (environ 100–200 μL), et seule une petite ecchymose pourrait apparaître au point de ponction. La piqûre initiale peut entraîner une légère gêne ou une douleur de faible intensité de courte durée. Les piqûres au doigt seront réalisées par du personnel qualifié pour assurer autant que possible la sécurité des participants. Des précautions seront prises pour éviter un saignement, notamment l’application immédiate d’un tampon d’ouate et d’une pression sur le point de ponction. Le risque d’infection sera minimisé par un nettoyage du doigt à l’alcool avant la piqûre et par l’usage de lancettes jetables – une par participant pour éviter la contamination croisée/la transmission d’agents infectieux. Toutes les inquiétudes concernant les risques devront être atténuées autant que possible, par exemple par une sensibilisation de la communauté avant le début de l’enquête. 6.3 Protection contre les risques Les données de surveillance et de mise en banque de matériel biologique collectées ne sont pas jugées sensibles. Par conséquent, les risques attendus pour le participant sont minimes. En matière de confidentialité, seuls les patients ayant donné leur consentement inscriront leur nom sur le formulaire de consentement. Leur nom n’apparaîtra sur aucun registre/feuille de sondage, cahier de recherche ou échantillon destiné au diagnostic dans le cadre de l’enquête ou de la mise en banque. Des mesures seront prises pour assurer la confidentialité du nom de chaque participant à l’étude. Il n’existe aucun lien entre les registres cliniques (contenant des données personnelles) et les cahiers de recherche formalisés. Les échantillons de DBS sur papier-filtre et les autres échantillons seront étiquetés uniquement au moyen d’un ID d’enquête et le consentement à la mise en banque de matériel biologique sera indiqué directement sur la DBS. La stratégie proposée pour limiter les risques inclut : 1. Expliquer méthodiquement les procédures physiques à chaque participant pour qu’il comprenne le risque de douleur associé à la collecte de données sur le paludisme, mais aussi le caractère très probablement temporaire de cette douleur. 2. S’assurer que les agents de santé sont à même de répondre aux questions fréquemment posées et de comprendre la nature de ces questions. 3. S’assurer que les compétences en matière de prélèvement et de manipulation des échantillons biologiques des agents de santé utilisant des TDR dans leur pratique courante sont contrôlées et que tous les membres du personnel responsable de la saisie des données (qui peuvent également être des agents de santé) ont reçu une formation sur la confidentialité, la sécurité et les procédures de consentement éclairé ; tous les membres de Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 20 l’équipe doivent avoir été formés aux précautions universelles de manipulation des échantillons biologiques. 4. Former les responsables terrain à la gestion du protocole. Des contrôles inopinés par le personnel encadrant permettront de mieux évaluer la gestion du protocole. 5. Utiliser les procédures de test les plus efficaces disponibles pour garantir une collecte et des tests sûrs des données biologiques, dans des conditions de stérilité. Les échantillons pour les deux TDR et les DBS seront prélevés en même temps. 6. Évaluer les méthodes de protection contre les infections transmissibles par le sang, notamment l’infection à VIH, conformément aux lignes directrices nationales, et les plans de mesures correctives en cas d’infection par piqûre accidentelle à l’aiguille pendant les prélèvements. Assurer une formation initiale/remise à niveau concernant les précautions standard universelles (à savoir, utilisation de gants et d’équipement stérile pour toutes les manipulations de fluides) afin de minimiser les risques de transmission des participants aux personnes réalisant les prélèvements et inversement. En cas de piqûre accidentelle à l’aiguille, des conseils et un traitement appropriés doivent immédiatement être proposés à la personne concernée dans l’établissement de soins adapté le plus proche, conformément au protocole national. 7. S’assurer que des procédures de protection de la vie privée répondant à toutes les situations possibles ont été prévues. 6.4 Suivi et plan de protection des données Les participants, les parents et les tuteurs seront informés que la participation à une étude de recherche peut entraîner une violation de la vie privée. La confidentialité de tous les dossiers sera maintenue autant que possible et des mesures seront prises pour assurer la confidentialité des données personnelles de chaque participant à l’enquête/à la mise en banque de matériel biologique. Toute donnée personnelle stockée de manière prolongée sera identifiée par l’ID d’enquête du participant. Les échantillons sur papier-filtre porteront uniquement l’ID d’enquête unique du participant, ou un code à barres. Cet ID permettra uniquement au médecin responsable du recrutement, dans un premier temps, puis ultérieurement au coordinateur d’étude et à l’investigateur principal, d’établir le lien avec le participant par le biais du formulaire de consentement (si le participant a donné son consentement). Lors des analyses de laboratoire, aucun lien ne pourra être établi entre les échantillons biologiques et les informations identifiant les participants. Tous les formulaires de consentement portant un ID d’enquête seront stockés dans une armoire fermée à clé et protégés par un mot de passe pour les versions informatiques. Seuls le coordinateur de l’étude et l’investigateur principal y auront accès. L’identité d’aucune personne ne sera divulguée dans les rapports ou les publications concernant l’étude. 6.5 Indemnisation Ni argent ni avantage d’une autre nature ne sera proposé en indemnisation de la participation à l’enquête ou à la mise en banque de matériel biologique. Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 21 7. Références 1. Howard R.J., Uni S., Aikawa M., Aley S.B., Leech J.H., Lew A.M., et al. « Secretion of a malarial histidine-rich protein (Pf HRP II) from Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. » J Cell Biol. 1986;103(4):1269–77. 2. Lee N., Baker J., Andrews K.T., Gatton M.L., Bell D., Cheng Q., et al. « Effect of sequence variation in Plasmodium falciparum histidine-rich protein 2 on binding of specific monoclonal antibodies: implications for rapid diagnostic tests for malaria. » J Clin Microbiol. 2006;44(8):2773–8. 3. False-negative RDT results and implications of new reports of P. falciparum histidine-rich protein 2/3 gene deletions. Genève : Organisation mondiale de la Santé (2017) (WHO/HTM/GMP.2017.18 ; www.who.int/malaria/publications/atoz/information-note-hrp2- based-rdt/en/). 4. Cheng Q., Gatton M.L., Barnwell J., Chiodini P., McCarthy J., Bell D., et al. « Plasmodium falciparum parasites lacking histidine-rich protein 2 and 3: a review and recommendations for accurate reporting. » Malar J. 2014;13:283. 5. Gamboa D., Ho M.F., Bendezu J., Torres K., Chiodini P.L., Barnwell J.W., et al. « A large proportion of P. falciparum isolates in the Amazon region of Peru lack pfhrp2 and pfhrp3: implications for malaria rapid diagnostic tests. » PLoS One. 2010;5(1):e8091. 6. Bharti P.K., Chandel H.S., Ahmad A., Krishna S., Udhayakumar V., Singh N. « Prevalence of pfhrp2 and/or pfhrp3 gene deletion in Plasmodium falciparum population in eight highly endemic states in India. » PLoS One. 2016;11(8):e0157949. 7. Koita O.A., Doumbo O.K., Ouattara A., Tall L.K., Konaré A., Diakité M., et al. « False-negative rapid diagnostic tests for malaria and deletion of the histidine-rich repeat region of the hrp2 gene. » Am J Trop Med Hyg. 2012;86(2):194–8. 8. Abdallah J.F., Akinyi Okoth S., Fontecha G.A., Mejia Torres R.E., Banegas E.I., Matute M.L., et al. « Prevalence of pfhrp2 and pfhrp3 gene deletions in Puerto Lempira, Honduras. » Malar J. 2015;14:19. 9. Amoah L.E., Abankwa J., Oppong A. « Plasmodium falciparum histidine rich protein-2 diversity and the implications for PfHRP 2: based malaria rapid diagnostic tests in Ghana. » Malar J. 2016;15:101. 10. Murillo Solano C., Akinyi Okoth S., Abdallah J.F., Pava Z., Dorado E., Incardona S., et al. « Deletion of Plasmodium falciparum histidine-rich protein 2 (pfhrp2) and histidine-rich protein 3 (pfhrp3) genes in Colombian parasites. » PLoS One. 2015;10(7):e0131576. 11. Dorado E.J., Akinyi Okoth S., Montenegro N., Diaz G., Barnwell J.W., Udhayakumar V., et al. « Genetic characterisation of Plasmodium falciparum isolates with deletion of the pfhrp2 and/or pfhrp3 genes in Colombia: the Amazon region, a challenge for malaria diagnosis and control. » PLoS One. 2016;11(9):e0163137. 12. Li P., Xing H., Zhao Z., Yang Z., Cao Y., Li W., et al. « Genetic diversity of Plasmodium falciparum histidine-rich protein 2 in the China-Myanmar border area. » Acta Trop. 2015;152:26–31. 13. Akinyi Okoth S., Abdallah J.F., Ceron N., Adhin M.R., Chandrabose J., Krishnalall K., et al. « Variation in Plasmodium falciparum histidine-rich protein 2 (pfhrp2) and Plasmodium Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 22 falciparum histidine-rich protein 3 (pfhrp3) gene deletions in Guyana and Suriname. » PLoS One. 2015;10(5):e0126805. 14. Wurtz N., Fall B., Bui K., Pascual A., Fall M., Camara C., et al. « Pfhrp2 and pfhrp3 polymorphisms in Plasmodium falciparum isolates from Dakar, Senegal: impact on rapid malaria diagnostic tests. » Malar J. 2013;12:34. 15. Berhane A., Anderson K.F., Mihreteab S., Gresty K., Rogier E., Mohamed S....Cunningham J. (2018). « Major Threat to Malaria Control Programs by Plasmodium falciparum Lacking Histidine-Rich Protein 2, Eritrea. » Emerging Infectious Diseases, 24(3), 462-470. 16. Malaria rapid diagnostic test performance. Results of WHO product testing of malaria RDTs: round 8 (2016–2018). Genève : Organisation mondiale de la Santé (2017) (www.who.int/malaria/publications/atoz/9789241514965/en/). 17. Levy P.S., Lemeshow S. Sampling of populations: methods and applications. 3e édition. New York : John Wiley & Sons (1999). 18. Ranford-Cartwright L.C., Taylor J., Umasunthar T., Taylor L.H., Babiker H.A., Lell B., et al. « Molecular analysis of recrudescent parasites in a Plasmodium falciparum drug efficacy trial in Gabon. » Trans R Soc Trop Med Hyg. 1997;91(6):719–24. Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 23 8. Annexes Annexe 1 : Possibilités de collecte de données supplémentaires Annexe 2 : Feuille de sondage pour les établissements participant à l’enquête Annexe 3 : Modèle de formulaire de consentement éclairé Annexe 4 : Modèle de formulaire d’assentiment éclairé Annexe 5 : Cahier de recherche formalisé Annexe 6 : Tableau de prévalence des délétions des gènes pfhrp2/3 Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 24 Annexe 1 : Analyse de données supplémentaires pour déterminer la prévalence des délétions des gènes pfhrp2/3 Pour satisfaire les critères d’évaluation principaux de l’enquête, seuls les échantillons issus de patients suspects d’infection à parasites porteurs de délétions du gène pfhrp2 sont prioritaires pour l’analyse des délétions des gènes pfhrp2/3. Cette stratégie réduit le nombre d’échantillons à transporter et à soumettre à l’analyse par PCR +/- sérologie. Cependant, comme l’indique le tableau A1, cette stratégie présente certaines limites, car les autres patients suspects de paludisme à parasites porteurs de délétions des gènes pfhrp2/3 ne seront pas identifiés. Si, après évaluation des ressources disponibles pour l’analyse des cas suspects de délétions des gènes pfhrp2/3, les fonds ne sont pas épuisés, une analyse supplémentaire de sous-groupes de DBS provenant de patients ayant obtenu des résultats positifs et négatifs au TDR HRP2 (non identifiés par les deux TDR ou par un TDR associé à l’examen microscopique) peut être effectuée. L’analyse du premier sous-groupe de patients permettra d’identifier les infections dues à des parasites négatifs pour pfhrp2 mais positifs pour pfhrp3, qui réagiront aux TDR HRP2 en raison de la réactivité croisée entre HRP2 et HRP3, ainsi que les infections multiclonales par des parasites porteurs et des parasites non porteurs de délétions des gènes pfhrp2/3. L’analyse du second sous-groupe permettra de déterminer la présence de délétions des gènes pfhrp2/3 en cas de très faible densité parasitaire. Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 25 TABLEAU A1 Possibilités d’analyse de gouttes de sang séché supplémentaires et leurs limites en matière de détection des délétions des gènes pfhrp2/3 TDR HRP2 Pf-LDH/ examen microscopi- que Diagnostic Ordre de priorité pour l’analyse des DBS Interprétation des résultats et limites de la détection des délétions des gènes pfhrp2/3 + + P. falciparum 2 • Il peut s’agir d’une infection par des parasites porteurs de délétions du gène pfhrp2, mais avec détection de HRP3 par le TDR HRP2 • Il peut s’agir d’une infection multiclonale par des parasites porteurs et des parasites non porteurs de délétions des gènes pfhrp2/3 + - P. falciparum 3 • Faux positifs au TDR HRP2 (ou HRP2 persistante après disparition de l’infection) • Il peut s’agir d’une infection par des parasites porteurs de délétions du gène pfhrp2, mais avec détection de HRP3 par le TDR HRP2 • Il peut s’agir d’une infection à Pf de faible densité qui n’entraîne pas de réaction avec le TDR Pf- LDH en raison de la faible concentration en antigènes • Il peut s’agir d’une infection multiclonale par des parasites porteurs et des parasites non porteurs de délétions des gènes pfhrp2/3 - + P. falciparum 1 • Faux positifs au TDR Pf-LDH ou à l’examen microscopique • Faible densité parasitaire égale à la limite de détection des TDR entraînant une réactivité variable des TDR - - Négatif pour le paludisme 4 • Une infection à faible densité non détectée par les deux TDR, avec absence d’identification des délétions des gènes pfhrp2/3, ne peut être écartée. Utiliser la PCR pour exclure le paludisme. Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 26 Annexe 2 : Feuille de sondage pour les établissements participant à l’enquête sur les délétions des gènes pfhrp2/3 Cette feuille devra être remplie dans tous les établissements. Dans chaque province, dès que 370 personnes atteintes de paludisme à P. falciparum auront été vues (37 dans chacun des 10 sites de recrutement par province), calculer la proportion de diagnostics discordants (c’est-à-dire positifs pour le TDR Pf-LDH ou l’examen microscopique ET négatifs pour le TDR HRP2) parmi tous les diagnostics avérés d’infection à P. falciparum. Après compilation centralisée, les points 6 et 8 de la rubrique 4.6 pourront être utilisés pour interpréter les résultats et déterminer les mesures à prendre à la suite de l’analyse statistique des données de confirmation moléculaire +/- sérologique. A B C D E F G ID p at ie n t D at e d e la vi si te /d u t es t (J J/ M M /A A ) C o n se n te m e n t/ as se n ti m e n t éc la ir é C as P f co n fi rm é p ar au m o in s u n e m é th o d e d e d ia gn o st ic N o m b re c u m u lé d e ca s P f p o si ti fs ( p ar ra p p o rt à la co lo n n e E ) Su sp ic io n s d e fa u x n ég at if s H R P 2 (p o si ti fs p o u r P f- LD H o u l’ e xa m e n m ic ro sc o p iq u e ET n ég at if s p o u r le TD R H R P 2 ) 1 O / N O / N / s.o. O / N / s.o. 2 O / N O / N / s.o. O / N / s.o. 3 O / N O / N / s.o. O / N / s.o. 4 O / N O / N / s.o. O / N / s.o. 5 O / N O / N / s.o. O / N / s.o. * Ajouter autant de lignes que nécessaire Nbre total de cas suspects de paludisme testés (colonne A) ___________ Total du sondage après détection de 37 cas d’infection à P. falciparum par établissement (colonne F – égal à 37) Nombre de suspicions de faux négatifs au TDR HRP2 (colonne G – somme des réponses « Oui ») (a) ___________ Nombre total de diagnostics avérés d’infection à P. falciparum quel que soit le test (dernière entrée de la colonne F) (b) ___________ Pourcentage de l’ensemble des cas Pf obtenant des suspicions de faux négatifs au TDR HRP2 et nécessitant une analyse moléculaire +/- sérologique des délétions des gènes pfhrp2/3 (a / b) Cible : 37 cas d’infection à P. falciparum détectés par établissement (dernière entrée de la colonne F) Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 27 Annexe 3 : Formulaire de consentement éclairé (modèle) (Remarque : l’âge du consentement peut varier d’un pays à l’autre ; ce formulaire doit donc être utilisé en conformité avec les lignes directrices nationales et doit être traduit dans la langue locale) Nom et version de la proposition : ID d’enquête : coller l’étiquette ici Ce formulaire de consentement éclairé est destiné aux adultes majeurs qui consultent à <nom du site> invités à participer à une enquête sur les délétions des gènes pfhrp2/3 et sur la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures. Nom de l’investigateur principal : Nom de l’organisation : Nom du promoteur : Sites d’enquête : Ce formulaire de consentement éclairé comporte deux parties : I. Note d’information (qui vous communique des informations sur l’étude) II. Attestation de consentement (à signer si vous acceptez de participer) Vous recevrez un exemplaire de la note d’information. Partie I : Note d’information Je m’appelle ……………………………………………………. et je travaille dans le programme national de lutte contre le paludisme. Vous (ou votre enfant) êtes aujourd’hui invité·e à participer à une étude de recherche qui a pour but de mieux comprendre si le parasite responsable du paludisme se transforme au cours du temps, et si cela influe sur l’efficacité des tests de diagnostic rapide utilisés dans votre pays. Vous (ou votre enfant) êtes invité·e à participer à cette étude, car vos symptômes laissent penser que vous pourriez être atteint·e de paludisme. Cette étude a été passée en revue par le comité de protection des personnes local. Aucune activité de recherche n’aura lieu avant que vous ayez pu consulter ce formulaire de consentement, poser toutes vos questions éventuelles et donner votre consentement. Nous vous encourageons à poser des questions aussi bien maintenant que plus tard. Si vous décidez de participer, vous devrez signer le formulaire de consentement ou apposer l’empreinte de votre pouce en association avec la signature d’un témoin indépendant. Un exemplaire de ce formulaire vous sera remis. Votre participation (ou celle de votre enfant) est entièrement libre et n’aura absolument aucune influence sur le traitement et les soins que vous recevez pour le paludisme ou tout autre problème de santé. Pourquoi cette enquête est-elle réalisée ? Nous réalisons cette enquête car nous souhaitons examiner les échantillons de sang de personnes qui pourraient selon nous être atteintes de paludisme, puis utiliser ces échantillons pour savoir si le parasite responsable du paludisme se transforme au cours du temps et influe sur l’efficacité des tests de dépistage. Un résultat faussement négatif au test peut être dû soit à un problème lié au test, soit à une transformation des parasites responsables du paludisme rendant leur détection difficile. Nous vous poserons quelques questions et réaliserons des tests supplémentaires pour Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 28 savoir si vous êtes atteint·e de paludisme. Nous vous demanderons l’autorisation de conserver vos échantillons pour de futures recherches sur le paludisme. Quelles sont les procédures d’étude ? Que devrai-je faire ? Si vous acceptez de participer à l’enquête, nous vous poserons quelques questions simples, notamment sur votre âge, le village où vous vivez et les tests que vous avez passés et les médicaments que vous avez pris pour le paludisme ces dernières semaines. Lorsque nous piquerons votre doigt pour le test de diagnostic rapide du paludisme habituel, nous prendrons également quelques gouttes de sang supplémentaires pour effectuer un autre test du paludisme aujourd’hui et nous placerons des gouttes sur du papier pour réaliser d’autres tests. Ces tests permettront de savoir si les parasites responsables du paludisme se sont transformés d’une manière qui rend leur détection difficile. Ces tests seront réalisés à (nom du lieu). Lorsque nous aurons réalisé les tests habituels et l’enquête, tout le sang n’aura peut-être pas été utilisé. Au lieu de le jeter, nous souhaiterions, avec votre permission, le conserver au (nom du laboratoire) pendant (indiquer le nombre d’années). Passé ce délai, ce sang sera détruit. Nous pourrons utiliser ce sang uniquement dans le cadre de futures études sur le paludisme, en particulier pour aider à mettre au point de nouveaux tests de diagnostic. Vos échantillons ne seront pas vendus et seul un comité d’éthique national et/ou d’établissement pourra autoriser leur utilisation. Quels sont les risques et désagréments liés à l’étude ? Il n’existe que très peu de risques d’effets nocifs pour les personnes qui acceptent de participer à l’enquête. Un bleu de petite taille ou une légère douleur temporaire peut survenir sur le doigt où le sang est prélevé. Il existe également un léger risque d’infection lors de la prise de sang. Cependant, les précautions que nous prenons rendent cela très peu probable. Un désagrément possible est la prolongation de 10-15 minutes de votre visite aujourd’hui, pour que vous ayez le temps de répondre aux questions. Cette enquête se déroule sur une seule visite. Il n’y aura donc aucune visite de suivi. Un autre risque est qu’une personne étrangère à l’équipe d’étude accède à vos informations. Cela ne survient que rarement. En effet, nous ne noterons pas votre nom (ou celui de votre enfant) sur les formulaires d’enquête ou sur vos échantillons envoyés au(x) laboratoire(s). Quels sont les bénéfices de l’étude ? Le bénéfice d’une participation à cette étude est que nous allons réaliser aujourd’hui un test supplémentaire du paludisme et que cela augmentera la probabilité de savoir si vous êtes atteint·e de paludisme. Par ailleurs, si vous acceptez de faire don du sang non utilisé, votre participation pourrait permettre de créer des programmes de santé publique utilisant des tests plus efficaces du paludisme et de savoir si le parasite responsable du paludisme se transforme au cours du temps. La participation engendre-t-elle des frais ? La participation est gratuite, mais vous (ou votre enfant) ne recevrez aucune indemnisation si vous décidez de prendre part à cette étude. Comment mes informations personnelles seront-elles protégées ? Nous mettrons en œuvre toutes les mesures nécessaires pour garantir que la confidentialité de vos informations (ou de celles de votre enfant) sera maintenue autant que possible. Par exemple, nous Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 29 n’utiliserons pas votre nom ou d’autres informations vous identifiant dans les documents d’étude, sur les échantillons de sang ou dans des publications. Nous les remplacerons par un numéro d’identification. Seules les personnes qui recueillent votre consentement aujourd’hui et l’investigateur principal de l’enquête pourront établir le lien entre votre nom et votre numéro d’identification dans l’enquête. Les formulaires de consentement portant votre nom et votre signature seront stockés dans une armoire fermée à clé et protégés par un mot de passe pour les versions informatiques. Les personnes responsables du stockage prolongé de votre échantillon (ou de celui de votre enfant) ne connaîtront pas votre nom. Puis-je arrêter de participer à l’étude et quels sont mes droits ? Si vous ne le souhaitez pas, vous n’êtes pas obligé·e de participer à cette enquête ni de nous autoriser à conserver vos échantillons inutilisés pour de futures recherches. Vous n’en subirez aucune conséquence. Vous pouvez vous retirer (ou retirer votre enfant) de la participation à l’étude à tout moment sans en subir de conséquence et vous (votre enfant lorsqu’il sera majeur) pouvez aussi demander le retrait des échantillons de sang inutilisés du stockage prolongé. Pour les parents donnant leur consentement au nom de leur enfant : Si vous consentez au stockage prolongé des échantillons de sang inutilisés de votre enfant, nous vous conseillons de lui remettre l’attestation de consentement dès qu’il aura atteint l’âge de maturité. Cette attestation porte le numéro d’ID de l’enquête et les coordonnées de l’investigateur principal. Votre enfant pourra s’en servir s’il souhaite que ces échantillons soient retirés du stockage et ne soient plus utilisés. Qui dois-je contacter si j’ai des questions sur l’étude ? Si vous avez des questions, vous pouvez contacter l’investigateur principal, NOM au NUMÉRO DE TÉLÉPHONE. Si vous avez des questions sur vos droits en tant que participant à une étude ou si vous souhaitez parler à une personne qui ne participe pas à ce projet de recherche, veuillez contacter NOM ET ADRESSE. ID d’enquête : coller l’étiquette ici Partie II : Attestation de consentement J’ai été invité·e à participer à une étude qui a pour but de mieux comprendre si le parasite responsable du paludisme se transforme au cours du temps, et si cela influe sur l’efficacité des tests de diagnostic rapide utilisés dans mon pays. J’ai lu les informations ci-dessus ou elles m’ont été lues. J’ai eu l’occasion de poser des questions et j’ai reçu des réponses satisfaisantes à toutes mes questions. Je consens librement à participer à cette étude. Nom du participant, en caractères d’imprimerie : Signature du participant : Date : jj/mmm/aaaa Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 30 Stockage prolongé et futures études : J’autorise l’équipe d’étude à stocker mes échantillons de sang (ou ceux de mon enfant) (papier-filtre) pour de futures études sur le paludisme. J’ai compris que je pouvais changer d’avis et refuser ensuite que mes échantillons de sang sur papier-filtre soient conservés et utilisés pour de futures recherches. Si vous êtes d’accord, entourez « OUI ». Si vous n’êtes pas d’accord, entourez « NON ». OUI NON Adulte/mineur mûr donnant son consentement pour lui- même ou un enfant Nom Signature/empreinte Date___ / ___ / ____ Signature du témoin : La signature d’un témoin et l’empreinte du pouce du patient sont requises uniquement si le patient est analphabète. Un témoin sachant lire et écrire doit alors signer. Dans la mesure du possible, cette personne doit avoir été choisie par le participant et ne doit avoir aucun lien avec l’équipe de l’étude. J’ai été témoin de la lecture fidèle du formulaire de consentement au participant potentiel, qui a eu l’occasion de poser des questions. Je confirme que le participant a donné son consentement librement. Nom du témoin, en caractères d’imprimerie : et empreinte du pouce du participant : Signature du témoin : Date : jj/mmm/aaaa Stockage prolongé et futures études : J’ai été témoin de la lecture fidèle de la demande de stockage prolongé des échantillons pour de futures études sur le paludisme. J’ai compris que le participant pouvait changer d’avis et refuser ensuite que ses échantillons de sang sur papier-filtre soient conservés et utilisés pour de futures recherches. Le participant potentiel a eu l’occasion de poser des questions. Je confirme que le participant a donné son accord : Si vous êtes d’accord, entourez « OUI ». Si vous n’êtes pas d’accord, entourez « NON ». OUI NON Signature de l’investigateur : J’ai lu fidèlement ou été témoin de la lecture fidèle du formulaire de consentement au participant potentiel, qui a eu l’occasion de poser des questions. Je confirme que le participant a donné son consentement librement. Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 31 Nom de l’investigateur, en caractères d’imprimerie : Signature de l’investigateur : Date : jj/mmm/aaaa Un exemplaire de la note d’information portant l’ID d’enquête a été remis au patient. _____ (initiales de l’investigateur principal ou de son assistant). Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 32 Annexe 4 : Formulaire d’assentiment éclairé (modèle) pour les enfants âgés de 7 à 15 ans invités à participer à une enquête sur les délétions des gènes pfhrp2/3 et à la mise en banque de matériel biologique pour de futures études (Remarque : l’âge de l’assentiment peut varier d’un pays à l’autre ; ce formulaire doit donc être utilisé en conformité avec les lignes directrices nationales) Nom et version de la proposition : ID d’enquête : coller l’étiquette ici Nom de l’investigateur principal : Nom de l’organisation : Nom du promoteur : Sites d’enquête : Ce formulaire d’assentiment comporte deux parties : I. Note d’information (qui vous communique des informations sur l’étude) II. Attestation d’assentiment (à signer si vous acceptez de participer) Partie 1 : Note d’information Introduction Je m’appelle …………………………….. Mon travail est de mener cette recherche pour savoir si le parasite du paludisme se transforme au cours du temps et influe sur le fonctionnement des tests de dépistage. Je vais vous donner des informations et vous proposer de participer à une étude de recherche. C’est à vous de décider si vous souhaitez y participer ou non. Nous avons parlé de cette recherche avec vos parents/votre tuteur. Ils savent que nous vous demandons aussi votre accord. Pour que vous puissiez participer à la recherche, vos parents/votre tuteur doivent aussi être d’accord. Par contre, si vous ne souhaitez pas participer à la recherche, vous ne serez pas obligé·e de le faire, même si vos parents ont donné leur accord. Vous pouvez discuter du contenu de ce formulaire avec vos parents ou amis ou toute personne avec laquelle vous parlez librement. Vous pouvez décider de participer ou non après en avoir discuté. Vous n’êtes pas obligé·e de décider tout de suite. Il est possible que vous ne compreniez pas certains mots ou que vous souhaitiez des explications complémentaires sur des points qui vous intéressent ou vous inquiètent. N’hésitez pas à m’interrompre quand vous le souhaitez, je prendrai le temps de vous donner des explications. Objectif : pourquoi menons-nous cette recherche ? Il arrive que les parasites du paludisme se transforment au cours du temps, et nous voulons être sûrs que les tests que nous utilisons fonctionnent correctement – qu’ils donnent des résultats positifs en cas de paludisme et négatifs en l’absence de paludisme. Pour le savoir, nous devons tester le sang de personnes en utilisant différentes sortes de tests du paludisme. Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 33 Nous souhaitons également votre autorisation pour conserver le sang non utilisé qui servira à d’autres recherches. Celles-ci devraient nous aider à fabriquer de meilleurs tests du paludisme et à comprendre comment le paludisme évolue au cours du temps. Choix des participants : pourquoi moi ? Les enfants tels que vous tombent plus souvent malades à cause du paludisme que les adultes. Il est donc très important d’inclure des enfants dans cette recherche. La participation est libre : suis-je obligé·e de participer ? Vous n’êtes pas obligé·e de participer à cette recherche si vous ne le voulez pas. C’est vous qui décidez. Si vous décidez de ne pas participer à la recherche, il n’y a pas de problème et rien ne changera. C’est toujours votre clinique, tout reste comme avant. Même si vous acceptez maintenant, vous pourrez changer d’avis plus tard et ce ne sera pas un problème. J’ai vérifié auprès de l’enfant, qui comprend que la participation est libre __(initiales) Procédures : que va-t-il m’arriver ? Aujourd’hui, nous allons vous faire un test du paludisme, exactement comme nous le faisons habituellement. Toutefois, nous prélèverons quelques gouttes de sang en plus pour faire d’autres tests du paludisme aujourd’hui et nous conserverons certaines gouttes sur un petit morceau de papier pour faire d’autres tests plus tard. Nous souhaiterions ensuite conserver le sang non utilisé pour de futures recherches. J’ai vérifié auprès de l’enfant, qui comprend les procédures ________(initiales) Désagréments : est-ce que ça va faire mal ? Vous ressentirez une légère gêne lorsque nous piquerons votre doigt pour prélever le sang, mais cela ne durera pas. J’ai vérifié auprès de l’enfant, qui comprend les risques et les gênes ____(initiales) Bénéfices : est-ce que cela va m’apporter quelque chose ? En faisant plusieurs tests du paludisme, nous avons plus de chances de le détecter et de vous donner un traitement. Par ailleurs, si vous acceptez de faire don du sang non utilisé, votre participation pourrait permettre un jour à votre communauté d’avoir des tests plus efficaces du paludisme et de savoir si le parasite du paludisme se transforme au cours du temps. J’ai vérifié auprès de l’enfant, qui comprend les bénéfices _____ (initiales) Remboursements : est-ce que j’obtiendrai quelque chose en participant à la recherche ? Nous n’offrons ni argent ni cadeaux en retour de la participation. Confidentialité : est-ce que tout le monde sera au courant ? Nous ne dirons à personne d’autre que vous participez à cette recherche et nous ne partagerons pas les informations qui vous concernent avec des personnes qui ne travaillent pas dans l’étude de recherche. Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 34 Les informations qui vous concernent porteront un numéro à la place de votre nom. Seuls les chercheurs connaîtront votre numéro et nous conserverons cette information sous clé. Partage des conclusions : est-ce que vous me donnerez les résultats ? Dans le cadre de cette recherche, nous allons faire deux tests du paludisme sur votre sang au même moment aujourd’hui. Nous vous donnerons immédiatement les résultats de ces deux tests, ainsi qu’à vos parents/votre tuteur. Les autres tests de recherche du parasite seront effectués ailleurs dans le pays ou à l’étranger. Ces résultats seront communiqués au gouvernement et à d’autres personnes, comme des scientifiques, pour les aider à prendre des décisions sur le meilleur test à utiliser pour le paludisme. Droit de refus ou de retrait : puis-je choisir de ne pas participer à la recherche ? Puis-je changer d’avis ? Vous n’êtes pas obligé·e de participer à cette recherche ou vous pouvez accepter d’y participer mais ne pas nous autoriser à conserver le sang non utilisé pour de futures recherches. Personne ne vous en voudra ou ne sera déçu si vous dites non. C’est vous qui choisissez. Vous pouvez dire « oui » maintenant et changer d’avis plus tard et ce ne sera pas un problème. Qui contacter : à qui puis-je parler ou poser des questions ? Vous pouvez me poser des questions maintenant ou plus tard. Vous pouvez poser des questions à l’infirmier/ère. J’ai noté le numéro et l’adresse auxquels vous pouvez nous joindre ou, si vous habitez près de cette adresse, vous pouvez passer nous rendre visite. Si vous voulez parler à quelqu’un d’autre de votre connaissance, comme votre enseignant, votre médecin ou votre tante, il n’y a pas de problème. Si vous choisissez de participer à cette recherche, je vous donnerai aussi une copie de ce papier que vous pourrez garder. Vous pouvez demander à vos parents de s’en occuper, si vous le souhaitez. Vous pouvez me poser d’autres questions sur cette partie de l’étude de recherche, si vous le souhaitez. Avez-vous des questions ? PARTIE 2 : Attestation d’assentiment J’ai compris que cette recherche a pour but de savoir si le parasite du paludisme se transforme au cours du temps et influe sur le fonctionnement des tests du paludisme. J’ai compris que mon doigt sera piqué pour faire deux tests du paludisme aujourd’hui et que quelques gouttes seront mises sur du papier et serviront à d’autres recherches futures sur le paludisme. J’ai lu ces informations (ou elles m’ont été lues), j’ai eu une réponse à mes questions et je sais que je peux en poser d’autres plus tard. J’accepte de participer à cette recherche. OU Je ne souhaite pas participer à la recherche et je n’ai pas signé l’assentiment ci-dessous. ___________ (initiales de l’enfant/du mineur) Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 35 Uniquement en cas d’assentiment de l’enfant : Nom de l’enfant, en caractères d’imprimerie ___________________ Signature de l’enfant : ____________________ Date : ________________ jour/mois/année Stockage prolongé Stockage prolongé et futures études : J’autorise l’équipe d’étude à stocker mes échantillons de sang pour de futures études sur le paludisme. J’ai compris que je pouvais changer d’avis et refuser ensuite que mes échantillons de sang sur papier-filtre soient conservés et utilisés pour de futures recherches. Si vous êtes d’accord, entourez « OUI ». Si vous n’êtes pas d’accord, entourez « NON ». OUI NON Uniquement en cas d’assentiment de l’enfant : Nom de l’enfant, en caractères d’imprimerie ___________________ Signature de l’enfant : ____________________ Date : ________________ jour/mois/année Si l’enfant est analphabète : Un témoin sachant lire et écrire doit signer (dans la mesure du possible, cette personne doit avoir été choisie par le participant, ne pas être l’un de ses parents, et ne doit avoir aucun lien avec l’équipe de recherche). Les participants analphabètes doivent également apposer l’empreinte de leur pouce. J’ai été témoin de la lecture fidèle du formulaire d’assentiment à l’enfant, qui a eu l’occasion de poser des questions. Je confirme que la personne a donné son consentement librement. Nom du témoin, en caractères d’imprimerie (pas l’un des parents) _________________ ET empreinte du pouce du participant Signature du témoin ______________________ Date : ________________________ Jour/mois/année J’ai lu fidèlement ou été témoin de la lecture fidèle du formulaire d’assentiment au participant potentiel, qui a eu l’occasion de poser des questions. Je confirme que la personne a donné son assentiment librement. Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 36 Nom du chercheur, en caractères d’imprimerie_________________ Signature du chercheur___________________ Date__________________ Jour/mois/année Déclaration du chercheur/de la personne qui recueille le consentement J’ai lu fidèlement la note d’information au participant potentiel et, dans la mesure du possible, je me suis assuré que l’enfant a compris que les procédures suivantes auront lieu : 1. piqûre du doigt pour les tests du paludisme et goutte de sang sur papier-filtre 2. stockage prolongé du papier-filtre pour de futures recherches Je confirme que l’enfant a eu l’occasion de poser des questions sur l’étude et que j’ai répondu du mieux que j’ai pu à toutes ses questions. Je confirme qu’aucune contrainte n’a été exercée sur cette personne pour qu’elle donne son consentement, qui a été donné librement et volontairement. Un exemplaire de ce formulaire d’assentiment a été remis au participant. Nom du chercheur/de la personne recueillant l’assentiment, en caractères d’imprimerie________________________ Signature du chercheur/de la personne recueillant l’assentiment __________________________ Date ___________________________ Jour/mois/année Exemplaire remis au participant ________(initiales du chercheur/son assistant) Le parent/tuteur a signé un formulaire de consentement éclairé ___Oui ___Non _____(initiales du chercheur/de son assistant) Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 37 Annexe 5 : Cahier de recherche formalisé Remarque : Chaque cahier de recherche doit être préidentifié dans l’ordre chronologique avec un nombre suffisant d’étiquettes pour les TDR, les DBS et les sachets en plastique. Dans l’idéal, le cahier doit être produit en double exemplaire. Les cahiers doivent être préremplis avec les informations relatives au centre de santé et au TDR, c’est-à-dire le nom, la référence produit, les antigènes cibles, etc., et les rubriques non pertinentes (sans objet/s.o.). À remplir avant l’entretien avec le participant 1. Code à barres/ID patient Coller une étiquette 2 Centre de santé Présaisi pour chaque centre de santé sur le cahier imprimé ou associé à l’ID d’enquête 3. Nom de l’agent de santé/assistant de laboratoire 4. Date de la visite Jour____ Mois___ Année____ 5. Présaisi pour chaque centre de santé sur le cahier imprimé : TDR 1 (doit inclure le TDR HRP2 du programme national) a. Nom : b. Référence produit : c. Numéro de lot : d. Date de péremption : e. Antigènes cibles : 1. T1 : 2. T2 : 3. T3 : Encadré 1 Contrôle P.f HRP2 + / - + / - Entourer le résultat correct dans chaque encadré ci-dessus. Entourer le résultat du TDR : 1. Négatif 2. P. falciparum 6. TDR 2 (TDR étudié) a. Nom : b. Référence produit : c. Numéro de lot : d. Date de péremption : e. Antigènes cibles : 1. T1 : 2. T2 : 3. T3 : Encadré 2 Contrôle T2 pf-LDH T1 HRP2 + / - + / - + / - Entourer le résultat correct dans chaque encadré ci-dessus. Entourer le résultat du TDR : 1. Négatif 2. P. falciparum Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 38 7. a. Le TDR1 est-il positif pour P. falciparum ? b. Le TDR2 est-il positif pour P. falciparum ? O / N O / N Si la réponse à l’UNE ou l’AUTRE des questions est OUI, fournir un traitement. 8. DBS prélevée ? a) O / N b) consentement pour le stockage prolongé O/N 9. Examen microscopique Examen microscopique Positif/Négatif/s.o. Espèce Nombre de parasites (par microlitre) Initiales du microscopiste Établissement de santé de terrain Recoupement avec le laboratoire national (relevé 1) Recoupement avec le laboratoire national (relevé 2) À obtenir pour chaque patient suspect de paludisme 10. Âge, en années _________ 11. Sexe a. M b. F 12. Village de résidence du patient suspect de paludisme _______________________________________ À partir d’une liste préremplie, si possible 13. Au cours des 2 dernières semaines, avez-vous fait un test du paludisme ? a. Non → Aller à la question 14 b. Oui 14. Quel a été le résultat du test ? a. Positif b. Négatif c. Ne sait pas Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 39 S1 a. Réponse à l’encadré 1 négative ? b. Réponse à l’encadré 2 positive ? O / N O / N Si OUI dans la partie a et la partie b, discordance des résultats. 15. Au cours des 2 dernières semaines, avez-vous pris un ou des médicaments contre le paludisme ? c. Non → Aller à la question 17 d. Oui 16. Médicaments antipaludiques pris À partir d’une liste préremplie d. ACT (quelle que soit l’ACT utilisée en première intention dans le pays) e. Autres ACT (il peut s’agir d’autres noms désignant le médicament de première intention) f. Fansidar / SP / Sulfadoxine/pyriméthamine g. Quinine h. Panadol (antipyrétique disponible dans le pays) i. Autre ________________________________ j. Inconnu k. s.o. 17. Vous êtes-vous rendu·e dans une autre localité ou dans un autre pays ces 30 derniers jours ? a. Non → mettre fin à l’entretien b. Oui → aller à la question 18 18. Où vous êtes-vous rendu·e ? a. Pays___________________________ b. Région __________________________ c. District_____________________________ d. Ville/village__________________________ e. s.o. Remarque : les réponses doivent provenir d’une liste déroulante et suffisamment de place doit être prévue pour plusieurs entrées DESTINÉ UNIQUEMENT AU SUPERVISEUR : DESTINÉ UNIQUEMENT AU LABORATOIRE DE RÉFÉRENCE Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 40 17. Analyse moléculaire a. gène à copie unique 1 – présent/absent/non recherché b. gène à copie unique 2 – présent/absent/non recherché c. gène à copie unique 3 – présent/absent/non recherché d. exon 1 de HRP2 – présent/absent/non recherché e. exon 2 de HRP2 – présent/absent/non recherché f. région flanquante 230 de HRP2 – présente/absente/non recherchée g. région flanquante 228 de HRP2 – présente/absente/non recherchée h. exon 1 de HRP3 – présent/absent/non recherché i. exon 2 de HRP3 – présent/absent/non recherché j. région flanquante 485 de HRP3 – présente/absente/non recherchée k. région flanquante 475 de HRP3 – présente/absente/non recherchée 18. Sérologie a. pfhrp2+/pan-LDH+ b. pfhrp2-/pan-LDH- c. pfhrp2+/pan-LDH- d. pfhrp2-/pan-LDH+ Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 41 Annexe 6 : Tableau de prévalence des délétions des gènes pfhrp2/3a Prévalence des suspicions de faux négatifs au TDR HRP2b (n = XX) Prévalence des délétions des gènes pfhrp2/3 confirméesc (n = XX) Caractéristique (IC à 95 %) (IC à 95 %) Âge, en années < 2 3–5 6–9 10–19 20–29 30–39 40–49 50–59 ≥ 60 Sexe Masculin Féminin Milieu Urbain Rural Province (domaine d’enquête) Province 1 Province 2 Province 3 Province 4 Province 5 Établissement de soins (facultatif) Établissement 1 Établissement 2 Établissement 3 Établissement 4 Établissement 5 Établissement 6 Établissement 7 Établissement 8 Établissement 9 Établissement 10 Traitement antipaludique au cours des 2 dernières semaines Oui Non Total a – Le tableau repose sur le dépistage des délétions des gènes pfhrp2/3 uniquement chez les cas d’infection à P. falciparum obtenant des résultats discordants. Si tous les cas d’infection à Pf ou tous les cas suspects sont dépistés, ce cahier doit être adapté en conséquence. Protocole original pour la surveillance des délétions des gènes pfhrp2/3 et la mise en banque de matériel biologique en vue de recherches ultérieures | 42 b – Prévalence des suspicions de faux négatifs au TDR HRP2 de P. falciparum = nbre résultats discordants (négatifs pour HRP2 et positifs pour Pf-LDH ou l’examen microscopique) / tous les cas d’infection à P. falciparum confirmés par diagnostic. c – Prévalence des délétions des gènes pfhrp2/3 = nbre de cas Pf porteurs de délétions des gènes pfhrp2/3 entraînant des faux négatifs au TDR HRP2 / nbre total de cas d’infection à P. falciparum