Inactivación del virus del ébola durante la tinción de extensiones de sangre con colorante de Giemsa

VERSIÓN 1 – FECHA DE ENTRADA EN VIGOR: 1 DE ENERO DE 2016 INACTIVACIÓN DEL VIRUS DEL EBOLA DURANTE LA TINCIÓN DE EXTENSIONES DE SANGRE CON COLORANTE DE GIEMSA DIAGNÓSTICO MICROSCÓPICO DEL PALUDISMO PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR – DMP-POE-07B 1. OBJETIVO Y ALCANCE Describir el procedimiento para la correcta tinción de los extensiones de sangre para el diagnóstico microscópico del paludismo con inactivación de los virus causantes de fiebres hemorrágicas (de la fiebre del Ebola, por ejemplo) a fin de prevenir las infecciones contraídas en el puesto de trabajo. Este procedimiento solo podrá modificarse con la aprobación del coordinador nacional del aseguramiento de la calidad del diagnóstico microscópico del paludismo. Todos los procedimientos especificados en el presente documento son de obligado cumplimiento para todos los microscopistas responsables del diagnóstico microscópico del paludismo en los laboratorios nacionales de referencia, los laboratorios hospitalarios y los laboratorios básicos de los establecimientos de salud que llevan a cabo esta prueba. 2. INFORMACIÓN GENERAL El personal de laboratorio que manipula muestras de sangre de pacientes que pueden haber estado expuestos al virus del Ebola debe partir del supuesto de que dichas muestras están contaminadas con el virus y observar todas las precauciones de seguridad recomendadas para la manipulación de este tipo de muestras. Según los conocimientos actuales, el virus del Ebola puede sobrevivir durante 48 horas en una extensión de sangre seca. El procedimiento modificado de tinción con colorante de Giemsa descrito en el presente documento permite manipular sin riesgos muestras de sangre contaminadas con el virus del Ebola y lograr una tinción de buena calidad de los parásitos palúdicos. 3. SUMINISTROS, MATERIALES Y EQUIPOS • Colorante de Giemsa (solución al 3%) (véase el DMP-POE-04: Preparación de la solución de tra- bajo de colorante de Giemsa); • Triton X-100 en solución al 5%; • un pequeño recipiente para la solución de trabajo de colorante de Giemsa; • metanol absoluto sin acetona; • cubetas de tinción; • un temporizador; • una pipeta de plástico; • una gradilla de madera para el secado de las extensiones; • guantes de látex desechables (sin empolvar); • una bata de laboratorio; • gafas protectoras, y • una cabina de seguridad biológica de clase II, si se dispone de ella, o una caja de guantes aislante. 2DMP-POE-07B: INACTIVACIÓN DEL VIRUS DEL EBOLA DURANTE LA TINCIÓN DE EXTENSIONES DE SANGRE CON COLORANTE DE GIEMSA 4. PRECAUCIONES DE SEGURIDAD 1. Observe las precauciones universales. Véase el DMP-POE-11: Procedimientos generales de seguridad en el laboratorio de diagnóstico microscópico del paludismo. 2. Utilice el equipo de protección individual adecuado, que comprende una bata de laboratorio, guantes y protección ocular. Para más detalles, véase la lista de referencias. 3. Para el diagnóstico microscópico del paludismo, no obtenga las muestras de sangre por punción dactilar. Las muestras deben ser de sangre venosa recolectada en tubos con EDTA. 4. Las extensiones de sangre deben prepararse en el laboratorio, en una cabina de seguridad biológica de clase II o una caja de guantes aislante. 5. Las extensiones gruesas y las finas deben prepararse en portaobjetos distintos. Evite que se generen aerosoles durante su preparación. 6. No saque las extensiones de la cabina de seguridad biológica hasta que estén completamente secas.Deseche todo el material contaminado en una cubeta que se descontaminará en un autoclave o en hipoclorito de sodio al 10% (lejía) durante al menos 5 minutos. 5. PROCEDIMIENTO DIAGRAMA DE FLUJO DESCRIPCIÓN DE LA ACTIVIDAD 1. Prepare una solución de Triton X-100 al 5%. 2. Prepare dos cubetas de colorante de Giemsa al 3%, añada Triton X-100 al 5% y mezcle. Etiquételas como «extensiones finas» y «gotas gruesas». 3. Fije las extensiones finas durante 15 minutos en una cubeta con metanol absoluto y espere a que se sequen. No fije las gotas gruesas. 4.1. Vierta 40-50 ml de colorante de Giemsa en solución amortiguadora en una tercera cubeta de tinción, añada dos gotas de Triton X-100 y mezcle. 1. Prepare la solución de Triton X-100 al 5% con: agua desionizada (calentada a 56 °C) = 95,0 ml Triton X-100 = 5,0 ml Para disolver más fácilmente el Triton X-100, que es viscoso, primero caliente el agua desionizada y luego añada lentamente el Triton X-100 mientras remueve para mezclarlo. No agite la mezcla. 2. Prepare dos cubetas para la solución de trabajo de colorante de Giemsa al 3% y rotule una como «extensiones finas» y otra como «gotas gruesas». Añada las cantidades de Triton X-100 al 5% indicadas en la tabla siguiente. Se debe preparar una solución de trabajo nueva de colorante de Giemsa para cada lote de extensiones. Reactivo Gota gruesa Extensión fina Solución amortiguadora (véanse el DMP POE-03a y el DMP POE- 03b) 40,0 ml 40,0 ml Triton X-100 al 5% 2,0 ml Dos gotas de una pipeta de 1 ml Solución madre de colorante de Giemsa (véase el DMP POE-02) 1,2 ml 1,2 ml Tiempo de tinción 45-60 minutos 45-60 minutos Procedimiento de tinción de extensiones sanguíneas 3. Fije las extensiones finas manteniéndolas 15 minutos en un recipiente con metanol absoluto para inactivar el virus del Ebola. Espere a que se sequen. No fije las gotas gruesas. Espere a que se sequen del todo antes de teñirlas. Protéjalas del polvo, los insectos, el calor y los vapores de metanol absoluto. 4. Procedimiento de tinción 4.1. Vierta 40-50 ml de solución amortiguadora de pH 7,2 en una tercera cubeta de tinción. Añada dos gotas de Triton X-100 y mezcle. Utilice esta solución para enjuagar las extensiones finas y gruesas. 3DMP-POE-07B: INACTIVACIÓN DEL VIRUS DEL EBOLA DURANTE LA TINCIÓN DE EXTENSIONES DE SANGRE CON COLORANTE DE GIEMSA DIAGRAMA DE FLUJO DESCRIPCIÓN DE LA ACTIVIDAD 4.2. Sumerja durante 45 minutos los portaobjetos con las extensiones finas fijadas y los portaobjetos con las gotas gruesas sin fijar en las correspondientes cubetas de colorante de Giemsa rotuladas como «extensiones finas» y «gotas gruesas». 4.3. Extraiga los portaobjetos de uno en uno y escúrralos brevemente sobre papel absorbente. 4.4. Enjuague las extensiones finas de una en una sumergiéndolas tres o cuatro veces en la solución amortiguadora de la tercera cubeta. 4.5-4.6. Sumerja de una en una las gotas gruesas en la solución amortiguadora durante 5 minutos, deje que se sequen en vertical en una gradilla y examínelas con el objetivo de 100x. 4.7. Deseche la solución sobrante de colorante de Giemsa al 3%. 4.2. Coloque los portaobjetos que llevan las extensiones finas fijadas y los que llevan las gotas gruesas sin fijar en las cubetas de tinción que llevan el rótulo correspondiente («extensiones finas» y «gotas gruesas») y ajuste el temporizador en 45 minutos. 4.3. Cuando termine el tiempo de tinción, extraiga los portaobjetos de uno en uno y escúrralos brevemente sobre papel absorbente. 4.4. Enjuague las extensiones finas sumergiéndolas una por una tres o cuatro veces en la solución amortiguadora de la tercera cubeta. 4.5. Sumerja las gotas gruesas una por una en la solución amortiguadora durante 5 minutos. 4.6. Deje secar las extensiones en posición vertical en una gradilla Una vez secas, las extensiones teñidas están listas para ser examinadas; véase el DMP-POE-08: Examen microscópico de extensiones de sangre gruesas y finas para la identificación de parásitos palúdicos. 4.7. Deseche la solución de colorante de Giemsa al 3% que no haya utilizado. Véase el DMP-POE-13: Gestión de los residuos generados en las pruebas de diagnóstico del paludismo. 6. NOTAS SOBRE EL PROCEDIMIENTO Las extensiones de sangre finas y las gruesas deben teñirse por separado porque en cada caso se utilizan cantidades distintas del reactivo Triton X-100 al 5%. Es fundamental exponer las extensiones durante 45 minutos a las altas concentraciones de Triton X-100 indicadas anteriormente para inactivar el virus del Ebola. Se deben exponer las extensiones finas al metanol absoluto durante al menos 15 minutos para inactivar el virus del Ebola. 7. POE RELACIONADOS DMP-POE-03a: Preparación de la solución amortiguadora de pH 7,2 DMP-POE-03b: Preparación de la solución amortiguadora de pH 7,2 con pastillas de amortiguador DMP-POE-04: Preparación de la solución de trabajo de colorante de Giemsa DMP-POE-08: Examen microscópico de extensiones de sangre gruesas y finas para la identificación de parásitos palúdicos DMP-POE-11: Procedimientos generales de seguridad en el laboratorio de diagnóstico microscópico del paludismo DMP-POE-13: Gestión de los residuos generados en las pruebas de diagnóstico del paludismo. 4DMP-POE-07B: INACTIVACIÓN DEL VIRUS DEL EBOLA DURANTE LA TINCIÓN DE EXTENSIONES DE SANGRE CON COLORANTE DE GIEMSA 8. REFERENCIAS Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades. Guidance for malaria diagnosis in patients suspected of Ebola infection in the United States. Atlanta, Georgia; 2014. Organización Mundial de la Salud. Infection prevention and control (IPC) guidance summary. Ginebra; 2014. Organización Mundial de la Salud. Personal protective equipment in the context of filovirus disease outbreak response. Ginebra; 2014. 9. HISTORIAL DEL DOCUMENTO Fecha (mmm/aaaa) Versión Observaciones Persona responsable (Nombre y apellido) Ene 2016 1 Examinado y redactado en su versión definitiva por expertos, editado y formateado Glenda Gonzales, Funcionaria técnica, WPRO WHO/HTM/GMP/MM/SOP/2016.07b © Organización Mundial de la Salud 2016. Se reservan todos los derechos.