Examen microscopique des frottis minces et des gouttes épaisses pour l'identification de parasites du paludisme

VERSION 1 – DATE EFFECTIVE : 01/01/2016 EXAMEN MICROSCOPIQUE DES FROTTIS MINCES ET DES GOUTTES ÉPAISSES POUR L’IDENTIFICATION DE PARASITES DU PALUDISME DIAGNOSTIC MICROSCOPIQUE DU PALUDISME MODES OPÉRATOIRES NORMALISÉS – DMP-MON-08 1. OBJECTIF ET CHAMP D’ACTION Fournir une description détaillée de la procédure à suivre pour une détection et une identification correcte des parasites du paludisme par microscopie optique dans les étalements de sang colorés au Giemsa. Cette procédure ne peut être modifiée qu’avec l’approbation du coordonnateur national pour l’assurance de la qualité du diagnostic microscopique du paludisme. Toutes les procédures exposées ici sont obligatoires pour tous les techniciens de la microscopie travaillant dans les laboratoires nationaux de référence, dans les laboratoires des hôpitaux ou dans les laboratoires médicaux de base au sein des établissements sanitaires où sont effectués des examens microscopiques pour le diagnostic du paludisme. 2. HISTORIQUE L’identification des espèces et des stades des parasites du paludisme, ainsi que le calcul de leur densité, sont des éléments cruciaux dans la prise en charge clinique des cas de paludisme, les études évaluant l’efficacité thérapeutique des médicaments, les enquêtes épidémiologiques sur le paludisme et les programmes de lutte. Par conséquent, le diagnostic du paludisme fondé sur l’examen des étalements sanguins doivent être corrects et fournir une numération parasitaire exacte. L’examen des étalements sanguins permet également de détecter plusieurs agents pathogènes sanguicoles, de poser un diagnostic morphologique d’anémie et d’identifier plusieurs troubles hématologiques, qui doivent être notifiés par le technicien de la microscopie. 3. FOURNITURES, MATÉRIEL ET ÉQUIPEMENTS • Un microscope composé, équipé d’une paire d’oculaires 10x ; des objectifs 10x, 40x et 100x ; une platine mobile (un marqueur à objectif, ainsi qu’un objectif 60x peuvent être montés le cas échéant). • Les étalements sanguins colorés au Giemsa que vous devez examiner. • De l’huile à immersion de type A d’excellente qualité. • Du papier pour objectif. • Un stylo et un crayon. • Un formulaire d’enregistrement ou un registre du paludisme. 2DMP–MON–08 : EXAMEN MICROSCOPIQUE DES FROTTIS MINCES ET DES GOUTTES ÉPAISSES POUR L’IDENTIFICATION DE PARASITES DU PALUDISME 4. PROCÉDURE SCHÉMA DESCRIPTION DE L’ACTIVITÉ 4.1. Examen microscopique d’une goutte épaisse 1. Mettez l’étalement de sang coloré au Giemsa sur la platine, en positionnant la goutte épaisse sur l’axe de l’objectif 10x, étiquette du côté gauche. 2. Allumez le microscope et réglez la lumière jusqu’à ce que l’éclairage soit optimal. 3. Mettez une goutte d’huile à immersion sur la goutte épaisse. 4. Cherchez et sélectionnez la partie de l’étalement qui est bien colorée et lisse. 5. Passez à l’objectif 100x à immersion et laissez l’objectif entrer en contact avec l’huile à immersion. 6. Avec la vis de mise au point fine, réglez le microscope sur l’étalement. 4.1. Examen microscopique d’une goutte épaisse 1. Mettez l’étalement de sang coloré au Giemsa sur la platine, étiquette du côté gauche. Positionnez la goutte épaisse sur l’axe de l’objectif 10x. 2. Allumez le microscope, réglez la lumière jusqu’à ce que l’éclairage soit optimal et faites la mise au point en regardant à travers l’oculaire et l’objectif 10x. 3. Recherchez dans la lame la présence de parasites et d’éléments sanguins. Sélectionnez la partie de l’étalement qui est bien colorée et dont la répartition des leucocytes est homogène. 4. Mettez une petite goutte d’huile à immersion sur la goutte épaisse. Pour éviter toute contamination croisée, veillez à ce que l’applicateur de l’huile à immersion n’entre jamais en contact avec la lame. Ne faites pas entrer l’objectif 40x en contact avec l’huile. 5. Faites passer l’objectif 100x à immersion audessus de la partie de la goutte épaisse sélectionnée. Utilisez la vis de mise au point fine pour voir une image nette. Remontez la platine mécanique pour éviter d’endommager la lame. 6. Avec la vis de mise au point fine, réglez le microscope sur les éléments cellulaires et confirmez que la partie de la goutte épaisse convient bien à un examen de routine : une densité de 15 à 20 leucocytes par champ de la goutte épaisse indique une épaisseur satisfaisante de l’étalement. Les étalements ayant moins de leucocytes par champ nécessiteront un examen plus approfondi. 3DMP–MON–08 : EXAMEN MICROSCOPIQUE DES FROTTIS MINCES ET DES GOUTTES ÉPAISSES POUR L’IDENTIFICATION DE PARASITES DU PALUDISME SCHÉMA DESCRIPTION DE L’ACTIVITÉ 7. Commencez par examiner le champ situé dans la partie supérieure gauche de l’étalement, puis déplacez la lame sur la droite, champ par champ. 8. Lorsque vous parvenez à l’autre extrémité de la lame, déplacez la lame vers le bas, puis sur la gauche, champ par champ, et ainsi de suite. 7. Soyez systématique dans votre examen de la lame. Commencez par la partie supérieure gauche de l’étalement (indiqué à l’aide d’une flèche verticale verte sur la Figure 1) et commencez à la périphérie du champ, avant de déplacez la lame sur la droite, champ par champ, dans un mouvement horizontal. 8. Lorsque vous parvenez à l’autre extrémité de la lame, déplacez la lame légèrement vers le bas, puis sur la gauche, champ par champ, et ainsi de suite (voir ci-dessous). Pour un examen efficace, réglez en permanence la mise au point fine pour l’examen de chaque champ. Figure 1. Examen microscopique d’une goutte épaisse (légendes : goutte épaisse ; champ avec l’huile à immersion) 4DMP–MON–08 : EXAMEN MICROSCOPIQUE DES FROTTIS MINCES ET DES GOUTTES ÉPAISSES POUR L’IDENTIFICATION DE PARASITES DU PALUDISME SCHÉMA DESCRIPTION DE L’ACTIVITÉ 4.2. Déterminer si une goutte épaisse contient des parasites du paludisme et identifier les espèces. 1. Examinez la goutte épaisse sous l’objectif à immersion, champ par champ, horizontalement ou verticalement. 2. Examinez au minimum 100 champs avant de déclarer qu’une lame est négative. 3. Si l’on observe des parasites, il est recommandé d’examiner 100 champs de plus pour augmenter les chances d’identifier des infections mixtes. 4. Le frottis mince devrait toujours être examiné pour confirmer l’espèce de parasite trouvée. 5. Déterminez toutes les espèces et tous les stades, et enregistrez vos observations. 4.2. Déterminer si une goutte épaisse contient des parasites du paludisme et identifier les espèces. 1. Continuez à examiner la lame pour 100 champs à fort grossissement ou à l’objectif à immersion. Déplacez l’étalement d’un champ à fort grossissement à chaque fois, comme illustré sur la Figure 1. Utilisez la vis de mise au point fine pour avoir une image nette. 2. Examinez au minimum 100 champs à fort grossissement avant de déclarer qu’une goutte épaisse est négative. Dans la mesure du possible, l’étalement devrait être examiné dans son entier. 3. Si l’on observe des parasites, 100 champs supplémentaires doivent être examinés avant d’identifier formellement l’espèce, en veillant à ne pas passer à côté d’une éventuelle infection mixte. 4. Le frottis mince devrait toujours être examiné pour confirmer l’espèce de parasite trouvée de façon définitive. Le frottis, contrairement à la goutte épaisse, permet de visualiser la morphologie des parasites et des globules rouges. Examinez soit la partie de la lame où l’étalement ressemble à une plume, soit le bord du frottis mince, tel que l’explique ci-dessous la procédure 4.3. 5. Identifiez et enregistrez toutes les espèces et les stades observés dans le registre dédié aux examens microscopiques du paludisme. Voir DMP-MON 6b : Enregistrement et notification des résultats de l’examen microscopique. Note : Veuillez-vous référer aux planches de l’OMS pour le diagnostic du paludisme afin d’identifier chaque espèce. 5DMP–MON–08 : EXAMEN MICROSCOPIQUE DES FROTTIS MINCES ET DES GOUTTES ÉPAISSES POUR L’IDENTIFICATION DE PARASITES DU PALUDISME SCHÉMA DESCRIPTION DE L’ACTIVITÉ 4.3. Examen du frottis mince pour confirmer l’espèce et les infections mixtes 1. Le frottis doit être examiné pour confirmer l’espèce et les infections mixtes. 2. Déposez une goutte d’huile à immersion sur l’extrémité en forme de plume de l’étalement. 3. Passez de l’objectif 10x à l’objectif à immersion 100x et faites la mise au point sur le frottis mince. 4. Observez l’extrémité mince ou en forme de plume de l’étalement, en passant d’un champ à l’autre, horizontalement ou verticalement. 5. Étudiez l’étalement jusqu’à ce que toutes les espèces soient confirmées. 4.3. Examen du frottis mince pour confirmer l’espèce et les infections mixtes 1. Pour confirmer une espèce parasitaire ou des infections mixtes après avoir examiné la goutte épaisse, examinez le frottis mince. 2. Déposez une goutte d’huile à immersion sur l’extrémité en forme de plume de l’étalement. 3. Passez de l’objectif 10x à l’objectif à immersion 100x. 4. Observez l’extrémité en forme de plume de l’étalement, ou l’extrémité où les globules rouges sont côte à côte et se chevauchent le moins possible. Examinez le frottis en suivant le cheminement indiqué dans la Figure 2, en vous déplaçant le long du bord du frottis, puis d’un champ vers l’intérieur avant de revenir latéralement, et ainsi de suite. Figure 2. Examen microscopique d’un frottis mince 5. Examinez le frottis mince jusqu’à pouvoir confirmer la présence et l’espèce des parasites du paludisme. Identifiez et enregistrez toutes les espèces et les stades observés dans le registre dédié aux examens microscopiques du paludisme. Voir DMP-MON-06b : Enregistrement et notification des résultats de l’examen microscopique. Veuillez vous référer aux planches de l’OMS pour le diagnostic du paludisme afin d’identifier chaque espèce. 6DMP–MON–08 : EXAMEN MICROSCOPIQUE DES FROTTIS MINCES ET DES GOUTTES ÉPAISSES POUR L’IDENTIFICATION DE PARASITES DU PALUDISME 5. REMARQUES Vous pouvez compter les parasites sur un frottis mince lorsqu’il n’y a pas de goutte épaisse ou lorsque cette dernière est mal colorée ou abîmée. De plus, lorsque la densité parasitaire est > à 100 parasites pour chaque champ à l’objectif à immersion de la goutte épaisse, la parasitémie devrait être calculée en observant le frottis mince. (Voir DMP-MON-09 : Numération des parasites). 6. FORMULAIRES ET DOCUMENTS • Un formulaire de notification des résultats (peut varier d’un laboratoire à l’autre). • Un registre pour les examens microscopiques des étalements à la recherche du paludisme (peut varier d’un laboratoire à l’autre). 7. RÉFÉRENCES OMS. Planches pour le diagnostic microscopique du paludisme. Genève, 2010. OMS. Planches pour l’identification des filaires. Genève, 1997. WHO. Bench aids for the morphological diagnosis of anaemia. Geneva; 2001. OMS. QA manual for malaria microscopy, 2nd Edition. Genève, 2015. OMS. Techniques de base pour le diagnostic microscopique du paludisme. Partie I : Guide du stagiaire. Deuxième édition. Genève, 2010 WHO. National malaria slide bank standard operating procedures. Geneva; 2015 (en cours). 8. HISTORIQUE DU DOCUMENT Date (mois/année) Version Commentaires Personne responsable (Nom, prénom) Janvier 2016 1 Examiné et finalisé par des experts, édité et mis en page Gonzales, Glenda Fonctionnaire technique, WPRO WHO/HTM/GMP/MM/SOP/2016.08 © Organisation mondiale de la Santé 2016. Tous droits réservés.