Método oficial de la TobLabNet de la OMS PON 12 Procedimiento oPerativo normalizado Para determinar el contenido de nicotina en los Productos de tabaco sin Humo Unidad Antitabaco (Iniciativa «Liberarse del Tabaco») Red de Laboratorios del Tabaco de la OMS (TobLabNet)
PON 12 de la Red de Laboratorios del Tabaco de la Organizacion Mundial de la Salud Procedimiento operativo normalizado para determinar el contenido de nicotina en productos de tabaco sin humo i I n i c i a t i v a « L i b e r a r s e d e l T a b a c o » — R e d d e L a b o r a t o r i o s d e l T a b a c o ( T o b L a b N e t ) Método oficial de la TobLabNet de la OMS PON 12 Procedimiento operativo normalizado para determinar el contenido de nicotina en los productos de tabaco sin humo ii PON 12 de la Red de Laboratorios del Tabaco de la Organizacion Mundial de la Salud Procedimiento operativo normalizado para determinar el contenido de nicotina en productos de tabaco sin humo I n i c i a t i v a « L i b e r a r s e d e l T a b a c o » — R e d d e L a b o r a t o r i o s d e l T a b a c o ( T o b L a b N e t ) Procedimiento operativo normalizado para determinar el contenido de nicotina en los productos de tabaco sin humo. Método oficial de la TobLabNet de la OMS, PON12 [Standard operating procedure for determination of nicotine content in smokeless tobacco products. WHO TobLabNet Official Method SOP12] ISBN 978-92-4-006572-7 (versión electrónica) ISBN 978-92-4-006573-4 (versión impresa) © Organización Mundial de la Salud 2022 Algunos derechos reservados. Esta obra está disponible en virtud de la licencia 3.0 OIG Reconocimiento- NoComercial-CompartirIgual de Creative Commons (CC BY-NC-SA 3.0 IGO; https://creativecommons.org/licenses/ by-nc-sa/3.0/igo). Con arreglo a las condiciones de la licencia, se permite copiar, redistribuir y adaptar la obra para fines no comerciales, siempre que se cite correctamente, como se indica a continuación. En ningún uso que se haga de esta obra debe darse a entender que la OMS refrenda una organización, productos o servicios específicos. No está permitido utilizar el logotipo de la OMS. 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Método oficial de la TobLabNet de la OMS, PON12 [Standard operating procedure for determination of nicotine content in smokeless tobacco products. WHO TobLabNet Official Method SOP12]. Ginebra: Organización Mundial de la Salud; 2022. Licencia: CC BY-NC-SA 3.0 IGO. Catalogación (CIP). Puede consultarse en http://apps.who.int/iris. Ventas, derechos y licencias. Para comprar publicaciones de la OMS, véase http://apps.who.int/bookorders. Para presentar solicitudes de uso comercial y consultas sobre derechos y licencias, véase https://www.who.int/es/ copyright. Materiales de terceros. Si se desea reutilizar material contenido en esta obra que sea propiedad de terceros, por ejemplo cuadros, figuras o imágenes, corresponde al usuario determinar si se necesita autorización para tal reutilización y obtener la autorización del titular del derecho de autor. 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La OMS ha adoptado todas las precauciones razonables para verificar la información que figura en la presente publicación, no obstante lo cual, el material publicado se distribuye sin garantía de ningún tipo, ni explícita ni implícita. El lector es responsable de la interpretación y el uso que haga de ese material, y en ningún caso la OMS podrá ser considerada responsable de daño alguno causado por su utilización. PON 12 de la Red de Laboratorios del Tabaco de la Organizacion Mundial de la Salud Procedimiento operativo normalizado para determinar el contenido de nicotina en productos de tabaco sin humo iii I n i c i a t i v a « L i b e r a r s e d e l T a b a c o » — R e d d e L a b o r a t o r i o s d e l T a b a c o ( T o b L a b N e t ) N.º: PON 12 Fecha: diciembre de 2021 Red de Laboratorios del Tabaco de la Organización Mundial de la Salud Procedimiento operativo normalizado para determinar el contenido de nicotina en los productos de tabaco sin humo Método: Determinación del contenido de nicotina en los productos de tabaco sin humo Analitos: Nicotina (3-[(2S)-1-metilpirrolitina-2-il]piridina) (n.º CAS 54-11-5) Matriz: Productos de tabaco sin humo Última actualización: Diciembre de 2021 iv PON 12 de la Red de Laboratorios del Tabaco de la Organizacion Mundial de la Salud Procedimiento operativo normalizado para determinar el contenido de nicotina en productos de tabaco sin humo I n i c i a t i v a « L i b e r a r s e d e l T a b a c o » — R e d d e L a b o r a t o r i o s d e l T a b a c o ( T o b L a b N e t ) PON 12 de la Red de Laboratorios del Tabaco de la Organizacion Mundial de la Salud Procedimiento operativo normalizado para determinar el contenido de nicotina en productos de tabaco sin humo 1 I n i c i a t i v a « L i b e r a r s e d e l T a b a c o » — R e d d e L a b o r a t o r i o s d e l T a b a c o ( T o b L a b N e t ) N.º: PON 12 Fecha: diciembre de 2021 PREFACIO Los productos de tabaco sin humo atraen cada vez más el interés de los organismos de salud pública. La Conferencia de las Partes en el Convenio Marco de la OMS para el Control del Tabaco (CMCT de la OMS) formuló una solicitud en su quinta reunión (Seúl, 2012) para identificar opciones para regular los productos químicos en los productos de tabaco sin humo. Este documento se prepara en respuesta a la solicitud formulada por la Conferencia de las Partes en su séptima reunión (Delhi, 2016) a la Secretaría del CMCT de la OMS de invitar a la OMS a finalizar los procedimientos operativos normalizados (PON) para medir la nicotina y las nitrosaminas específicas del tabaco, de conformidad con el apartado 2 b) ii) de la decisión FCTC/COP6(12). En cumplimiento de esta solicitud, la OMS organizó un estudio de colaboración en el que participaron sus laboratorios de ensayo de la Red de Laboratorios del Tabaco (TobLabNet), que analizaron materiales para los que se disponía de cierta caracterización química, representaban una serie de formas comunes de productos de tabaco sin humo y diferían en sus propiedades físicas y químicas. En este PON se presentan la evaluación de la aplicabilidad y la adaptabilidad de los PON validados de la OMS a los productos de tabaco sin humo y los métodos recomendados. Este documento fue preparado por miembros de la TobLabNet de la OMS como PON del método analítico para medir la nicotina en los productos de tabaco sin humo. INTRODUCCIÓN Con el fin de establecer mediciones comparables para analizar los productos de tabaco a nivel mundial, se requieren métodos de consenso que permitan medir parámetros específicos. La TobLabNet de la OMS revisó los procedimientos de uso común para la determinación de la nicotina en los productos de tabaco sin humo con el fin de preparar un procedimiento para un PON de la TobLabNet de la OMS. Este PON fue adaptado del PON 04 [2.1] de la TobLabNet de la OMS para describir el procedimiento para la determinación de la nicotina en los productos de tabaco sin humo. 1. ÁMBITO DE APLICACIÓN Este método es adecuado para la determinación cuantitativa de la nicotina en productos de tabaco sin humo mediante cromatografía de gases (GC) - detección de ionización de llama. 2. REFERENCIAS 2.1 Organización Mundial de la Salud. Procedimiento operativo normalizado para la determinación del contenido de nicotina en el relleno de tabaco de los 2 PON 12 de la Red de Laboratorios del Tabaco de la Organizacion Mundial de la Salud Procedimiento operativo normalizado para determinar el contenido de nicotina en productos de tabaco sin humo I n i c i a t i v a « L i b e r a r s e d e l T a b a c o » — R e d d e L a b o r a t o r i o s d e l T a b a c o ( T o b L a b N e t ) cigarrillos. Ginebra, Red de Laboratorios del Tabaco, 2017 (PON 04 de la TobLabNet de la OMS). 2.2 Oficina de las Naciones Unidas contra la Droga y el Delito. Directrices sobre el muestreo representativo de fármacos. Viena, Sección de Laboratorio y Ciencia, 2009 (https://digitallibrary.un.org/record/676250?ln=es). 2.3 Organización Mundial de la Salud. Procedimiento operativo normalizado para la validación de métodos analíticos de contenidos y emisiones de productos del tabaco. Ginebra, Red de Laboratorios del Tabaco, 2017 (PON 02 de la TobLabNet de la OMS). 2.4 ISO 5725-1: Exactitud (veracidad y precisión) de los métodos y resultados de medición – Parte 1: Principios generales y definiciones. 2.5 ISO 5725-2: Exactitud (veracidad y precisión) de los métodos y resultados de medición – Parte 2: Método básico para la determinación de la repetibilidad y reproducibilidad de un método de medición estándar. 3 TÉRMINOS Y DEFINICIONES 3.1 Contenido de nicotina: cantidad total de nicotina en los productos de tabaco sin humo, expresada en miligramos por gramo de peso seco. 3.2 Tabaco sin humo: parte de un producto de tabaco sin humo que contiene el tabaco. 3.3 Productos de tabaco sin humo: productos elaborados total o parcialmente con tabaco en hoja como materia prima que se fabrican para ser succionados, masticados o utilizados como rapé (artículo 1 f), del CMCT de la OMS), incluido el snus (seco y húmedo), el tabaco de mascar o una mezcla de material originario de una planta de tabaco. 3.4 Muestra de laboratorio: muestra destinada a ser analizada en un laboratorio que consiste en un solo tipo de producto entregado al laboratorio de una vez o en un periodo específico. 3.5 Muestra de prueba: producto que se va a analizar, tomado al azar de la muestra de laboratorio. El número de productos tomados será representativo de la muestra de laboratorio. 3.6 Porción de prueba: porción aleatoria de la muestra de prueba que se utilizará para una sola determinación. El número de productos tomados será representativo de la muestra de laboratorio. 4. RESUMEN DEL MÉTODO 4.1 La nicotina se extrae del tabaco sin humo con una mezcla de n-hexano, solución de hidróxido de sodio y agua. 4.2 La capa orgánica se analiza por CG con un detector de ionización de llama. PON 12 de la Red de Laboratorios del Tabaco de la Organizacion Mundial de la Salud Procedimiento operativo normalizado para determinar el contenido de nicotina en productos de tabaco sin humo 3 I n i c i a t i v a « L i b e r a r s e d e l T a b a c o » — R e d d e L a b o r a t o r i o s d e l T a b a c o ( T o b L a b N e t ) 4.3 La relación entre el área del pico de nicotina y el estándar interno se compara en una curva de calibración creada por el análisis de modelos con concentraciones conocidas de nicotina para determinar el contenido de nicotina de cada porción de prueba. 5. PRECAUCIONES PARA LA SEGURIDAD Y EL MEDIO AMBIENTE 5.1 Tome precauciones rutinarias de seguridad y ambientales, como en cualquier actividad química de laboratorio. 5.2 El análisis y la evaluación de ciertos productos con este método de análisis puede requerir el uso de materiales o equipos que podrían ser peligrosos o dañinos para el medio ambiente; este documento no pretende abordar todos los aspectos de seguridad asociados a su uso. Todas las personas que utilizan este método tienen la responsabilidad de consultar a las autoridades competentes y establecer prácticas de salud y seguridad, así como precauciones ambientales junto con cualquier requisito reglamentario aplicable existente antes de su uso. 5.3 Se debe tener especial cuidado para evitar la inhalación o la exposición dérmica a productos químicos nocivos. Use una campana de extracción de humos químicos y lleve una bata de laboratorio, guantes y gafas de seguridad adecuados cuando prepare o manipule materiales sin diluir, soluciones estándar, soluciones de extracción o muestras recolectadas. 6. INSTRUMENTAL Y EQUIPAMIENTO Instrumental de laboratorio habitual, en concreto: 6.1 Recipientes de extracción: matraces Erlenmeyer (100 ml) con tapones, botellas Pyrex de 100 ml con sellos y septos engarzados, tubos de cultivo de 100 ml con tapones forrados de teflón u otros matraces adecuados. 6.2 Agitador (de tipo lineal) configurado para mantener los recipientes de extracción en posición. 6.3 CG capilar equipado con un detector de ionización de llama. 6.4 Columna de CG capilar capaz de separar claramente los picos para el disolvente, la solución estándar interna, la nicotina y otros componentes del tabaco (por ejemplo, Varian WCOT Fused Silica, 25 m × 0,25 mm ID; recubrimiento: CP-WAX 51). 6.5 Baño de ultrasonidos. 7. REACTIVOS Y SUMINISTROS Todos los reactivos deberán tener al menos un grado de reactivo analítico, a menos que se indique lo contrario. Cuando es posible, los reactivos se identifican mediante sus números de registro del Chemical Abstract Service (CAS). 4 PON 12 de la Red de Laboratorios del Tabaco de la Organizacion Mundial de la Salud Procedimiento operativo normalizado para determinar el contenido de nicotina en productos de tabaco sin humo I n i c i a t i v a « L i b e r a r s e d e l T a b a c o » — R e d d e L a b o r a t o r i o s d e l T a b a c o ( T o b L a b N e t ) 7.1 Gas portador: helio [7440-59-7] de alta pureza (>99,999%). 7.2 Gases auxiliares: aire e hidrógeno [1333-74-0] de alta pureza (>99,999%) para el detector de ionización de llama. 7.3 n-hexano [110-54-3], grado GC, con un contenido máximo de agua de 1,0 g/l. 7.4 –(–)nicotina [54-11-5] de pureza conocida no inferior al 98%. Se puede usar salicilato de nicotina [29790-52-1] de pureza conocida no inferior al 98%. 7.5 Hidróxido de sodio [1310-73-2] en gránulos. 7.6 Solución estándar interna: n-heptadecano (pureza > 98% de la fracción de masa) [629-78-7]. Se puede utilizar quinaldina [91-63-4], isoquinolina [119-65-3], quinolina [91-22-5] u otras alternativas adecuadas. 8. PREPARACIÓN DEL MATERIAL DE VIDRIO 8.1 Limpie y seque los utensilios de vidrio de manera que se evite la contaminación. 9. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES 9.1 Solución de hidróxido de sodio (2 mol/l) 9.1.1 Pese aproximadamente 80 g de hidróxido de sodio. 9.1.2 Disuelva el hidróxido de sodio medido en agua y dilúyalo con agua hasta obtener un volumen final de 1 l. 9.2 Solución de extracción (0,5 mg/ml) 9.2.1 Pese aproximadamente 0,5 g (con una precisión de 0,001 g) de n-heptadecano o una solución estándar interna alternativa. 9.2.2 Disuelva el n-heptadecano medido o el estándar interno alternativo en n-hexano, y dilúyalo con n-hexano hasta obtener un volumen de 1 l. 10. PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES ESTÁNDAR El método para preparar las soluciones estándar que se describen a continuación es solo de referencia y se puede ajustar si es necesario. 10.1 Solución madre estándar de nicotina (2 g/l) 10.1.1 Pese aproximadamente 200 mg de nicotina o 370 mg de salicilato de nicotina con una precisión de 0,0001 g en un matraz Erlenmeyer de 200 ml (o 250 ml). 10.1.2 Disuelva la nicotina medida en 50 ml de agua. 10.1.3 Pipetee 100 ml de solución de extracción (9.2.2) y añada 25 ml de solución de hidróxido de sodio de 2 mol/l. PON 12 de la Red de Laboratorios del Tabaco de la Organizacion Mundial de la Salud Procedimiento operativo normalizado para determinar el contenido de nicotina en productos de tabaco sin humo 5 I n i c i a t i v a « L i b e r a r s e d e l T a b a c o » — R e d d e L a b o r a t o r i o s d e l T a b a c o ( T o b L a b N e t ) 10.1.4 Agite la mezcla bifásica obtenida vigorosamente durante 60 ± 2 min en un agitador. Es importante mezclar bien las fases. 10.1.5 Extraiga la fase orgánica sobrenadante para la preparación de la solución estándar. Si es necesario, guarde esta solución, protegida de la luz, a 4-8 °C. 10.2 Solución estándar de nicotina 10.2.1 Prepare las soluciones de calibración utilizando la solución madre estándar preparada en 10.1.4, de acuerdo con el esquema que se proporciona en el cuadro 1. 10.2.2 Llene los matraces aforados hasta la marca con una solución de extracción (9.2.2). 10.2.3 Las soluciones estándar pueden almacenarse a 4-8 °C, protegidas de la luz. 10.2.4 Determine las concentraciones finales de nicotina en las soluciones estándar a partir de: Concentración final (mg/l) = Donde x es el peso original (en mg) de nicotina tal como se pesó en 10.1.1, e y es el volumen de la solución estándar madre tal como se pipeteó en 10.2.1. En el cuadro 1 se muestran las concentraciones finales de nicotina en las soluciones estándar. x * y * 1000 100 * 20 6 PON 12 de la Red de Laboratorios del Tabaco de la Organizacion Mundial de la Salud Procedimiento operativo normalizado para determinar el contenido de nicotina en productos de tabaco sin humo I n i c i a t i v a « L i b e r a r s e d e l T a b a c o » — R e d d e L a b o r a t o r i o s d e l T a b a c o ( T o b L a b N e t ) Cuadro 1. Concentraciones de nicotina en soluciones estándar Estándar Volumen de solución estándar de nicotina (2 g/l) (ml) (y) Volumen de solución estándar interna (μl) Volumen total (ml) Concentración de nicotina en la solución mixta final (mg/l) Nivel aproximado equivalente a niveles desconocidos en el tabaco sin humo (mg/g) cuando se toman 1,5 g de muestra 1 0,5 No procede, incluido en la solución de extracción 20 50 1,3 2 2,5 20 250 6,7 3 5,0 20 500 13,3 4 7,5 20 750 20,0 5 10,0 20 1000 26,7 6 15,0 20 1500 40,0 La gradación de las soluciones estándar puede ajustarse, dentro del rango de calibración, dependiendo del equipo utilizado y las muestras que hay que analizar, teniendo en cuenta el posible efecto sobre la sensibilidad del método. Todos los disolventes y soluciones deben estar a temperatura ambiente antes de su uso. 11. MUESTREO 11.1 Tome muestras del producto de tabaco sin humo de acuerdo con el procedimiento de muestreo del laboratorio. Se pueden utilizar métodos alternativos para obtener una muestra de laboratorio representativa de acuerdo con la práctica de cada laboratorio individual o cuando lo exija una normativa específica o la disponibilidad de muestras. 11.2 Constitución de la muestra de prueba 11.2.1 Divida la muestra de laboratorio en unidades separadas (por ejemplo, paquete, recipiente), si corresponde. 11.2.2 Tome una cantidad igual de productos para cada muestra de prueba de al menos √n[2.2] de las unidades individuales (por ejemplo, paquete, recipiente). 12. PREPARACIÓN DEL PRODUCTO 12.1 Retire el producto de tabaco sin humo del paquete o recipiente. Incluya muestras de control de calidad (cuando corresponda). 12.2 Tome una porción representativa adecuada del producto de tabaco sin humo de acuerdo con la práctica del laboratorio individual (por ejemplo, se puede aplicar un método de muestreo de análisis de alimentos). 12.3 Extraiga el tabaco sin humo del producto. PON 12 de la Red de Laboratorios del Tabaco de la Organizacion Mundial de la Salud Procedimiento operativo normalizado para determinar el contenido de nicotina en productos de tabaco sin humo 7 I n i c i a t i v a « L i b e r a r s e d e l T a b a c o » — R e d d e L a b o r a t o r i o s d e l T a b a c o ( T o b L a b N e t ) 12.4 Combine y mezcle cantidades suficientes de muestras de productos de tabaco sin humo para constituir aproximadamente 0,5-2 g de tabaco sin humo homogéneo para cada muestra de prueba. 13. PREPARACIÓN DE LA MÁQUINA DE FUMAR No se aplica. 14. GENERACIÓN DE MUESTRAS No se aplica. 15. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS 15.1 Tome de 0,5 a 2 g de la muestra y pésela con una precisión de 0,001 g en un recipiente de extracción de 100 ml. 15.2 Mezcle la muestra de prueba con 20 ml de agua, 40 ml de solución de extracción (9.2.2) y 10 ml de solución de hidróxido de sodio de 2 mol/l. 15.3 Agite el matraz durante 60 ± 2 minutos en un agitador. 15.4 Deje reposar el matraz de muestra durante otros 20 minutos para permitir una separación visible y clara de las fases. Después de la separación de las fases, analice una alícuota de la fase orgánica (superior) lo más rápidamente posible mediante CG. Si las fases no se separan claramente, coloque el matraz Erlenmeyer en un baño de ultrasonidos hasta que las fases estén claramente separadas. 15.5 Pasos adicionales si las soluciones son turbias u opacas: (Opción 1) Filtre la muestra a través de un papel Whatman del n.º 41. (Opción 2) Centrifugue las muestras a 10 000 rpm o a una fuerza centrífuga relativa adecuada (>500) para garantizar la transparencia de las soluciones. (FCR >500) para garantizar la obtención de soluciones transparentes. 15.6 Si la muestra se va a almacenar, manténgala protegida de la luz a 4-8 °C. 16. ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS Para cuantificar la nicotina en los productos de tabaco sin humo, se emplea la CG junto con un detector de ionización de llama. Los analitos se resuelven a partir de otras posibles interferencias en la columna de CG. La comparación de la relación de áreas de las incógnitas con la relación de áreas de las concentraciones estándar conocidas arroja concentraciones de analitos individuales. 8 PON 12 de la Red de Laboratorios del Tabaco de la Organizacion Mundial de la Salud Procedimiento operativo normalizado para determinar el contenido de nicotina en productos de tabaco sin humo I n i c i a t i v a « L i b e r a r s e d e l T a b a c o » — R e d d e L a b o r a t o r i o s d e l T a b a c o ( T o b L a b N e t ) 16.1 Condiciones de operación en CG Columna de CG: Varian WCOT sílice fundida, 25 m × 0,25 mm ID del recubrimiento: CP-WAX 51 o equivalente Temperatura de la columna: 170 °C (isotérmica) Temperatura de inyección: 270 °C Temperatura del detector: 270 °C Gas portador: helio a un flujo de 1,5 ml/min Volumen de inyección: 1,0 μl Modo de inyección: Split 1:10 Nota: Es posible que los parámetros de funcionamiento deban ajustarse, dependiendo de las condiciones del instrumento y la columna, y de la resolución de los picos cromatográficos. 16.2 Tiempos de retención esperados 16.2.1 Para las condiciones descritas aquí, la secuencia esperada de elución será n-heptadecano, nicotina. 16.2.2 Las diferencias en, por ejemplo, la temperatura, el flujo de gas y la antigüedad de la columna, pueden alterar los tiempos de retención. 16.2.3 Es necesario verificar el orden de elución y los tiempos de retención antes del análisis de las muestras. 16.2.4 En las condiciones anteriores, el tiempo de análisis total esperado será de aproximadamente 6 min. El tiempo de análisis puede ampliarse para optimizar el rendimiento. 16.3 Determinación de la nicotina La secuencia de determinación será la utilizada en la práctica habitual de cada laboratorio. En esta sección se ofrece un ejemplo de una secuencia de operaciones para la determinación de la nicotina en productos de tabaco sin humo. 16.3.1 Inyecte una alícuota de n-hexano (7.3) para verificar si hay contaminación en el sistema o en los reactivos. 16.3.2 Acondicione el sistema justo antes de su uso inyectando dos alícuotas de 1-μl de una solución de muestra como cebador. 16.3.3 Inyecte una solución de extracción de 1 μl (9.2) y una solución estándar de calibración de prueba en las mismas condiciones que las muestras para verificar el rendimiento del sistema de CG. 16.3.4 Inyecte una alícuota de n-hexano (7.3) para verificar si hay contaminación en el sistema o en los reactivos. 16.3.5 Inyecte en orden aleatorio una alícuota de cada solución estándar de nicotina en el CG. PON 12 de la Red de Laboratorios del Tabaco de la Organizacion Mundial de la Salud Procedimiento operativo normalizado para determinar el contenido de nicotina en productos de tabaco sin humo 9 I n i c i a t i v a « L i b e r a r s e d e l T a b a c o » — R e d d e L a b o r a t o r i o s d e l T a b a c o ( T o b L a b N e t ) 16.3.6 Evalúe los tiempos de retención y las respuestas (recuentos de área) de las soluciones estándar. Si los tiempos de retención son similares (± 0,2 min) a los tiempos de retención en inyecciones anteriores y las respuestas están dentro del 20% de las respuestas típicas en inyecciones anteriores, el sistema está listo para realizar el análisis. Si las respuestas están fuera de las especificaciones, aplique medidas correctivas de acuerdo con la política de su laboratorio. 16.3.7 Registre las áreas de los picos de nicotina y el estándar interno. 16.3.8 Calcule la relación entre la respuesta relativa (RF) del pico de nicotina y el pico de la solución estándar interna (RF = Anicotina / AIS) para cada una de las soluciones estándar de nicotina, incluidos los blancos de disolvente. 16.3.9 Trace un gráfico de la concentración de nicotina (eje X) y las relaciones de áreas (eje Y). 16.3.10 El punto de intersección no debe ser significativamente diferente de cero desde un punto de vista estadístico. 16.3.11 La curva estándar será lineal en todo el rango de calibración. 16.3.12 Calcule la curva de calibración (Y = a + bx) mediante regresión lineal a partir de estos datos y utilice tanto la pendiente (b) como el punto de intersección (a) de la curva de calibración para el cálculo de los resultados. Si el coeficiente de determinación R2 es <0,99, se debe repetir la calibración. Si un punto de calibración individual difiere en más del 10% del valor calculado (estimado a partir de la curva de calibración), se debe omitir el punto de calibración. 16.3.13 Inyecte 1 μl de cada una de las muestras de control de calidad (20.3) y los extractos de muestras de prueba (15.4), y determine las áreas de los picos con el software adecuado. 16.3.14 La señal (relación de las áreas de los picos) obtenida para todas las porciones de prueba debe estar dentro del rango de trabajo de la curva de calibración; de lo contrario, se deberá ajustar el tamaño de la porción de prueba o diluir el extracto de la muestra de prueba. Véanse los cromatogramas representativos en el anexo 1. 17 ANÁLISIS Y CÁLCULOS DE DATOS 17.1 Para cada porción de prueba, calcule la relación (Yt) del área del pico de nicotina con respecto al área del pico de la solución estándar interna. 17.2 Calcule la concentración de nicotina en mg/l para cada alícuota de porción de prueba utilizando los coeficientes de la curva de calibración (mt = (Yt − a) / b). 17.3 Calcule el contenido de nicotina, mn, de la muestra de tabaco expresado en miligramos por gramo a partir de la siguiente ecuación: 10 PON 12 de la Red de Laboratorios del Tabaco de la Organizacion Mundial de la Salud Procedimiento operativo normalizado para determinar el contenido de nicotina en productos de tabaco sin humo I n i c i a t i v a « L i b e r a r s e d e l T a b a c o » — R e d d e L a b o r a t o r i o s d e l T a b a c o ( T o b L a b N e t ) donde mt es la concentración de nicotina en la solución de prueba, en mg/l; Ve es el volumen de la solución de extracción utilizada, en ml; y mo es la masa de la porción de prueba, en g. 18. PRECAUCIONES ESPECIALES 18.1 Después de instalar una nueva columna, acondiciónela inyectando un extracto de muestra de tabaco en las condiciones de CG descritas anteriormente. Las inyecciones deben repetirse hasta que las áreas (o alturas) de los picos tanto de la nicotina como del estándar interno sean reproducibles. Para ello, se necesitarán unas cuatro inyecciones. 18.2 Se recomienda eliminar los componentes de alto punto de ebullición de la columna de CG después de cada conjunto (serie) de muestras elevando la temperatura de la columna a 220 °C durante 30 min. 18.3 Cuando las áreas (o alturas) de pico para el estándar interno son significativamente más altas de lo esperado, se recomienda extraer la muestra de tabaco sin el estándar interno en la solución de extracción. Esto permite determinar si algún componente se eluye con el estándar interno, lo que daría como resultado valores de contenido artificialmente más bajos para la nicotina. 19. COMUNICACIÓN DE DATOS 19.1 Notifique las mediciones individuales para cada muestra evaluada. 19.2 Notifique los resultados según lo especificado en las especificaciones generales del proyecto. 19.3 Para obtener más información, consulte el PON 02 [2.3] de la TobLabNet de la OMS. 20. CONTROL DE LA CALIDAD 20.1 Parámetros de control Nota: Si las mediciones de control están fuera de los límites de tolerancia de los valores esperados, se debe llevar a cabo una investigación adecuada y adoptar las medidas pertinentes. Nota: Si es necesario, se deben llevar a cabo procedimientos adicionales de garantía de calidad en el laboratorio, a fin de cumplir con las políticas de los laboratorios individuales. mn = mt * Ve mo * 1000 PON 12 de la Red de Laboratorios del Tabaco de la Organizacion Mundial de la Salud Procedimiento operativo normalizado para determinar el contenido de nicotina en productos de tabaco sin humo 11 I n i c i a t i v a « L i b e r a r s e d e l T a b a c o » — R e d d e L a b o r a t o r i o s d e l T a b a c o ( T o b L a b N e t ) 20.2 Blanco de reactivo de laboratorio Para detectar la posible contaminación durante la preparación y el análisis de la muestra, incluya un blanco de reactivo de laboratorio, como se describe en 16.3.4. El blanco consiste en todos los reactivos y materiales utilizados en el análisis de muestras de prueba y se analiza de la misma manera que una muestra de prueba. El contenido del blanco debe estar por debajo del límite de detección. 20.3 Muestra para el control de la calidad Para verificar la uniformidad de todo el proceso analítico, analice un producto de tabaco de referencia como los productos de referencia Coresta (CRP), si se dispone de ellos, de acuerdo con las prácticas de cada laboratorio individual. 21. ESPECIFICACIONES DE RENDIMIENTO DEL MÉTODO 21.1 Límite de notificación El límite de notificación se establece en la concentración más baja de los estándares de calibración utilizados, recalculado a mg/g (por ejemplo, 1,3 mg/g con 50 mg/l como la concentración estándar de calibración más baja). 21.2 Controles internos de calidad La recuperación de material de referencia es una medida substitutiva de la precisión. La recuperación se determina midiendo el nivel de nicotina en los productos de tabaco sin humo de referencia. Se calcula con la ecuación siguiente: Recuperación (%) = 100 × (resultado analítico / cantidad certificada) Cuadro 2. Media y recuperación del contenido de nicotina en los productos de tabaco sin humo Muestra de tabaco sin humo Valor certificado (mg/g) Contenido medio de nicotina (mg/g) Recuperación (%) CRP 1 8,0 7,40 92,4 CRP 2 12,0 10,58 88,2 CRP 3 17,0 16,54 97,3 CRP 4 9,0 9,03 100,4 21.3 Especificidad analítica Para verificar la especificidad analítica, se utiliza el tiempo de retención del analito de interés. Para verificar la especificidad de los resultados de una muestra desconocida, se utiliza un rango establecido de proporciones de la respuesta del componente a la del componente estándar interno de un producto de tabaco sin humo de control de calidad. 12 PON 12 de la Red de Laboratorios del Tabaco de la Organizacion Mundial de la Salud Procedimiento operativo normalizado para determinar el contenido de nicotina en productos de tabaco sin humo I n i c i a t i v a « L i b e r a r s e d e l T a b a c o » — R e d d e L a b o r a t o r i o s d e l T a b a c o ( T o b L a b N e t ) 21.4 Linealidad Las curvas de calibración de nicotina establecidas son lineales en el rango de concentración estándar de 50-1500 mg/l (1,3-40 mg/g). 21.5 Posible interferencia La presencia de eugenol o aromas puede causar interferencias, ya que sus tiempos de retención son similares a los de la nicotina. Es más probable que esta interferencia se produzca con muestras que contienen clavo de olor o aromas añadidos. El laboratorio puede resolver la interferencia ajustando los parámetros cromatográficos. 22. REPETIBILIDAD Y REPRODUCIBILIDAD En un estudio colaborativo internacional realizado entre septiembre de 2020 y marzo de 2021, en el que participaron 13 laboratorios y se evaluaron cuatro muestras (cuatro productos de tabaco sin humo CRP), realizado de acuerdo con el Protocolo de Validación del Método de la TobLabNet de la OMS y este PON, se obtuvieron los siguientes valores para este método. Los resultados de las pruebas se analizaron estadísticamente de acuerdo con las normas ISO 5725-1 [2.4] e ISO 5725-2 [2.5] para proporcionar los datos de precisión que se muestran en el cuadro 3. Cuadro 3. Límites de precisión para la determinación del contenido de nicotina (mg/g) en los productos de tabaco sin humo Producto de tabaco de referencia n m^ Límite de repetibilidad (r) Límite de reproducibilidad (R) CRP1 9 7,40 0,49 2,92 CRP2 8 10,58 0,38 2,75 CRP3 7 16,54 0,50 2,77 CRP4 10 9,03 0,49 1,90 PON 12 de la Red de Laboratorios del Tabaco de la Organizacion Mundial de la Salud Procedimiento operativo normalizado para determinar el contenido de nicotina en productos de tabaco sin humo 13 I n i c i a t i v a « L i b e r a r s e d e l T a b a c o » — R e d d e L a b o r a t o r i o s d e l T a b a c o ( T o b L a b N e t ) APÉNDICE 1 Cromatograma típico obtenido en el análisis del contenido de nicotina de productos de tabaco sin humo Figura 1. Ejemplo de un cromatograma de una solución estándar con una concentración de nicotina de 250 mg/l Este documento fue preparado por la Unidad Antitabaco del Departamento de Promoción de la Salud de la Organización Mundial de la Salud (OMS) y miembros de la Red de Laboratorios del Tabaco de la OMS (TobLabNet) como método analítico de procedimiento operativo normalizado (PON) para medir el contenido de nicotina en productos de tabaco sin humo.