Les cultures cellulaires comme substrats pour la production des vaccins antigrippaux : mémorandum d’une réunion de l’OMS

Memoranda! Memorandums Les cultures cellulaires comme substrats pour la production des vaccins antigrippaux: Memorandum d'une reunion de I'OMS* Avec trois pand6mies en un si6cle, la grippe a constitu6 un important probleme de sant6 publique par- tout dans le monde. La vaccination reste le moyen le plus efficace de lutter contre une pand6mie de grippe. Comme la production rapide de grandes quantit6s de vaccin antigrippal d6pend de I'approvi- sionnement en ceufs de poules embryonn6s sur lesquels on cultive le virus, il est urgent de mettre au point d'autres systemes de culture cellulaire qui permettraient d'augmenter rapidement la production en cas de pand6mie. Au cours de cette r6union de l'OMS, les participants ont examin6 les r6sultats des 6tudes effectu6es par plusieurs laboratoires sur la culture des virus grippaux dans des lign6es cellu- laires stables et ont formul6 des recommandations pour l'avenir. Introduction Ces 100 dernieres annees, trois pandemies et de nombreuses epidemies de grippe ont ete a l'origine d'une morbidite, d'une mortalite et de perturbations sociales considerables. La vaccination reste le moyen le plus efficace de lutter contre la grippe en cas de pandemie comme en periode interpandemique. Cependant, plusieurs caracteristiques du vaccin anti- grippal en font un vaccin different des autres: cer- taines d'entre elles pourraient compromettre la pro- duction de vaccin, en particulier en cas de pandemie. Au cours des periodes interpandemiques, il est necessaire de proceder 'a des evaluations annuelles afin d'actualiser les souches vaccinales constituant le vaccin, car les virus grippaux qui circulent montrent des modifications antigeniques relativement rapides et imprevisibles. Du fait que ce vaccin est actualise * Ce memorandum est tire du rapport d'une consultation infor- melle de l'OMS sur les cultures cellulaires comme substrats pour la production des vaccins antigrippaux, qui s'est tenue a Geneve le 16 fWrier 1995. Ont participe a cette reunion: N. Cox, Atlanta, GA, Etats-Unis d'Am6rique; C. Hannoun, Paris, France; A. Hay, Londres, Angleterre; N.V. Kaverin, Moscou, F6deration de Russie; E.D. Kilbourne, Valhalla, NY, Etats-Unis d'Am6rique; G. Schild, Potters Bar, Angleterre; et J. Wood, Pot- ters Bar, Angleterre. Secr6tariat OMS: Y. Ghendon, V. Grachev, E. Griffiths et L.J. Martinez. L'original anglais de cet article est paru dans le Bulletin de l'Organisation mondiale de la Sante, 1995, 73(4): 431-435. Tires a part: Programme de Lutte contre les Maladies bacteriennes et virales et d'Immunologie, Division des Maladies transmissibles, Organisation mondiale de la Sante, 1211 Geneve 27, Suisse. Tire a part No 5655 chaque annee et que l'immunite qu'il induit est de courte duree, il est recommande de revacciner chaque annee les sujets qui presentent un risque aug- mente de complications graves de la grippe. Dans certains pays, bon nombre de personnes sont dans ce cas et les firmes qui commercialisent le vaccin doi- vent donc fabriquer rapidement de grandes quantites de doses vaccinales en prevision de 1'extension sai- sonniere de la grippe, doses qui doivent etre adminis- trees environ 2 a 3 mois avant que ne debute la sai- son. A 1'heure actuelle, les vaccins antigrippaux sont produits sur oeufs de poule embryonnes et l'on ne peut obtenir des lots importants d'ceufs de bonne qualite qu'en planifiant la chose soigneusement a l'avance, c'est-a-dire pres d'un an avant l'utilisation des vaccins. Malheureusement, les elevages de pou- lets qui produisent ces oeufs sont exposes aux mala- dies et aux catastrophes naturelles et l'approvision- nement est donc incertain, meme entre les pandemies. En cas de pandemie de grippe, un approvision- nement en oeufs de poule feconds de bonne qualite serait necessaire a tout programme de prevention et de lutte realiste. Toutefois, comme les souches du virus grippal 'a l'origine d'une pandemie peuvent apparaitre et se repandre a tout moment, devancant meme le calendrier normal de la production de vac- cin, il est possible qu'on ne dispose pas facilement des quantites d'oeufs necessaires pour produire un vaccin donne. En outre, il est probable qu'il s'ecou- lera peu de temps entre l'identification initiale de la nouvelle souche a l'origine de la pandemie et le moment ou un grand nombre de doses de vaccin seront necessaires dans de nombreux pays du monde, Bulletin de l'Organisation mondiale de la Sante, 1995, 73 (6): 749-753 © Organisation mondiale de la Sante 1995 749 Memorandum delai qui sera probablement trop court pour qu'on puisse obtenir suffisamment d'aeufs pour repondre a la demande. Ainsi, il est urgent de mettre au point d'autres systemes de culture cellulaire pour la production du vaccin antigrippal, systemes qui contrairement aux oeufs de poule embryonnes, ne necessiteraient pas de planifier un an 'a l'avance la production et ne seraient pas sous la dependance des maladies aviaires. Ces systemes presenteraient un avantage tres net en cas de pandemie, car ils permettraient plus de souplesse dans la mise en route et dans l'augmentation de la production de vaccin dans des delais tres courts. Ces systemes de culture cellulaire presenteraient egale- ment des avantages pendant les periodes interpande- miques, car ils permettraient, au cas oiu l'on decele- rait de nouveaux variants apres avoir choisi la souche vaccinale, de produire un vaccin complemen- taire, tout en etant mieux adaptes aux virus circulants puisque les modifications de l'hemagglutinine induites par les ceufs embryonnes n'auraient pas lieu. L'objectif principal de cette consultation etait d'examiner les possibilites d'utiliser des cultures cel- lulaires comme substrats pour la production des vac- cins antigrippaux et d'analyser les resultats de plu- sieurs laboratoires ayant cultive les virus grippaux sur des lignees cellulaires stables. Rendement des cultures virales Les ceufs de poule embryonnes sont traditionnelle- ment consideres comme etant le systeme de choix pour la production en grandes quantites des virus grippaux humains. Les rendements des cultures virales dans les cellules tapissant la cavite allantof- dienne sont plus eleves que dans les cultures mono- couches de cellules sensibles (y compris les cellules MDCK) si on les calcule par unite de volume, 'a savoir en UFP/ml ou en UHA. Cependant, si l'on calcule les rendements par cellule (UFP/cellule ou UHA/cellule), les rendements dans les liquides de culture sont du meme ordre que ceux obtenus avec les ceufs de poule embryonnes. La diminution du volume du liquide de culture par cellule pourrait donc augmenter le rendement par unite de volume, en culture cellulaire. Toutefois, la principale glycoproteine du virus grippal, l'hemag- glutinine (HA), doit subir un clivage prot6olytique pour devenir fonctionnelle. Cette hemagglutinine des virus grippaux humains ne peut etre clivee par les proteases intracellulaires en cours de traitement. I1 est donc imperatif de disposer d'une trypsine ou d'une enzyme de type trypsique dans le liquide de culture pour qu'il y ait clivage extracellulaire de l'hemagglutinine. Kaverin et Webster ont recemment decouvert que la replication du virus grippal dans plusieurs lignees cellulaires continues est genee par l'inactiva- tion rapide de la trypsine dans les liquides de culture (1). Le degre d'accumulation de l'inhibiteur tryp- sique varie selon les cultures. Dans les cellules Madin-Darby de reins de chiens (MDCK) il est faible et n'empeche pas les cycles de croissance du virus grippal dans les conditions normales. L'accu- mulation de cet inhibiteur est inversement pro- portionnelle au volume de liquide de culture par cel- lule et gene le clivage extracellulaire de l'hemagglu- tinine, tout en supprimant la possibilite d'avoir de nombreux cycles de croissance du virus grippal. Cet inhibiteur trypsique n'a pas ete caracterise. Les resultats obtenus par le groupe du Profes- seur Klenk au cours de son etude de la reproduction du virus A/WSN/33 en cellules MDBK (2) indiquent qu'il pourrait etre possible d'obtenir de nombreux cycles de croissance du virus grippal humain sans employer les proteases. Les virus produits dans ces systemes contiennent de l'hemagglutinine non cli- vee; cependant, on obtient de nombreux cycles de reproduction virale sans trypsine parce que le clivage intervient au moment de 1'entree du virus dans l'endosome. Ces etudes (Kaverin & Klenk, non pu- bliees) laissent 'a penser que dans certaines sous- lignees de cellules MDCK ce mecanisme peut etre mis en oeuvre sur toute une serie de souches de virus grippal humain. Les donnees presentees laissent 'a penser qu'on peut obtenir de nombreux cycles de replication des virus grippaux humains en culture cellulaire sans avoir recours 'a des proteases extracel- lulaires. L'utilisation de lignees cellulaires capables de realiser un "clivage d'entree" est a cet egard pro- metteuse. Un autre participant, le Dr A. Hay, s'est interes- se aux genes et aux proteines des virus grippaux pou- vant etre a l'origine d'un fort rendement des cultures cellulaires en virus grippal. Les virus grippaux mon- trent des differences marquees dans leur aptitude a se repliquer dans les ceufs de poule embryonnes ou en culture cellulaire. Ce phenomene est en partie du^ aux proprietes des elements de surface de l'hemagglutini- ne (HA) et de la neuraminidase (NA) et l'on connait de nombreux exemples de selection de mutations au niveau de l'hemagglutinine des isolements de virus grippaux humains adaptes a la croissance dans differents environnements cellulaires, en particulier dans les oeufs de poule, qui peuvent modifier l'anti- genicite (3). Comme il est important que les proprie- tes antigeniques des souches vaccinales ne different pas trop de celles de l'isolement viral d'origine, I'attention s'est portee sur les autres facteurs gene- tiques qui influent sur le rendement en virus reas- sortis. WHO Bulletin OMS. Vol 73 1995750 Les cultures cellulaires comme substrats pour la production des vaccins antigrippaux Les etudes sur les virus reassortis des virus grip- paux A a forte croissance ont montre que l'associa- tion de plusieurs genes de la souche mere A/PR/8134 permet d'obtenir la meilleure croissance. La nucleo- proteine (NP) et la polymerase, telle que la PB2, sont importantes car elles determinent l'eventail des hotes et l'aptitude des virus 'a pousser dans des cellules aviaires ou de primates. Un travail poursuivi durant de nombreuses annees a permis de mettre en eviden- ce l'importance du gene M (4). Des experiences recentes sur des genes M chimeres ont permis de montrer que la proteine matricielle (Ml) de la souche WSN est responsable de la forte croissance des virus reassortis avec la souche A/Aichi/68 dans les ceufs embryonnes comme dans les cellules MDCK (5). Par ailleurs, on a montre que le second produit du gene M, a savoir la proteine M2, joue un role important au niveau des caracteristiques de croissance des virus grippaux aviaires virulents dans les cellules MDCK, ce qui souligne l'importance de la complementarite entre la proteine M2 et l'hemag- glutinine. En outre, divers facteurs cellulaires, encore obscurs, influent sur la replication virale, en particu- lier au niveau de la replication de l'ARNv et de l'epissage des ARNm M et NS. Un des sujets d'etude du laboratoire du Dr Webster est la recherche des bases immunologiques des differences observees dans l'immunogenicite des variants selectionnes dans les cultures sur ceufs embryonnes et differant par la modification d'un seul acide amine de l'hemagglutinine. Les substitutions d'un seul acide amine au niveau du residu 156 (Glu- Lys) de l'hemagglutinine des virus grippaux H3N2 ont rendu ceux-ci moins immunogenes chez la souris Balb/c que les virus presentant une modification au niveau du residu 186 (Ser-Ile) recoltes sur MDCK et provenant du meme echantillon clinique. Le variant 156 Lys HA n'a pas induit d'immunite protectrice chez la souris et les cellules productrices d'anticorps dans la rate ont montre une distribution isotypique (IgM) differente de celle des souris immunisees avec le variant 186 (Ihe), lequel a induit la production d'IgG au niveau des ganglions lymphatiques drainant le poumon. Dans son rapport, le Dr Webster a developpe un autre sujet, a savoir l'utilisation des cellules Vero pour la replication des virus humains. On s'est aper- qu que ces cellules Vero pouvaient permettre l'isole- ment primaire et la replication des virus grippaux humains A et B, pour autant qu'on ajoute de la tryp- sine 'a intervalles reguliers apres inoculation. Cette mise en culture des virus grippaux dans des lignees de cellules Vero n'a pas entraine de modification antigenique ni sequentielle de l'hemagglutinine et les rendements de ces cultures (mg de proteine) sont comparables 'a ceux des cellules MDCK. Un autre participant, le Dr Hannoun, a presente les donnees d'etudes qui ont et6 menees a l'Institut Pasteur de Paris, et qui visaient 'a tester plusieurs lignees cellulaires et 'a evaluer leur potentiel pour la production du virus grippal humain destine a la pre- paration de vaccins; des lignees cellulaires BHK (hamster), Vero (singe) et MDCK (chien) ont ete etudiees. Les experiences preliminaires visant 'a tes- ter les milieux et conditions de culture ont et effec- tuees dans des flacons en plastique fixes, et ont ete suivies par des cultures en agitation faisant appel 'a diff6rents types de microtransporteurs pour la com- paraison. Enfin, des systemes de biogenerateurs ont et e'tudies dans des volumes plus importants avec un flux continu de milieu frais et une regulation du pH. On a ajoute de la trypsine au milieu en phase de pro- duction. Les cultures de cellules Vero dans des fla- cons de Roux ou des flacons en agitation ont revele que l'ensemble du processus (biomasse et production virale) devait se faire dans du milieu exempt de serum (MDSS2) (6), de facon a obtenir une produc- tion virale rapide a haut rendement (titres de HA de 256 a 512/ml au bout de 7 jours). L'utilisation d'un milieu special, le MDSS2, uniquement pendant la phase de production virale apres que la biomasse ait ete produite dans du milieu contenant du serum, s'est traduite par des rendements plutot faibles (titres de HA de 0 'a 128/ml au bout de 7 jours). Comme les titres n'ont pas depasse 128-512 uni- tes d'HA/ml et qu'un laps de temps important s'est ecoule entre l'inoculation virale et la production de virus en cellules Vero, on a test6 les cellules MDCK, generalement employees pour isoler de nouvelles souches virales. Apres modification du milieu exempt de serum, on a obtenu une production virale rapide et a fort rendement dans les cultures de cellules MDCK en biogenerateur. Les meilleurs rendements ont et obtenus avec les cellules MDCK qui avaient subi plusieurs passages sans serum. Le virus de semence etait soit du mat6riel ayant subi des pas- sages sur ceuf embryonne, soit une sous-souche adaptee a la culture cellulaire, soit du virus fraiche- ment isole n'ayant subi qu'un ou deux passages en cellules MDCK. On a utilise des virus grippaux de differents types et sous-types avec des resultats sensiblement aussi bons: A(H3N2), A(H3N8) (equin) et B. Les cultures preliminaires en flacons fixes ont montre qu'il etait possible d'obtenir des titres eleves de virus, mesures par la production d'HA (entre 256 et 512 unites d'HA par ml), a l'aide de souches fraichement isolees du type A(H3N2) et B (n'ayant subi qu'un ou deux passages cellulaires 'a partir du prelevement clinique) obtenues au cours de la saison 1994-1995, ainsi qu'en utilisant des virus "adaptes" ayant ete cultives en serie sur des lignees MDCK. WHO Bulletin OMS. Vol 73 1995 751 Memorandum Ainsi, les lignees cellulaires ont pu etre adaptees a la culture en milieu exempt de serum ce qui a per- mis de produire de grandes quantites de virus, mesu- rees par l'hemagglutination; la trypsine est necessai- re a ce type de production. D'autres modifications des conditions de culture, l'optimisation de la com- position du milieu et l'adaptation des virus permet- traient peut-etre d'ameliorer encore les rendements et de repondre ainsi aux exigences de production. Le rapport du Dr Kilboume a ete axe sur le clone 1-5C-4, tire d'une lignee de cellules conjoncti- vales humaines (Sugiura & Kilboume (7)) propagees a l'origine a partir d'une biopsie de conjonctive nor- male (8). Apres avoir ete reanalyse, ce clone a confirme sa sensibilite 'a divers virus grippaux; il est notamment sensible au virus A/NWS/33 et a ses virus reassortis. Comme les cellules MDCK, le clone 1-5C-4 permet la replication des souches recemment isolees des virus grippaux A(H3N2). La comparaison entre les cellules 1-5C-4 et les cellules MDCK a montre que la croissance des nouveaux isolements de virus grippaux etait plus rapide et 1'effet cytopatho- gene plus important dans les cellules MDCK. Par ailleurs, le clone 1-5C-4 montre certains avantages et inconvenients potentiels. Le Dr Kilbourne pense que ce clone merite d'etre etudie plus avant comme sys- teme de culture servant a la production de vaccin, en particulier si l'on peut montrer que le transfert de genes a partir de la souche NWS apparemment pan- trope peut donner des virus reassortis du serotype voulu avec un fort rendement. II a egalement note que le reclonage avec examen des variants clonaux peut etre utile lorsqu'il est associe 'a une concentra- tion optimale de trypsine. En ce qui concerne les possibilites d'ameliorer le rendement en virus humain dans les cultures cellu- laires en general, le Dr Kilbourne a note qu'il faudra probablement disposer de virus donneurs 'a fort ren- dement, qui seront peut-etre specifiques de chaque lignee cellulaire, comme c'est le cas pour le systeme de culture sur oeufs embryonnes. Pour accelerer la selection de variants a fort rendement, il faudra rechercher une correlation entre la taille de la plage et le rendement en virus, quel que soit le systeme. La souche NWS du virus grippal est un virus pantrope que l'on peut envisager de prendre comme virus donneur a fort rendement dans les systemes cellu- laires. I1 faudra egalement envisager d'utiliser le mutant NS1 (inhabituel et cytopathogene) du virus grippal B (9). Le vaccin contre la grippe equine est produit sur des cellules MDCK par les Fort Dodge Laboratories (Mme J.M. Curran). La production de ce vaccin sur embryons de poulet n'etait pas souhaitable pour des questions de puretd, d'activite, d'innocuite, de fiabi- lite et de coult du produit. L'inoculation sur aeufs et la recolte dans le liquide allantoidien sont sujettes 'a des contaminations. I1 est impossible de rechercher dans chaque ceuf la presence de virus exogenes, ce qui augmente le risque de contamination par d'autres germes. On a rencontre une variabilite importante entre lots de vaccins viraux produits sur embryons de poulet. La production en lignee cellulaire continue per- met d'utiliser des matieres premieres et des pools cellulaires testes a l'avance, et de faire appel aux modes operatoires steriles les meilleurs. Les virus recoltes contiennent moins de proteines exogenes et le produit est tres homogene et constant d'un lot 'a l'autre. En ce qui conceme la production du vaccin contre la grippe equine sur lignee cellulaire MDCK, on a utilise la souche recombinante A/Equi-2/Ken- tucky/8 1 (H3N8) a fort rendement et toute la produc- tion a ete realisee dans des systemes de biogenera- teurs avec un milieu defini pour la replication cellulaire. Cette conversion du systeme de produc- tion du vaccin antigrippal a permis de diminuer les coutts, qui ne representent plus que 40% de ceux du systeme sur embryons de poulet, et de multiplier par trois I'activite de l'antigene produit. Les risques de contamination ont ete elimines. Cette methode a per- mis de diminuer de facon sensible le passage de pro- teines exogenes du systeme de production dans le vaccin. La lignee MDCK constitue donc un substrat convenable pour la production de l'antigene grippal equin. Conclusions La production actuelle du vaccin antigrippal homolo- gue repose sur la croissance du virus dans des embryons de poulet. Le fait de se limiter a ce syste- me de culture unique n'est pas souhaitable pour les raisons suivantes. a) L'approvisionnement en ceufs de poule embryon- nes est limite a une periode precise de l'annee. Cela restreint les possibilites de fabrication de ces vaccins qui doivent etre reactualises chaque annee. b) Des virus grippaux pouvant etre 'a l'origine d'une pandemie sont susceptibles d'apparaitre a tout moment et il faut donc qu'on puisse disposer en permanence de systemes de culture virale pou- vant etre mis en route immediatement. c) I1 apparait que les virus grippaux produits sur embryons de poulet peuvent presenter des diffe- rences sur le plan antigdenique par rapport 'a ceux qui sont presents dans les voies respiratoires humai- nes ou dans les cultures de cellules mammaliennes. WHO Bulletin OMS. Vol 73 1995752 Les cultures cellulaires comme substrats pour la production des vaccins antigrippaux Si l'on pouvait adopter des techniques qui ne dependent pas de la production d'ceufs, une produc- tion de masse rapide du vaccin antigrippal serait rea- lisable. La culture du virus grippal sur des lignees cellulaires semble prometteuse et il convient de poursuivre sa mise au point. Actuellement, il existe deux lignees cellulaires qui permettent la replication du virus grippal a des concentrations suffisantes pour pouvoir produire le vaccin. I1 s'agit de cellules de rein de chien Madin-Darby (MDCK) et des cellules de rein de singe vert africain (Vero). Recommandations Les propositions suivantes ont ete faites a l'OMS. 1) Etudier l'etablissement d'une lignee cellulaire MDCK de ref6rence acceptable, comme cela a ete fait pour la lignee cellulaire Vero. 2) Organiser des etudes concertees de facon a: - encourager l'etude et la mise a l'essai d'autres lignees cellulaires pour la replication des virus grippaux; - definir les conditions de croissance optimales pour les lignees cellulaires et les conditions per- mettant des rendements optimaux; - 'tudier le rendement en hemagglutinine des vac- cins antigrippaux experimentaux obtenus sur des lignees MDCK, Vero et autres, y compris dans les isolements ayant subi peu de passages en cul- ture cellulaire, mais egalement les virus ayant un fort potentiel de croissance et pouvant etre utili- ses comme souches meres reassorties; - analyser la stabilite genetique et antigenique des vaccins antigrippaux experimentaux produits en lignees cellulaires; - a l'aide d'etudes effectuees chez l'animal et chez l'homme, analyser l'innocuite et l'immunogeni- cite des vaccins antigrippaux prepares a partir de cultures cellulaires. 3) Mettre en place des consultations entre autorites de reglementation nationales et intemationales de facon a: - examiner les normes specifiques applicables 'a la culture du virus grippal dans des lignees MDCK, Vero et autres; - explorer les possibilites d'obtenir des isolements ayant pousse en culture cellulaire et qui convien- nent 'a la production de vaccins; - envisager la necessite de reactifs specifiques en vue de la standardisation des vaccins. 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