Immunité intestinale et élaboration de vaccins : mémorandum OMS

Bulletin de l'Organisation mondiale de la Sante, 58 (2): 257-274 (1980) Immunite intestinale et elaboration de vaccins: Memorandum OMS* Reuni en aou2t 1978 au titre de 1element <<recherche>) duprogrammeOMS de lutte contre les maladies diarrheiques, un groupe de travail scientifique a examine les progres recents enregistres dans la connaissance de l'immunite intestinale, l'application des techniques de la genetique d la mise au point de vaccins contre les infections intestinales, la situation actuelle en matiere d'agents immunisants contre le cholera, la fievre typhoide et la dysenterie a Shigella, ainsi que les perspectives de mise aupoint de vaccins nouveaux ou ameliores contre des agents pathogenes bien connus ou nouvellement identifies tels que les rotavirus et les souches d'Escherichia coli productrices d'enterotoxines. Pour chacun de ces secteurs, le groupe a formu/e des recommandations specifiques touchant des recherches nouvelles ou plus poussees qui devraient etre prises en consideration pour be'neficier de l'aide du programme OMS de recherche dans le domaine des maladies diarrheiques. Dans la lutte contre les diarrh&es infectieuses et les autres infections intestinales, le succes est le mieux assure par l'amelioration de l'approvisionnement en eau et de l'assainissement et le developpement de l'education. Mais, dans de nombreuses regions du monde, ce but sera impossible a atteindre dans le proche avenir par suite du manque de ressources et des arbitrages a effectuer pour tenir compte des autres priorites. Une approche complementaire de la prevention reside dans la mise au point de vaccins capables de conferer une protection durable. Pour illustrer l'effi- cacite que peut avoir un vaccin contre les infections intestinales, il suffit de rappeler l'important recul qu'a enregistre la poliomyelite dans le monde entier A la suite de la mise au point de vaccins, vivants ou inactives. L'Ulaboration de vaccins efficaces contre les princi- paux agents pathogenes intestinaux necessite une meilleure comprehension des mecanismes immuni- taires au niveau de tractus gastro-intestinal. Malgre les progres importants realises dans la connaissance de l'immunite associee a l'intestin, les connaissances fondamentales devront encore etre developpees dans ce domaine. D'importants progres ont egalement e't accomplis ces dernieres annees dans I'elucidation des meca- nismes pathogenes de certaines diarrhees infectieuses, mais de nombreux points restent obscurs. Le present Memorandum examine les progres recents enregistres dans la connaissance de l'immunite associ6e A l'intestin, 1'application des nouvelles acqui- sitions de la genetique A l'e1aboration de vaccins contre les infections intestinales, la situation actuelle en matiere d'agents immunisants et les perfectionne- ments ou innovations envisageables A ce dernier egard. IMMUNITE INTESTINALE L'intestin constitue un organe important du point de vue de l'immunite, puisqu'il contient dans le chorion de sa muqueuse autant de cellules lymphoides que la rate. Parmi ces cellules figurent des cellules T (d&rives du thymus), des cellules B (derivees de la moelle osseuse), des cellules «null> (petits lympho- cytes ne presentant aucune des caracteristiques des cellules T ou B) et des plasmocytes. Ces derniers sont * Ce Memorandum a W prepare par les signataires dont les noms figurent aux pages 273-274 a l'occasion de la reunion du groupe de travail scientifique sur l'immunite et I'61aboration de vaccins qui s'est tenue a Genve du 14 au 16 aofit 1978. La version originale en anglais a paru dans le Bulletin de l'Organisation mondiale de la Sante, 57 (5): 719-734 (1979). Les demandes de tires a part doivent etre adress&es au programme de lutte contre les maladies diarrheiques, Organisation mondiale de la Sante, 1211 Geneve 27, Suisse. essentiellement des immunoglobulines de la classe A qui constituent la source d'anticorps secretes a la surface de la muqueuse. Les nombreux petits lympho- cytes participent au controle de la production d'anti- corps et il est certain qu'ils ont un role dans les reponses immunitaires cellulaires importantes qui sont encore mal connues. Les anticorps secretes representent le principal mecanisme de protection contre les bacteries non invasives et les virus intesti- naux, ainsi que contre leurs produits toxiques. I1 est probable que les anticorps, secretes ou circulants, conferent aussi une protection contre les bacteries invasives, encore que les m&anismes d'immunite a mediation cellulaire aient eux-memes une importance indeniable a cet egard. Si cette etude fait ressortir 3943 -257- MEMORANDUM OMS l'importance de la reponse immunitaire sous forme de production d'anticorps secrtoires, c'est essentielle- ment parce qu'il s'agit de l'aspect le mieux connu de l'immunite intestinale. La plupart des concepts evoques ici ont leur origine dans l'experimentation animale; de fa$on generale, ils s'appliquent probable- ment A l'homme, encore que des differences inter- sp&cifiques puissent exister. ANTICORPS INTESTINAUX Les anticorps qui protegent la muqueuse intestinale contre les micro-organismes non invasifs ou contre leurs produits ont deux sources: le serum et les plasmocytes du chorion. Le mecanisme de production d'anticorps A partir du serum semble inefficace car il est rare que le titre d'anticorps puisse etre maintenu A la valeur elevee qui est necessaire pour assurer la protection. Les anticorps seriques qui parviennent jusqu'A la lumiere intestinale sont en majeure partie des IgG. Par contre, les anticorps produits localement par les plasmocytes du chorion sont generalement des IgA, secretees de facon selective A la surface de la muqueuse par l'epithelium des cryptes de Lieberkuhn. Comme les IgA s&retoires resistent a la proteolyse des enzymes intestinales, elles semblent mieux concues que les IgG pour assurer la protection de la muqueuse superficielle. Dans une large mesure, le systeme immunitaire de la muqueuse fonctionne de fa$on independante des m&anismes immunitaires generaux. Une reponse immunitaire peut apparaitre au niveau de l'un des deux systemes, sans qu'il en aille n&essairement de meme au niveau de l'autre. Pour qu'il y ait reponse immunitaire locale, il semble neessaire que l'antigene atteigne le tissu lymphoide de l'intestin, en particulier les plaques de Peyer. Ce contact se produit parfois quand les antigenes sont injectes par voie parenterale, notamment A doses elevees. Mais, en general, la reaction locale n'est intense que si la surface muqueuse est directement exposee A l'antigene. Les plaques de Peyer consistent en des accumula- tions disseminees de follicules clos formes de cellules lymphoides situees dans la sous-muqueuse de l'intestin: elles contiennent des cellules T, des cellules B et des macrophages. Ces plaques qui s'observent dans l'intestin grele et dans l'appendice renferment les cellules qui constituent les pr&urseurs de la reponse en IgA. L'epithelium muqueux qui recouvre les plaques de Peyer est modifie, formant seulement des villosites rudimentaires et manifestant une pinocytose accrue. Bien que de petites quantites de macromolcules, notamment de proteines, soient absorb&s sans aucune alteration par les villosites, la muqueuse qui recouvre les plaques de Peyer semble conque pour pro- ceder A une preselection des antigenes provenant de la lumiere intestinale et en effectuer la <<presentation>> aux tissus lymphoides des plaques. Les virus dont la replication s'opere dans la muqueuse sont generale- ment doues d'un pouvoir immunogene eleve. En revanche, les antigenes non vivants possedent une aptitude tres inegale A susciter une reponse immuni- taire locale. C'est ainsi que la quantite n&essaire pour susciter une reponse se chiffre en milligrammes ou meme en grammes dans le cas de proteines comme la s&rum-albumine bovine ou la ferritine de la rate de cheval, alors qu'il suffit de 100 ng de toxine chole- rique pour declencher une reponse primaire au niveau de l'intestin du rat. Encore qu'elles soient imparfaite- ment comprises, ces differences tiennent peut-etre aux proprietes sp&ifiques de la toxine cholerique qui en font un antigene muqueux particulierement efficace. Ces proprietes sont au nombre de deux: une capacite de liaison A la membrane, qui peut renforcer la phago- cytose de l'antigene adsorbe par les lymphocytes des plaques de Peyer, et l'activation de l'adenylate- cyclase, qui peut renforcer la reponse immunitaire par effet direct sur la fonction lymphocytaire. S'il etait possible de choisir d'autres antigenes possedant ces memes proprietes-ou de les preparer A cette fin-on disposerait d'agents immunisants particulierement efficaces au niveau de la muqueuse. CINETIQUE DE LA REPONSE EN IgA ET PRODUCTION D'ANTICORPS DE CETTE CLASSE L'origine et la migration des IgA intestinales ou de leurs precurseurs sont schematisees dans la Fig. 1, qui recapitule les travaux de plusieurs laboratoires et- bien que ce soient les antigenes proteiques qui ont e etudies le plus en detail-vaut sans doute egalement pour la reponse A tous les types d'antigenes. Chez les animaux qui se trouvent exposes a l'antigene pour la premiere fois, la rencontre de celui- ci avec le tissu lymphoide des plaques de Peyer provoque l'expansion d'un clone de cellules B sp&e cialisees dans la production d'anticorps de la classe IgA. Pour une petite part, ces cellules se transforment en plasmoblastes et quittent la plaque pour penetrer dans les vaisseaux lymphatiques efferents; mais la plupart restent dans la plaque sous forme de cellules B sensibilisees a l'antigene. II est probable qu'une sensi- bilisation des cellules T intervient egalement, mais elle n'a pas ete etudiee en detail. Lors d'une deuxieme exposition A l'antigene, ces cellules sensibilisees subissent une transformation lymphoblastique rapide. Elle est suivie d'une division cellulaire puis d'une migration des immunoblastes IgA, tout d'abord vers les ganglions lymphatiques mesenteriques puis, a travers le canal thoracique, jusqu'A la circulation 258 IMMUNITP INTESTINALE ET ELABORATION DE VACCINS surface de la muqueuse sous forme d'une IgA s&r& toire de constante de sedimentation 11 S. Les anticorps s&retoires IgA assurent une protection antibact&- rienne selon deux grands mecanismes: 1) une action Canal directe sur les bacteries, qui aboutit A leur immobili- \thoracique sation ou leur agglutination ou encore les empeche -; d'adherer a la muqueuse; et 2) une combinaison avec des produits bacteriens, par exemple des toxines ou des enzymes, qui entraine une inactivation des glions bacteries et facilite leur destruction par les enzymes ant4riques proteolytiques. I1 n'est pas demontre que l'IgA scr&- toire ait un role bactericide important; quant A son activite antivirale, elle s'exerce par combinaison avec O 80240 le virus et inhibition de son captage par les celluleshOtes. Fig. 1. Circulation des immunocytes intestinaux. Les immunoblastes ont leur origine dans les plaques de Peyer (PP) ou dans les ganglions m6sentbriques; ils migrent 6 travers le canal thoracique et p6ndtrent dans la circulation g6nArale. Leur point final d'aboutissement se trouve essentiellement dans l'intestin, mais ils peuvent 6galement se diriger vers d'autres surfaces muqueuses ou vers le sein. Au niveau du chorion de la muqueuse, les immunoblastes apparaissent sous forme de plasmocytes. Reproduit de PIERCE, N. F. Intestinal antibodies. Journal of infectious diseases, 137: 661-662 (1978), avec I'aimableautorisation de I'auteur et de l'6diteur, I'Universit6 de Chicago. generale. Ainsi, les cellules IgA engendr&es par une petite zone de l'intestin peuvent se disseminer dans l'ensemble de l'organisme. II est probable que certaines d'entre elles s'etablissent dans des sites lointains de secretion d'IgA, par exemple la lamina propria du tractus respiratoire ou l'epithelium des conduits galactophores. Mais, en tres grande majorite, elles reviennent jusqu'au chorion de la muqueuse intestinale, oiu elles prennent rapidement la morphologie de plasmocytes d'une dur&e de vie moyenne d'environ 5 jours. La presence dans la muqueuse de l'antigene contre lequel les anticorps sont diriges constitue l'un des principaux 6lements qui determinent le retour electif de ces cellules jusqu'a l'intestin. Contrairement a la reponse primaire, cette reponse secondaire est massive et rapide, se mani- festant dans les 48 A 60 heures pour atteindre un pic au bout de 4 ou 5 jours et decliner ensuite tres vite. Quand la reponse immunitaire est provoqu&e par une agres- sion prolongee, comme c'est le cas dans les infections virales ou bacteriennes de l'intestin, ces deux aspects, primaire et secondaire, fusionnent pour ne former qu'une serie continue de reactions qui s'enchainent jusqu'A la fin de l'infection. Les cellules du chorion productrices d'IgA secretent un dimere 9S qui penetre dans les cellules epitheliales de la couche glandulaire. L'IgA se combine alors avec une o<composante s&retoire>> produite par ces cellules epitheliales, et l'immunoglobuline apparait A la DUR-E DE LA PROTECTION AU NIVEAU DE LA MUQUEUSE On peut envisager deux mecanismes qui explique- raient une protection prolongee a la surface de la muqueuse sous l'influence des anticorps locaux. Tout d'abord, il est possible que des plasmocytes sp&i- fiques a IgA produisent une quantite d'anticorps secretoires faible mais suffisante pour assurer une protection, et cela longtemps apres la fin de l'exposi- tion A l'antigene. En second lieu, il se peut que la protection prolongee soit subordonnee a une memoire immunologique du systeme IgA de la muqueuse, qui se reveillerait rapidement. Les reponses de type pri- maire et secondaire qu'on a mises en evidence dans ce systeme sont bien la preuve qu'il existe une sorte de memoire immunologique locale. Un tel m&anisme pourrait conferer une protection contre les infections ayant une periode d'incubation d'au moins 3 a 5 jours et il pourrait egalement hater la fin des infections constituees. I1 est moins certain que la reponse de type secondaire soit suffisamment rapide pour empecher la survenue de maladies dont l'incubation est plus rapide, comme c'est le cas de nombreuses infections intestinales, virales ou bacteriennes. La dur& maximale pendant laquelle la memoire locale assure des reponses secondaires non affaiblies n'est pas connue avec certitude, mais elle doit au moins atteindre 4 a 8 mois. Cependant, l'ampleur de la reponse secondaire peut se trouver diminuee et la dur& d'efficacite de la memoire nettement raccourcie en cas de depression de la reponse en IgA. Le m&a- nisme de cette depression, specifique de l'antigene, est mal connu, mais elle devient generalement de plus en plus intense a mesure qu'on s'eloigne du moment de l'immunisation, mettant souvent 4 A 8 semaines pour atteindre son maximum. Elle peut persister de nombreux mois. Chez le rat et le lapin, ce phenomene s'observe frequemment apres immunisation par voie 259 MEMORANDUM OMS parenterale et il peut egalement survenir apres immunisation par voie digestive; par contre, il n'a jamais e observe chez le chien immunise par voie parent&ale. Chez l'homme, aucune etude n'a e consacree a ces phenomenes de memoire ou de depression au niveau du systeme IgA de la muqueuse. TECHNIQUES DE MESURE DE LA REPONSE IMMUNITAIRE AU NIVEAU DE LA MUQUEUSE CHEZ L'HOMME Les techniques de mesure de la reponse immunitaire au niveau de la muqueuse doivent reposer sur la comprehension des caracteristiques de ce systeme, notamment la distribution et la classe des anticorps produits. Les methodes traditionnelles d'etude de la reponse immunitaire generale font essentiellement appel a la detection des anticorps dans le serum; mais, sauf exception (voir ci-apres), ces methodes sont pratiquement denuees d'int&et lorsqu'il s'agit de mesurer la reponse immunitaire au niveau de la muqueuse. Plusieurs m&thodes susceptibles d'&re employ&es dans ce cas sont decrites ci-dessous. I1 convient en outre de noter qu'une reponse immuni- taire au niveau de la muqueuse ne s'accompagne pas necessairement d'une protection et que, a l'inverse, il peut y avoir protection sans reponse immunitaire decelable. La correlation entre la protection et la mesure d'une reponse locale sp&ifique ne peut etre mise en evidence qu'au moyen d'etudes apres injection'de doses d'epreuve ou d'etudes prospectives appropriees sur le terrain. Mesures directes L'anticorps s&retoire specifique est decelable dans le liquide intestinal preeve par tubage. Les principales difficultes tiennent 1) au mode d'obtention de l'echantillon et 2) A la dilution variable de l'IgA s&r&- toire par les sucs intestinaux. Les anticorps secretes risquent aussi d'etre partiellement degrades par les enzymes intestinales. Dans certaines epreuves, on peut utiliser le liquide intestinal tel quel mais, dans d'autres, il est n&essaire de proceder a une dialyse pouss&e, a une concentration ou A une separation des immunoglobulines pour pouvoir obtenir des resultats convenables. De facon generale, la methode d'epreuve doit etre specifique de la classe IgA pour exclure le risque de detection d'anticorps derives du serum. La technique ELISA (titrage avec immuno- adsorbant lie A une enzyme) s'est aussi montree tres utile. Des epreuves qui permettent de reconnaitre la fonction des anticorps-par exemple la neutralisation de virus ou de toxines-sont egalement importantes mais elles ne sont generalement pas specifiques de la classe d'anticorps. Chez les animaux, des plasmocytes renfermant des anticorps sp&ifiques ont et identifies et denombres dans des biopsies du chorion au moyen d'une tech- nique d'immunofluorescence specifique; elle serait utilisable chez l'homme, mais son application se trouve tres fortement limit&e par les difficultes de la biopsie intestinale et la faible taille de l'&chantillon. Mesures indirectes La mesure d'anticorps IgA sp&cifiques dans d'autres secretions externes, notamment la salive, le colostrum et le lait, pourrait ere utile. On sait en effet que les IgA provenant de la reponse intestinale passent en partie dans ces secretions lors de leur diffusion. Cette approche a l'avantage de permettre un preleve- ment plus facile de l'&chantillon. I1 n'est cependant pas encore prouve que la reponse intestinale en IgA se manifeste dans ces s&retions de facon fiable ou quantitative. Ce point sera peut-ere clarifie par les etudes futures. La mesure des anticorps IgA sp&ifiques dans le serum est egalement interessante car une partie des IgA intestinales ne sont pas secretees mais penetrent dans la circulation sanguine. Cette approche exige une technique hautement sp&cifique de la classe IgA, car le serum risque de contenir des anticorps sp&cifiques d'autres classes ainsi que des anticorps provenant de sites autres que la muqueuse. En outre, il n'est pas certain que les anticorps IgA sp&cifiques du s&rum fournissent un reflet quantitatif de la production au niveau de la muqueuse puisque des IgA sous forme de monomere 7S sont egalement produites dans la rate. IMMUNITE A MEDIATION CELLULAIRE ET FACTEURS NON IMMUNOLOGIQUES Il faut insister sur le fait que l'anticorps s&retoire ne constitue que l'un des elements d'un systeme complexe de defense au niveau de l'intestin. Les m&anismes de defense immunitaire a mediation cellu- laire sont mal connus mais il est certain qu'ils reagis- sent en presence d'une invasion de bacteries, et peut- etre de virus, et contribuent a la protection. Une etude poussee de cet aspect du systeme immunitaire de la muqueuse s'impose. Enfin, des facteurs non immuno- logiques-par exemple l'acide gastrique, les enzymes proteolytiques, les contractions peristaltiques et la s&cretion de mucus-jouent aussi un r6le important en empechant la colonisation bacterienne ou en inacti- vant les produits bacteriens toxiques. 260 IMMUNITE INTESTINALE ET ELABORATION DE VACCINS APPLICATION DE LA GENETIQUE A LA MISE AU POINT DE VACCINS CONTRE LES INFECTIONS INTESTINALES ANALYSE GENETIQUE DES AGENTS ENTEROPATHOGENES La genetique microbienne s'attache a identifier les traits sp&cifiques de la virulence en examinant des mutants A qui manquent un ou plusieurs genes contri- buant A la pathogenicite de l'agent. Ces determinants sont ensuite caract&rises par croisement genetique. Depuis le debut des annees 1960, on dispose pour etudier les agents pathogenes intestinaux de procedures genetiques, qui ont d'abord ete appliquees A Escherichia coli K-12. On sait produire des recombi- nants interspecifiques ou intergeneriques entre E. coli, Shigella et Salmonella par transduction (transfert de materiel genetique par l'intermediaire des bacterio- phages) et par conjugaison (transfert genetique par l'intermediaire des pili lors du contact entre deux micro-organismes). Plus recemment, on a applique A l'analyse d'E. coli K-12 la technique de transforma- tion (transfert geneique par l'intermediaire de la fixation de molecules libres d'ADN). Cette technique n'a guere ete appliquee aux autres enterobacteriacees ni aux vibrions. Souvent, la transformation ne s'accompagne que d'une transmission limitee des genes chromosomiques entre les differents micro-organismes par suite de l'hterologie de l'ADN ou de differences concernant les enzymes specifiques qui degradent (enzymes de restriction) ou modifient (enzymes de modification) I'ADN etranger. Pourtant, l'emploi des techniques de transfert s'est revele utile A plusieurs occasions. Par exemple, des etudes de conjugaison et de transduction entre E. coli et Shigellaflexneri ont abouti a l'identifi- cation des determinants genetiques specifiques qui regissent la colonisation de l'intestin, l'invasion des cellules epitheliales et la multiplication intracellulaire. Ces techniques genetiques ont permis de mettre au point plusieurs recombinants E. coli-Shigel/a qui pourraient servir de souches vaccinales. Dans quelques etudes, on a essaye d'identifier les determinants genetiques de la pathogenie des infec- tions a Salmonella chez la souris, et des progres considerables ont ete accomplis dans la compr&- hension des bases genetiques de la biosynthese de l'antigene. Depuis le debut des annees 1960, on dispose aussi d'un systeme de transfert genetique pour Vibrio cholerae. On demeure pourtant mal renseigne sur les genes de V. cholerae qui controlent la biosynthese de la toxine et regissent la capacite des vibrions a coloniser l'intestin. Depuis quelque temps, la recherche sur l'analyse genetique de V. cholerae s'est developp&e grace aux meilleures souches, donatrices et receptrices, dont on dispose et A l'application de certaines des acquisitions les plus recentes de la technologie de la genetique micro- bienne. Des systemes genetiques convenables permettent aujourd'hui d'etudier la pathogenie des diarrhees A E. coli, Salmonella, Shigella et V. cholerae. Jusqu'A ces derniers temps, cependant, ces systemes n'ont guere ete appliques par suite du manque d'epreuves relativement simples qui permettraient de reperer les produits des genes de virulence parmi les multiples recombinants issus des croisements genetiques. I1 est vrai aussi que, sauf quelques exceptions notables, les geneticiens les plus competents ne se sont pas int&- resses A la genetique des determinants de la patho- genie. En outre, les sp&cialistes qui s'interessent le plus A la mise au point de souches vaccinales n'ont souvent pas conscience des possibilites de la genetique. DETERMINANTS DE LA VIRULENCE A SUPPORT PLASMIDIQUE Les plasmides, ces elements extrachromosomiques qui peuvent etre transferes d'une bacterie a l'autre, font l'objet d'etudes intensives depuis une vingtaine d'ann&es. Dans la plupart des cas, les travaux ont porte sur les plasmides qui determinent la resistance aux antibiotiques. Plus recemment, on a decouvert que E. coli possede des determinants de virulence A support plasmidique, qui comprennent des entero- toxines (Ent+) et des facteurs de colonisation. Les deux categories de determinants sont necessaires pour que le caractere pathogene s'exprime pleinement. Les determinants chromosomiques qui agissent en asso- ciation avec Ent+ et avec les antigenes de coloni- sation sont en grande partie inconnus. Des facteurs contributifs de ce genre peuvent avoir une importance considerable dans l'elaboration de souches vaccinales appropriees. Les manipulations genetiques des plasmides Ent et des plasmides de colonisation offrent d'excellentes perspectives. Par exemple, il est possible de transposer sur ces plasmides les genes de la resistance aux anti- biotiques. Outre que l'on peut ainsi marquer le plasmide au moyen d'un element facile A definir, la methode permet aussi d'isoler des derives non toxino- genes (tox-) qui peuvent presenter une deficience dans la biosynthese d'un ou plusieurs genes de structure ou de regulation. II ne devrait pas etre difficile d'isoler un mutant producteur d'une substance immunogene 261 MEMORANDUM OMS mais non toxique susceptible de servir A la mise au point d'un vaccin. Tres peu d'informations ont e publiees sur la contribution possible des plasmides A la pathog&nie de la salmonellose, de la shigellose ou du cholera. TRANSPOSITION L'une des observations r&centes de la genetique microbienne qui a le plus intrigue a e l'identification d'une classe de sequences de base qui peuvent etre excisees d'une portion de la mol&cule d'ADN et ins&rees en un autre point de I'ADN A l'int&rieur de la meme cellule. De nombreux genes de la resistance aux antibiotiques supportes par les facteurs R se comportent de la sorte. Ces segments supports de la resistance, designes sous le nom de sequences de transposition ou transposons, peuvent etre excises d'un genome de facteurs R et inseres dans un autre plasmide au sein de la cellule. Ils peuvent aussi etre transposes dans le chromosome bacterien. Ces pheno- menes de transposition sont assez frequents et s'ope- rent de facon pratiquement aleatoire. L'insertion d'un transposon exerce un effet mutagene puisqu'elle perturbe les fonctions du gene oui a lieu l'insertion. De nombreuses possibilites s'offrent pour l'ex- ploitation de la transposition; par exemple: 1) elle peut etre utilisee pour isoler des mutants dans pratiquement tout plasmide ou gene chromosomique; 2) des facteurs R porteurs de transposons peuvent etre largement transferes A toutes les enterobact&ries et au vibrion cholerique; 3) des transposons distincts de resistance aux anti- biotiques ou aux metaux lourds peuvent etre utilises pour marquer une meme souche ou un meme plasmide en de multiples endroits; 4) dans certaines conditions, les transposons peuvent etre introduits dans les chromosomes de sorte que tout clone bacterien resultant possedera une insertion chromosomique; la methode presente un net avantage sur la mutagenese chimique puisqu'on a de fortes chances de parvenir a trouver une classe particuliere de mutants, quelle qu'elle soit; 5) il est possible de construire des souches portant des transposons identiques sur le chromosome bact&- rien et sur un plasmide du micro-organisme; dans des conditions convenables, ces souchec peuvent servir de donneurs genetiques. <<MINICELLULES>> I1 existe chez E. coli, Salmonella et Shigella une classe de mutants, qualifies de <<minicellules>>, qui represente peut-ere une nouvelle approche promet- teuse de la mise au point de vaccins. I1 s'agit de petites cellules non viables, faciles a obtenir en grande quantite et constituant les produits d'une division cellulaire aberrante. Aucune segregation de I'ADN chromosomique ne s'opere dans les minicellules mais elles sont normales sous la plupart des autres aspects, notamment la structure parietale et les appendices cellulaires. ADN RECOMBINANT Les progres recents de la biochimie de I'ADN et le developpement de la technologie de 1'ADN recombi- nant ont notablement accru les perspectives de l'isole- ment et des manipulations genetiques des genes de virulence. I1 est possible de former des mol&cules d'ADN recombinant in vitro en soudant, par voie enzymatique, des fragments d'ADN provenant de pratiquement n'importe quelle source A un trans- porteur, par exemple un plasmide ou un bacterio- phage. Une fois que ces molecules d'ADN recombi- nant (egalement qualifiees de chimeres) ont e formees in vitro, on dispose des techniques voulues pour les introduire dans un hote bacterien convenable oui il y aura replication de la chimere. Les methodes de 1'ADN recombinant ont e appli- quees avec succes A l'isolement des genes de E. coli ST, LT, K88 et K99. Par exemple, on a pu etablir la sequence du gene de structure codant la biosynthese de ST et l'on en a deduit la sequence des acides amines de ST. De plus, la nature de la sequence a permis d'etablir que le gene de structure codant ST se trouve sur un transposon. Ces donn&es laissent penser que les genes codant ST de nombreuses especes ont une origine commune. En outre, comme il est note par ailleurs dans ce Memorandum, il serait extremement utile de disposer d'une epreuve in vitro simple applicable A la detection de ST. Comme il est possible de modifier la position du gene codant ST grace A un emploi judicieux d'enzymes de soudure, on parviendra peut- etre a realiser la fusion du polypeptide ST, normale- ment depourvu d'immunogenicite, avec une proteine immunogene. Ce pourrait etre un moyen utile pour mettre au point un test serologique applicable A la detection de ST et, eventuellement, un agent immuni- sant contre le produit ST. Ces methodes sont applicables A n'importe quel gene presentant un int&ret. Les methodes de 1'ADN recombinant ont cependant leurs limites: il est clair, notamment, qu'elles doivent etre axees sur quelques genes seulement et les produits correspondants. Des applications sont possibles en matiere d'immuno- prophylaxie des maladies intestinales puisque ces methodes permettent de modifier de facon systema- 262 IMMUNITE INTESTINALE ET ELABORATION DE VACCINS tique des sequences genetiques sp&ifiques. Les tech- niques de l'ADN recombinant ont dejA ket appliquees A la synthese in vitro de plusieurs genes d'hormones d'eucaryotes et elles le seront peut-etre pour la synthese de genes de procaryotes susceptibles de pro- duire des immunogEnes appropries. ISOLEMENT DE SOUCHES DE MUTANTS SPECIFIQUES EN VUE DE LEUR EMPLOI COMME VACCIN En principe, un vaccin buccal vivant doit a) etre denue de pathogenicite pour l'homme, b) etre stable, c) conferer une protection et d) porter un ou plusieurs marqueurs appropries permettant son identification chez l'hote et dans 1'environnement. Quand il s'agit d'un agent pathogene intestinal non invasif, comme V. cholerae et les E. coli productrices d'enterotoxines, il doit demeurer capable de coloniser la surface epith&- liale de l'intestin, mais pour des micro-organismes comme Shigella et Salmonella typhi qui se multiplient a l'interieur de la cellule, cette capacite de penetrer dans les cellules et de s'y multiplier est peut-etre inseparable de leur pathogenicite. Des efforts importants ont e accomplis en vue d'isoler des classes specifiques de mutants qui pourraient posseder ces qualites. Pour la plupart, les travaux ont porte sur des especes de Shigella et de Salmonella et les mutants etudies etaient essentiellement du type letal condi- tionnel, c'est-a-dire que les mutants isoles peuvent facilement croltre au laboratoire dans des conditions selectives mais perdent rapidement leur capacite de multiplication chez l'hote animal. Cette caracteris- tique limite la masse antigenique disponible pour stimuler les systemes immunitaires. Les classes les mieux connues de mutants de ce type sont des d&e rives streptomycinodependants de E. coli, Shigella, Salmonella et V. cholerae. On ignore quelles sont exactement les lesions genetiques de ces mutants streptomycinodependants, encore qu'elles puissent vraisemblablement etre analys&es par les mrthodes classiques de la genetique. I1 serait desirable que les souches vaccinales potentielles soient examinees non seulement sous l'angle de leur capacite de reversion mais egalement en vue de preciser la nature du defaut genetique. Dans ces souches, la lesion genetique devrait de preference resulter d'une deletion de materiel genetique ou d'une serie de mutations ponctuelles affectant un meme gene. En outre, seule une analyse genetique preise permet de localiser exactement un gene sp&ifique. AGENTS IMMUNISANTS ACTUELLEMENT DISPONIBLES ET PERSPECTIVES DE DEVELOPPEMENT AGENTS IMMUNISANTS CONTRE LE CHOLERA ET LES SOUCHES D'ESCHERICHIA COLI PRODUCTRICES D'ENTEROTOXINES Sero-epidemiologie du cholera Dans les regions de forte endemie, le cholera est avant tout une maladie de h'enfance. Des etudes realis&es au Bangladesh ont permis de comparer les donnees sero-epidemiologiques et la frequence de la maladie. Faible avant l'age de 2 ans, l'incidence atteignait son maximum de 2 a 5 ans pour diminuer ensuite regulierement. La proportion de sujets en bonne sante porteurs d'anticorps vibriocides aug- mentait rapidement au cours de h'enfance, de sorte que, a 1'age de 12 ans, 80% environ des sujets pr&- sentaient les signes d'une infection anterieure, ce niveau eleve se maintenant ensuite tout au long de la vie. Par contre, l'antitoxine serique atteignait son maximum au debut de l'enfance et diminuait ensuite regulierement. Ce schema semble paradoxal puisque les observations concernant les vibriocides montrent que le sujet est soumis toute sa vie A des infections repetees. Une explication serait qu'il y a exposition inegale A la toxine et a l'antigene somatique (probable- ment un lipopolyoside), qui pourrait resulter du fait que 1'immunite antibacterienne locale limite la crois- sance bacterienne, d'ou une production de toxine faible ou nulle. Autre explication envisageable: la possibilite qu'une antitoxine locale neutralise la toxine secretee localement et empeche son absorption. Quoi qu'il en soit, on ne perdra pas de vue que les mesures ont uniquement porte sur les vibriocides et les anti- corps antitoxiques du serum. Ainsi, la sero-epid&- miologie du cholera est fort loin d'atre completement elucidee. La connaissance de la distribution des anti- corps locaux et generaux diriges contre d'autres facteurs de virulence fournira peut-etre une vue plus claire de l'interaction h6te-parasite. Vaccins anticholeriques a base de vibrions entiers Les vaccins anticholeriques actuellement dispo- nibles ne conferent qu'une protection incomplete et de courte dur&e. Les seuls vaccins d'emploi general sont des vaccins tues, A base de vibrions entiers, A injecter par voie parenterale. La dose habituelle contient environ 4000 millions de vibrions tues, des deux serotypes Inaba et Ogawa. Comme dans le cas de tous les vaccins a germes entiers prepares A partir de bacilles 263 MEMORANDUM OMS gram-negatifs, l'inoculation provoque assez fr&- quemment un &rytheme local, une hyperesthesie douloureuse au toucher et, rarement, des reactions gen&rales mod&rees sous forme de fievre et de malaise. Les reactions sev&res sont d'une frequence negli- geable. Pratiquement toutes les personnes vaccinees developpent des anticorps vibriocides circulants (d&pendants vis-A-vis du complement) et des aggluti- nines, mais aucune antitoxine. Pour la fabrication du vaccin, les vibrions sont gen&ralement cultives A la surface d'un gel de gelose. On obtient ainsi un vaccin pratiquement depourvu d'enterotoxine intra- ou extracellulaire. Plusieurs essais sur le terrain soigneusement contr6les, realises dans des regions d'endemie chol&rique au Bangladesh et aux Philippines, ont montre que les vaccins sans adjuvant conferent une protection de trois A six mois dans 50 A 80% des cas, selon le groupe d'Age, la qualite du vaccin et le schema de son dosage. La protection est d'une egale efficacite contre les biotypes homologues et het&rologues. Chez les enfants de moins de 5 ans, on peut renforcer la protection en administrant deux doses A un mois d'intervalle. D'apres des essais r&cents en Inde et en lndonesie, il semble que l'emploi d'aluminium comme adjuvant renforce la protection confer&e par une dose unique de vaccin chez ce groupe particulierement important des moins de 5 ans. Cependant, le niveau de protection fourni par tous les types de vaccin anti- cholerique A vibrions entiers n'a qu'un int&ret limite du point de vue de la sante publique, meme dans les regions d'endemie. Aucun des vaccins experimentes n'a, semble-t-il, eu d'effets sur la frequence des infections inapparentes et n'a pas non plus contribue A endiguer les epidemies. Immunogenes choleriques experimentaux On a essaye sur le terrain, au Bangladesh, un vaccin lipopolyosidique du serotype Ogawa. Les injections sous-cutanees conferent pendant un an une protection importante contre le chol&ra Inaba, mais uniquement chez l'adulte, encore que le nombre de cas ait e faible. Dans un autre essai au Bangladesh, un vaccin Ogawa A vibrions entiers s'est montre inefficace contre la maladie provoquee par le serotype Inaba. Avec un complexe lipopolyoside-proteine prepare A partir de germes du serotype Inaba et avec un vaccin Inaba A vibrions entiers, on a obtenu chez l'adulte une protection importante contre la maladie Inaba homo- logue pendant une periode relativement courte. Les resultats mediocres obtenus une fois de plus chez les enfants laissent supposer que le vaccin agit A la facon d'un rappel chez les adultes de cette zone d'endemie et ne confererait probablement aucune protection A des populations immunologiquement vierges, aux doses et selon les schemas employes. Aux Philippines, le meme vaccin Inaba a vibrions entiers a egalement confere une protection contre le cholera Ogawa, pratiquement aussi importante que la protection obtenue avec le vaccin Ogawa a vibrions entiers qui s'etait montre inefficace contre le chol&ra Inaba au Bangladesh. L'immunogenicite et 1'efficacite des anatoxines chol&riques purifi&es ont fait l'objet d'etudes pouss&es chez plusieurs modeles animaux et lors d'essais sur le terrain. Pour obtenir la detoxification, on a utilise a la fois le formol et le glutaraldehyde. Un essai a e realise au Bangladesh, en 1974, pour experimenter l'efficacite d'une anatoxine detoxifi&e par le glutaraldehyde et hautement purifiee, administree par voie parenterale. Cette anatoxine a suscite une elevation de l'antitoxine circulante au moins aussi importante que chez les convalescents du cholera clinique. Pourtant, la protection ainsi conferee a ete faible et provisoire. Une protection importante n'a e observee que dans le groupe d'age de 5 A 14 ans, pendant 90 jours environ. I1 est ainsi nettement etabli que l'immunite antitoxique suscit~e par injection de cette anatoxine par voie parenterale ne confere pas une protection d'un niveau suffisant pour etre int&ressante en sante publique. L'essai n'exclut pas la possibilite que d'autres formes de toxines, administrees par d'autres voies, puissent conferer une protection. En particulier, il n'exclut pas la possiblite qu'un anticorps secretoire local anti- toxique joue un r6le dans la resistance. Etudes du cholera et de la vaccination antichol6rique chez des volontaires Des renseignements extremement precieux sur l'immunologie du cholera ont e fournis par des etudes realisees sur des volontaires A qui l'on a admi- nistre des vibrions vivants. Le fait le plus important est que, apres retablissement, les sujets presentent pendant au moins deux A trois mois une protection pratiquement totale contre une nouvelle dose d'epreuve. La duree de l'immunite au-dela de cette periode n'a pas e convenablement determinee. Cette resistance presente une efficacite egale contre tous les s&rotypes, qu'ils soient heterologues ou homologues. La colonisation semble inhibee puisque, chez les volontaires resistants, on ne retrouve pas les vibrions d'epreuve au niveau de l'intestin grele. I1 est possible que l'enterotoxine soit le principal antigene commun responsable de la protection, mais cette inhibition apparente de la colonisation donne a penser que la toxine n'est pas le seul antigene en cause. L'immunisation de volontaires a l'aide de doses orales multiples tres elevees (8-24 mg) d'une anatoxine cholerique preparee par le glutaraldehyde n'a conf&re aucune protection contre le vibrion vivant administre par voie buccale. Chez environ deux tiers 264 IMMUNITE INTESTINALE ET ELABORATION DE VACCINS des volontaires, on a vu apparaitre une tres faible concentration d'antitoxine serique, mais aucune reponse locale. En revanche, dans la maladie naturelle ou provoquee, on observe presque toujours une reponse beaucoup plus nette en antitoxine s&rique: ces differences entre la reaction A l'infection et a l'anatoxine orale s'expliquent sans doute par des differences dans la forme de la toxine antigenique, le mode de presentation A la muqueuse et/ou la dose et le calendrier d'administration. On a egalement exp&rimente chez des volontaires des vaccins anticholeriques tues administres par voie buccale. Aux doses tres elev&es employ&es, on a obtenu une certaine protection contre une dose d'epreuve composee de micro-organismes vivants, mais cette protection demeure tres inferieure A celle dont beneficient les sujets precdemment malades. L'administration orale de doses massives d'un mutant vivant hypotoxinogene de la souche 569 B (M- 13) ne confere une protection qu'A 60% des volon- taires. Cette proportion relativement mediocre, si on la compare A celle que suscitent des souches pleinement virulentes, s'explique peut-&re par une deficience simultanee affectant l'un des facteurs de colonisation; il se peut aussi qu'une production de toxine suffisante pour provoquer la maladie soit n&cessaire pour assurer une production optimale d'antigene protecteur, quel qu'il soit. A la suite de ces observations faites sur des volon- taires, on peut dire que le but de la recherche sur les vaccins est clair: mettre au point un vaccin et un mode d'administration qui puissent conferer une protection aussi elev&e que celle qui resulte de la maladie. Diarrhee provoquee par des souches d'E. coli produc- trices d'enterotoxines (ETEC) La maladie diarrheique provoqu&e chez des volon- taires par l'infection orale au moyen d'une souche d'E. coli productrice d'enterotoxines thermolabiles (LT) et thermostables (ST) confere une protection elevee contre une dose d'&preuve formee de la meme souche. Au contraire, il n'existe aucune protection contre les autres serotypes d'E. coli qui produisent uniquement l'enterotoxine LT. Ces observations donnent A penser que, dans une diarrh& provoqu&e par les ETEC, l'immunite dirig&e contre les facteurs autres que les toxines peut jouer un role important dans la protection. Comme dans le cas du cholera, la dur& de l'immunite n'est pas connue. I1 n'existe aucun vaccin contre les diarrh&es A ETEC qu'on puisse utiliser chez l'homme. Des etudes epidemiologiques r&centes ont claire- ment montre que les ETEC constituent une cause importante de la <<diarrhee du voyageur>> dans differentes regions du monde. Par consequent, la mise au point d'agents immunogenes efficaces utilisables a titre prophylactique pourrait avoir des repercussions importantes en permettant de reduire A la fois l'incidence des maladies diarrheiques endemiques et des cas de maladie associes A un voyage dans une nouvelle region. Les premiers travaux consacres a la pathogenie, a la genetique et a l'immunologie des maladies aETEC ont e l'ceuvre de veterinaires qui etudiaient des diarrhees analogues chez les animaux domestiques. Une meil- leure comprehension des maladies A ETEC exigera que les chercheurs qui travaillent les uns sur les maladies humaines, les autres sur les maladies animales, continuent a collaborer et A confronter l'experience acquise grace a leurs travaux. Par exemple, on sait que l'immunisation de la truie par un facteur de colonisation, I'antigene K-88, confere au porcelet A la mamelle une protection contre une dose d'epreuve d'ETEC vivants. Ce phenomene vient corroborer les observations limit&es effectuees chez des volontaires selon lesquelles des anticorps diriges uniquement contre les antigenes somatiques protegent de la diarrhee a ETEC. I1 existe probablement d'importantes differences entre les mecanismes pathogenes et immunitaires des maladies diarrheiques provoquees par les souches <<ent&opathog&nes>> d'E. coli (EPEC) et par les souches ETEC. Cependant, dans l'etude de l'immu- nisation contre les infections A ETEC, il sera important de tenir compte des resultats fournis par les etudes limitees qui ont ket consacr&es a la vaccination contre les maladies A EPEC. C'est ainsi que, dans une etude realisee en Hongrie, on a constate que, chez le nouveau-ne, l'administration orale repetee de vaccins entiers tues prepares A partir des serotypes EPEC classiques (055, 086 et 0111) conferait dans 75% des cas une protection contre les diarrhes naturelles A EPEC, du deuxieme au sixieme mois de la vie. Au cours du premier mois, la protection n'etait que minime. Perspectives de la mise au point de vaccins Les etudes chez les animaux d'experience ont montre que, dans le cas du cholera, l'immunite anti- bacterienne et l'immunite antitoxique agissent en synergie pour conferer une protection contre la maladie a la suite de l'exposition de l'intestin a des vibrions vivants. Quand l'immunisation s'effectue au moyen d'une association d'un antigene somatique (vaccin a vibrions entiers ou lipopolyoside purifie) et d'un antigene sous forme de toxine (toxine cholerique, sous-unite B ou anatoxine preparee a l'aide de formol ou de glutaraldehyde), elle confere une protection qui est au moins egale au produit des protections fournies par chacun des deux immunogenes agissant isolement. I1 semble donc que l'association d'antigenes qui sont en soi capables de conferer une certaine protection 265 MEMORANDUM OMS puisse renforcer notablement leur pouvoir protecteur. Dans les vaccins anticholeriques a vibrions entiers tues qui sont actuellement en usage, le principal anti- gene protecteur est le complexe lipopolyoside- proteine du s&rotype Inaba et le lipopolyoside du s&o- type Ogawa. Cependant, sur les vibrions chol&iques viv#nts, il existe peut-etre d'autres antigenes superfi- ciI s capables de susciter l'apparition d'anticorps piotecteurs qui inhibent le processus complexe de colonisation. Ces antigenes peuvent comprendre la flagelline, la gaine du flagelle et des structures adhesives ou chimiotactiques encore non identifiees pour une grande part. I1 se peut aussi que des anticorps diriges contre des produits extracellulaires comme la mucinase et la neuraminidase contribuent A la protec- tion. Le role protecteur de l'immunite antitoxique semble important, a en juger par des experiences sur les animaux dans lesquelles l'immunisation au moyen de toxines hautement purifi&s a conferr une protec- tion substantielle contre des doses d'epreuve de vibrions chol&iques vivants ou de toxines preform&es. La toxine chol&ique constitue un agent immunogene d'une efficacite inhabituelle du fait qu'elle possede des proprietes inherentes d'adjuvant grace a sa capa- cite de stimuler l'adenylate-cyclase. Pour la vacci- nation par voie buccale, elle presente en outre l'avantage sur la plupart des autres antigenes de pouvoir se lier avec avidite A l'epithelium intestinal. I1 est tout a fait improbable qu'une toxine puisse conserver cette propriete d'adjuvant quand elle est transform&e en anatoxine. Le meilleur element a priori utilisable comme agent immunogene non vivant d&eiv d'une toxine, speialement pour un emploi par voie buccale, est sans doute la sous-unite B purifiee. Elle renferme les principaux determinants antigeniques protecteurs de la toxine, se lie aussi bien que la toxine a la membrane intestinale et ne presente aucun risque de retour a la toxicite puisqu'il lui manque l'effecteur toxique, la sous-unite A. L'immunisation de lapins A l'aide de la sous-unite B purifiee a donne des resultats prometteurs. En vue de mettre au point des agents immunogenes protecteurs contre les maladies a ETEC, il est impoitant d'identifier les antigenes qui sont responsa- bles de la bonne protection contre une nouvelle injec- tion d'epreuve homologue que l'on observe chez les volontaires apres la maladie clinique. I1 s'agit apparemment d'une immunite antibacterienne et non d'une immunite antitoxique, et l'on peut a priori concevoir comme m&anisme immunitaire n'importe quelle combinaison d'anticorps qui entravent l'attrac- tion chimiotactique des bacteries par la muqueuse, la penetration du mucus, l'adherence A la bordure en brosse et la multiplication in situ. Etant donne le grand nombre de s&otypes d'E. coli, il est probablement imperatif pour la mise au point d'un vaccin d'identifier un ou plusieurs antigenes somatiques qui soient communs a la plupart des ETEC. Un antigene important qui entre dans cette categorie est manifeste- ment l'antigene LT, dont la structure est etroitement apparentee A celle de la toxine cholerique, sans lui ere identique. L'homologue de B dans LT constitue donc en principe un agent immunogene interessant a inclure dans un vaccin ETEC tue. I1 est egalement possible que la reactivite croisee entre l'antigene LT et la toxine cholerique soit suffisante pour que les sous-unites B de cette toxine conferent egalement une certaine protec- tion contre les maladies a ETEC, tout particuliere- ment chez les personnes qui ont subi leur premiere exposition a LT par voie naturelle. Dans le cas du cholera aussi bien que des diarrhees a ETEC, un vaccin buccal vivant non pathogene pour- rait constituer l'agent immunogene ideal. De telles souches vaccinales doivent conserver leur capacite de colonisation et posseder d'aussi nombreux antigenes protecteurs que possible A l'exception, bien entendu, de la toxine active. Ces vaccins vivants pourraient etre formes de souches non pathogenes existant a l'etat naturel ou obtenues par diverses manipulations gen& tiques. VACCINS ANTITYPHOIDIQUES I1 n'existe ni modele animal ni epreuve in vitro qui permettent de prevoir avec certitude le degre de pro- tection confere A l'homme par les vaccins anti- typhoidiques. Lors d'essais controles sur le terrain on a releve une correlation entre le niveau des anticorps H et le degre de protection; en fait, lors d'un essai r&ent ou l'on experimentait un vaccin denue d'antigene H, aucune protection n'a e observee. I1 semble donc que cet antigene ait un role protecteur. Toutefois, il se pourrait qu'il ne soit qu'un marqueur d'un <<antig&ne protecteur>> thermolabile, non encore identifie. Vaccins administres par voie parenterale Vaccins d germes entiers. Des essais controles r'oalisMs chez l'adulte dans des zones d'endemie ont aonne les resultats suivants: vaccin inactive par l'acetone (2 doses)-70-8507o de protection pendant 3-4 ans; vaccin inactive par le phenol et la chaleur (2 doses)-70-75% de protection pendant environ 3 ans; vaccin inactive par l'alcool (2 doses)-environ 600o de protection pendant 1 a 2 ans. Ainsi, ces vaccins antityphoidiques peuvent etre d'un emploi interessant dans les zones de forte endemicite. En revanche, il convient de mettre fin a l'utilisation des vaccins anti- typho-paratyphoidiques A et B (vaccin triple associe TAB) pour les raisons suivantes: 1) l'incidence de la paratyphoide A et B est generalement faible; 2) l'immunogenicite du vaccin antiparatyphoidique A pour l'homme n'a jamais e prouvee dans une etude control&e sur le terrain; et 3) les resultats des essais 266 IMMUNITE INTESTINALE ET ELABORATION DE VACCINS controles sur le terrain ont clairement montre qu'il faudrait administrer au moins 7,5 x 108 germes de Salmonella paratyphi B pour obtenir une protection notable; mais si l'on ajoutait cette quantite de S. para- typhi B au vaccin antityphoidique (qui renferme 1 x 109 S. typhi), on obtiendrait un vaccin associe de reactivite inacceptable. Vaccins chimiques exempts de germes (types Boivin, Raistrick-Topley et Westphal). Les essais controles realises sur le terrain A l'aide de ces vaccins ont fait apparaitre des variations considerables de la protection conferee; en general, les vaccins de ce type sont moins efficaces que les vaccins A base de germes entiers. Vaccins administre's par voie buccale Vaccins inactives. Bien que ces vaccins soient employes de longue date dans plusieurs pays, leur effi- cacite chez l'homme n'a pas ete demontree. Lors d'essais sur le terrain realises au Chili, on a obtenu des resultats contradictoires et, en Inde, trois essais n'ont fait apparaitre aucune protection. Chez les volon- taires, une certaine protection a pu etre mise en evi- dence quand on emploie des doses elvees et repetees. Vaccins vivants. On en connait actuellement deux: a) Vaccin streptomycino-dependant: un vaccin de ce type a ete mis au point et il s'est reve1e d'emploi sur chez des volontaires mais d'efficacite variable. b) Vaccin depourvu de galactose-epimerase: il manque A ce vaccin une enzyme, l'UDP-4-galactose- epimerase, ce qui empeche la synthese normale du lipopolyoside de la paroi cellulaire; sur des volon- taires, ce vaccin s'est revele sur et il a confer& une pro- tection dans 87% des cas; un essai sur le terrain est en cours en Egypte. Role de l'immunite d mediation cellulaire S. typhi est une bacterie intracellulaire; par conse- quent, comme pour d'autres bacteries du meme type, par exemple Brucella, Listeria et Mycobacterium tuberculosis, l'immunite A mediation cellulaire joue un role important dans la resistance. Recemment, l'epreuve d'inhibition de la migration des leucocytes a montre que cette immunite se manifeste de faqon plus intense chez les malades atteints de fievre typhoide que chez les sujets immunises a l'aide du vaccin TAB inactive par la chaleur et le phenol. VACCINS ANTI-SHIGELLA Vaccins anti- S. flexneri et anti- S. sonnei Vaccins administres par voie parenterale. Les nombreux essais realises A l'aide de vaccins A germes entiers ou de vaccins exempts de germes se sont soldes par un echec total. Vaccins administres par voie buccale a) Vaccins buccaux inactives. Administre A doses repetees A des singes Macaca mulatta, un vaccin poly- valent du type Boivin (S.flexneri 2a, 3a, 4a, 6, et S.sonnei) a confere aux animaux d'experience une protection importante contre une injection d'epreuve d'une souche virulente S.flexneri 2a. Lors d'un vaste essai sur le terrain (non contr6le'), l'administration A des enfants d'un vaccin A base de S. sonnei renfermant des bacteries desintegrees a provoque un certain recul de la morbidite. Ces vaccins ont ete administres A doses tres importantes et renouveles. b) Vaccinsbuccaux vivants. Lors d'essais degrande ampleur sur l'enfant ou l'adulte, un vaccin polyvalent streptomycino-dependant (S.flexneri 2a et 3, et S. sonnei) a confere une importante protection speci- fique du serotype, mais le risque de reversion n'a pas pu etre exclu. Les possibilit6s d'application pratique du vaccin sont reduites par le grand nombre et l'importance des doses qu'il est necessaire d'administrer (avec du bicarbonate) pour obtenir une protection. Une nou- velle generation de vaccins anti-Shigella hybrides attenues (S. flexneri 2a et S. dysenteriae 1 attenue par incorporation d'un chromosome de E. coli; E. coli portant des antigenes superficiels de S.flexneri) a ete experimentee, par voie buccale, sur des volontaires. Ces vaccins ont ket bien toleres, mais aucune protec- tion n'a pu etre mise en evidence. Vaccin a base de S. dysenteriae I S. dysenteriae 1 a rcemment provoque en Ame- rique centrale et dans certaines regions de l'Asie du Sud-Est d'importantes epidemies marquees par un taux de letalite relativement eleve; les complications generales etaient particulierement severes. L'injection par voie parenterale d'une anatoxine de Shiga a recemment ete experimentee sur des singes; aucune protection ne s'est manifestee lors de l'admi- nistration par voie orale d'une dose d'epreuve conte- nant des germes vivants. Aucun autre vaccin n'a e't experimente contre S. dysenteriae 1. VACCINS CONTRE LES DIARRHEES VIRALES Point des connaissances actuelles La connaissance de l'etiologie des gastro-enterites infectieuses aigues d'origine non bacterienne a recem- ment fait d'importants progres grace a la decouverte de deux nouveaux groupes d'agents associes A ce syndrome. Le premier groupe, dont le prototype est 267 MEMORANDUM OMS constitue par les particules Norwalk de 27 nm, a e associ& A des pouss&es epidemiques A l'&cole, dans la communaute ou dans le milieu familial, frappant essentiellement des enfants d'age scolaire et des adultes. La maladie provoquee par ce groupe d'agents prend gen&ralement fin spontanement, au bout d'environ 24 A 48 heures. La duree classique de la p&iode d'incubation est egalement de 24 A 48 heures. Chez des residents des Etats-Unis d'Amerique, des etudes sur la prevalence des anticorps, mesuree A l'aide de l'epreuve d'hemagglutination par immuno- adherence, ont montre que des anticorps seriques diriges contre l'agent Norwalk apparaissent progres- sivement et sont presents chez 5070 des sujets de 40 A 50 ans. L'etude des agents Norwalk est entravee par l'impossibilite de les faire pousser en culture cellulaire, ce qui n&cessite le recours A la microscopie electro- nique, classique ou immunitaire, pour les detecter. I1 apparait aujourd'hui que ce groupe d'agents com- porte trois serotypes-Norwalk, Hawai et Ditchling- et peut-etre un quatrieme, l'agent «cockle»). Deux autres agents similaires, l'agent MC (Montgomery County) et l'agent W, sont respectivement apparentes a l'agent Norwalk et a l'agent Ditchling. Toutes ces particules ont une densite de flottation comparable en chlorure de cesium (1,37-1,41 kg/litre), les agents Norwalk et W sont tous deux stables vis-A-vis de l'ether et l'agent Norwalk est en outre acidoresistant et relativement ther?ostable. Ces proprietes ainsi que la morphologie des agents du groupe Norwalk ont conduit A l'idee qu'il s'agissait peut-atre de micro- organismes analogues aux parvovirus. I1 s'agit d'une classification toute provisoire, puisqu'on ne sait meme pas si leur acide nucleique est I'ADN (comme pour les parvovirus) ou l'ARN. L'autre forme de gastro-enterite non bact&rienne, plus importante, a e associee A une infection par des rotavirus de 70 nm et se caract&rise par une diarrh&e severe qui frappe essentiellement les nourrissons et les jeunes enfants de 6 A 24 mois et exige parfois la compensation des pertes hydriques, par voie parent& rale ou buccale. Dans cette forme de gastro-enterite, le taux de morbidite chez les contacts familiaux des nourrissons et des jeunes enfants est faible, bien que l'infection infraclinique soit frequente. Contraire- ment au cas des agents Norwalk, les anticorps diriges contre les rotavirus apparaissent tot dans la vie, selon un schema analogue A celui du virus respiratoire syncytial et du virus paragrippal type 3. Les rotavirus constituent le principal agent etiologique de la gastro- enterite infantile puisque dans de nombreux pays au climat temp&re, jusqu'a 50% des cas de diarrhee du nourrisson ou du jeune enfant exigeant une hospitali- sation lui sont associes. L'infection A rotavirus presente un caractere epidemiologique inhabituel, sevissant generalement pendant les mois les plus froids de l'annee dans les climats temperes. Les maladies A rotavirus sont egalement frequentes dans les pays tropicaux ou l'on en a fait la recherche. La dur&e d'incubation est d'environ deux jours. Chez le nouveau-ne, on observe normalement, sans qu'on connaisse les raisons, un rapport infection: cas eleve et une faible morbidite. Peu d'etudes ont e consacrees aux infections A rotavirus qui provoquent une gastro- ent&rite chez le jeune enfant et le nourrisson mais sans exiger l'hospitalisation; cependant, il semble que les rotavirus jouent un role important dans les episodes de diarrhee mod&ree. Il existe au moins deux serotypes de rotavirus humain, designes provisoirement sous le nom de type 1 et type 2. Leur detection, qui se faisait initiale- ment au microscope electronique, est maintenant possible par de nombreuses methodes, la technique ELISA etant probablement la plus efficace et la plus commode. On a decouvert des rotavirus dans les excreta de nombreux animaux atteints de diarrh&e-veau, souri- ceau, poulain, agneau, lapin, daim et antilope-, dans les excreta d'un singe normal et dans les produits de lavement intestinal de mouton et de bovin. En outre, l'administration de rotavirus humains aux animaux nouveau-nes prives de colostrum provoque une maladie diarrheique chez le veau et l'agneau gnoto- biotiques, le porcelet gnotobiotique ou normal et le singe rhesus. Les cultures cellulaires se sont revelees tres efficaces pour faire pousser divers rotavirus animaux, mais inefficaces dans le cas des rotavirus humains. Perspectives de l'immunoprophylaxie dans le cas des agents viraux de la gastro-enterite La mise au point d'un vaccin contre les rotavirus constitue un aspect prioritaire de l'immunopro- phylaxie des maladies diarrheiques du nourrisson et du jeune enfant. Cependant, il convient tout d'abord de comprendre les mecanismes immunitaires de defense contre l'infection A rotavirus. Des etudes sur l'animal (veau, porcelet et agneau) ont montre que les anticorps intestinaux jouent un role important dans la prevention des maladies A rotavirus ou dans l'am&- lioration des symptomes. Lors d'etudes particuliere- ment bien conduites sur l'agneau pris comme modele, l'administration avec les aliments d'anticorps diriges contre les rotavirus a reussi A induire une resistance vis-A-vis d'une dose d'epreuve de rotavirus donnee par voie buccale alors que les anticorps circulants ne suffi- saient pas A assurer une protection. En outre, il ressort d'etudes sur des volontaires que la resistance A une dose d'epreuve de rotavirus presente une correlation plus etroite avec le titre des anticorps intestinaux IgA qu'avec le titre des anticorps seriques. II apparait ainsi que les anticorps presents a la surface epitheliale de 268 IMMUNITE INTESTINALE ET ELABORATION DE VACCINS l'intestin grele constituent un element primordial de la resistance aux maladies A rotavirus. Par consequent, une methode possible pour aborder l'immunopro- phylaxie des infections A rotavirus serait de mettre au point un vaccin buccal capable de stimuler l'appari- tion d'une quantite suffisante d'anticorps IgA locaux au niveau de l'intestin. La realisation de cet objectif se heurte pourtant a plusieurs difficultes. Un grave probleme tient a l'incapacite d'entretenir correctement les rotavirus humains en culture cellulaire, ce qui empeche actuelle- ment de produire suffisamment d'antigenes humains pour les etudes de mise au point de vaccins. Une autre difficulte tient au probleme de la duree de l'immunite. Les adultes sont frequemment reinfectes par des rota- virus, alors que la maladie clinique est rare. On peut etre perplexe quand on considere les resultats d'une experience conduite avec l'agent Norwalk: des adultes volontaires qui avaient contracte la maladie lors d'un premier contact avec l'agent sont de nouveau tombes malades lors d'une epreuve de controle pratiquee 27 A 42 mois plus tard au moyen d'une souche identique, ce qui laisse penser que l'immunite est de courte duree. L'existence de deux serotypes des rotavirus humains complique encore le probleme de l'immunopro- phylaxie puisque, du moins a en juger d'apres les resultats preliminaires, il n'existe pas de protection croisee entre eux. Par consequent, un vaccin anti-rota- virus devrait comporter au moins ces deux antigenes, sans d'ailleurs que l'existence d'autres serotypes soit exclue. La mise au point d'un vaccin contre les rotavirus peut s'envisager de diverses faqons. Une strategie consisterait A utiliser un rotavirus animal, par exemple le rotavirus isole chez le veau, s'il est possible de trouver une souche animale qui puisse infecter l'homme sans le rendre malade, mais tout en suscitant l'apparition d'anticorps protecteurs. Les rotavirus humains et animaux ont en commun certains anti- genes, mais on peut les differencier au moyen de diverses epreuves, par exemple l'analyse des schemas de migration de I'ARN par electrophorese en gel de polyacrylamide et certaines techniques serologiques. Cette approche s'est montree prometteuse chez le veau pris comme modele, puisqu'une injection in utero d'un rotavirus de veau a permis d'obtenir une protec- tion contre une dose d'epreuve de rotavirus humains le jour du velage ou le jour suivant. Des vaccins de ce type devront faire l'objet d'experiences soigneuses sur divers modeles animaux pour en verifier l'innocuite et l'applicabilite avant qu'on puisse, s'ils se revelent sfirs et efficaces, proceder aux premieres experiences sur des volontaires presentant un taux preexistant eleve d'anticorps diriges contre les rotavirus (de preference des IgA dans les liquides intestinaux). La mise au point d'une souche de cette nature se poursuit actuellement. Etant donne que le virus humain ne pousse pas suffisamment bien en culture cellulaire pour qu'on puisse entreprendre des etudes de mise au point de vaccins, on pourrait envisager la production d'un hybride par recombinaison genetique avec un rota- virus animal, par exemple celui du veau, pour lequel ce mode de culture est au contraire possible. L'ideal serait que l'hybride conserve sa capacite de croissance en culture cellulaire tout en possedant les antigenes capsidiques exterieurs des rotavirus humains. Cette methode genetique est en cours d'exploration. Une autre approche qu'il convient d'approfondir consisterait A utiliser le lait maternel pour prevenir ou modifier les infections A rotavirus. On a en effet trouve dans le colostrum et le lait maternel de plusieurs populations des anticorps IgA sp&cifiques diriges contre les rotavirus. Par ailleurs, on a signale que ces infections sont nettement moins frequentes en cas d'alimentation au sein qu'en cas d'alimentation au biberon. Cependant, il n'a pas e possible de verifier l'effet exerce sur le cours de la maladie puisque, dans les deux cas, elle est le plus souvent inapparente, ce qui prouve qu'un autre mecanisme intervient pour contenir l'infection. L'utilisation du lait maternel pour assurer une immunoprophylaxie passive contre les infections A rotavirus necessite donc de nouvelles etudes. En outre, il convient d'etudier l'importance des rotavirus en tant qu'agents enteropathogenes dans les pays en developpement, de facon A determiner avec precision leur part relative dans l'incidence globale des maladies diarrheiques, ainsi que leur histoire naturelle sur une periode relativement longue. Cependant, il ne faudra pas attendre ces resultats pour s'attaquer A la solution des problemes de la production de vaccins puisqu'il est clair que les rotavirus constituent un agent etiologique important, sinon l'agent principal, de la diarrhee chez le nourrisson et le jeune enfant. PROMOTION ET EXECUTION DE LA RECHERCHE Le plan d'execution de l'element (<recherche>> du programme OMS de lutte contre les maladies diar- rheiques, qui etait en cours d'elaboration, a e soumis a l'examen du groupe de travail scientifique qui en a approuve la forme. L'accent a et mis en particulier sur la diffusion de l'information concernant les modalites de l'execution du programme et ses objec- tifs, notamment parmi les pays en developpement par 269 270 MEMORANDUM OMS I'intermediaire des bureaux regionaux, en vue de faci- liter l'identification des chercheurs et des institutions les mieux a meme de participer au programme. Le groupe a estime que les institutions qui se montrent interess&es par tel ou tel domaine de recherche devraient recevoir une assistance en vue de la mise au point de protocoles de recherche. II a en outre e convenu qu'une methode uniforme etait n&essaire pour evaluer les propositions de recherche. Le groupe a recommande qu'on mette au point une presentation type qui serait utilisee par les institutions candidates pour decrire les recherches propos&s.° RECHERCHES NECESSAIRES Selon le groupe de travail scientifique, des re- cherches complementaires sont n&cessaires dans les domaines suivants: DIARRHEES PROVOQUEES PAR LE VIBRION CHOLtRIQUE, LES VIBRIONS NON CHOLERIQUES ET LES SOUCHES D'E. COLI PRODUCTRICES D'ENTEROTOXINES (ETEC) Mecanismes de defense immunitaire et antigenes pro- tecteurs I1 est necessaire de definir avec davantage de pr&e cision les structures somatiques bacteriennes et les produits extracellulaires qui sont importants du point de vue de la pathogenie et/ou de l'etablissement de l'immunite. Ces connaissances sont essentielles pour pouvoir choisir de faqon plus rationnelle les elements a priori utilisables pour l'&eaboration de nouveaux vaccins. Des m&hodes devront ere mises au point pour d&celer les anticorps diriges contre toutes les structures ou produits de micro-organisme qui jouent un role dans la pathogenie. Ces methodes doivent com- prendre des techniques de titrage des anticorps diriges contre les divers facteurs de colonisation qui intervien- nent dans l'attraction chimiotactique de la bacterie par la muqueuse, la penetration dans le mucus, I'adh&- rence A la bordure en brosse et la multiplication in situ. I1 convient egalement d'ameliorer les epreuves de titrage des anticorps diriges contre les enterotoxines et leurs sous-unites, notamment pour la toxine cholerique, E. coli LT et les toxines des vibrions non choleriques. Des epreuves simples applicables A ces anticorps, dans le serum et dans le liquide intestinal, sont necessaires pour l'ex&ution d'etudes sero-epid& miologiques. Enfin, il est manifestement indispen- sable de disposer d'une epreuve in vitro applicable a E. coli ST et de realiser des etudes pour verifier si, dans certaines conditions, cette toxine de faible masse moleculaire peut etre immunogene. Le cours naturel de la maladie clinique provoqu&e par V. cholerae, les ETEC et les vibrions non chol& riques doit etre determine par des etudes epidemiolo- giques et sur des volontaires; plusieurs points sont a preciser: a) intensite et dur&e de la protection immunitaire contre les organismes homologues; b) protection croisee contre les organismes hetero- logues (par exemple, l'immunite a l'egard du cholera confere-t-elle une resistance contre les maladies A E. coli LT?); et c) intensite et dur&e de la premiere stimulation du systeme immunitaire de la muqueuse n&essaires pour assurer une reponse immunitaire secondaire (par exemple, une diarrhee A E. coli LT constitue-t-elle une premiere exposition efficace pour obtenir une reponse secondaire en presence d'anatoxines choleriques ou de sous-unites de toxines?). Methodes destimulation de l'immunit au niveau de la muqueuse I1 est n&essaire d'etudier des methodes qui permet- traient de declencher au niveau de la muqueuse une reponse de protection immunitaire, en particulier d'evaluer divers antigenes, voies d'administration et adjuvants, et de trouver le moyen de prolonger A la fois la reponse immunitaire proprement dite et la memoire qui assure la reponse a une stimulation ulte- rieure; le role de chacun de ces deux derniers aspects dans la prolongation de la protection devrait etre etudie. Des etudes sont n&cessaires pour definir des moyens pratiques de mesurer l'immunite au niveau de la mu- queuse chez l'homme. Ces etudes doivent comporter l'examen de secretions extra-intestinales, telles que la salive et le lait maternel, pour determiner si elles donnent un reflet de l'immunite intestinale. II con- vient d'etudier les anticorps presents dans le lait maternel pour voir s'ils fournissent un reflet de l'immunite intestinale de la mere et assurent une pro- tection immunitaire a l'enfant, qui pourrait etre renforcee par l'immunisation de la mere selon un schema determine. a Depuis la reunion du groupe de travail scientifique, des fonds importants ont e mis a la disposition de l'OMS pour des recherches aux fins de la mise au point de vaccins contre les maladies diar- rheiques. La presentation type dont il est ici question est maintenant a la disposition des chercheurs et des institutions desireux de solliciter une aide pour des etudes conformes aux recommandations du groupe. Les int&esses sont invites a se mettre en rapport avec le Directeur du programme de lutte contre les maladies diarrheiques, OMS, Geneve; Ia formule de proposition de recherche et les details complets de l'lO& ment ((recherche>) du programme leur seront adresses sur demande. IMMUNITE INTESTINALE ET ELABORATION DE VACCINS L'Uventail des reponses immunitaires observees dans les differentes populations est A preciser. 11 faudrait non seulement effectuer des comparaisons entre les habitants de regions d'endemie et ceux d'autres regions, mais egalement determiner l'influence eventuelle de l'age, de l'etat nutritionnel, des facteurs genetiques et des infections microbiennes et parasitaires accessoires. Developpement de modeles animaux Un modele plus satisfaisant que ceux dont on dispose actuellement pour etudier la pathogenie et l'immunite protectrice dans le cholera et les diarrhees A ETEC est tres necessaire. Ce modele devrait utiliser l'intestin non ligature d'animaux adultes intacts. Dans de nombreux cas, l'etablissement d'un tel modele faciliterait grandement la poursuite des etudes recom- mandees ci-dessus. Agents immunisants Des systemes d'analyse biologique et genetique devraient etre appliques A V. cholerae et aux ETEC en vue de parvenir A une comprehension preise des facteurs qui sont associes A la virulence et A la pro- tection. L'application de ces connaissances faciliterait un choix rationnel des antigenes A inclure dans les vaccins. De nouveaux agents immunogenes, perfectionnes, doivent etre mis au point; ils devraient comprendre les categories suivantes de materiaux: a) des agents immunogenes non vivants, compre- nant des vaccins A base de micro-organismes entiers, des produits extracellulaires bruts et des produits somatiques ou extracellulaires purifies, tels que des lipopolyosides ou des antigenes derives de toxines; b) des vaccins vivants, formes soit de souches non pathogenes rencontrees a l'etat naturel, soit de mutants ou de recombinants produits en laboratoire; les souches «candidates>> A la preparation de vaccins vivants devraient posseder des marqueurs genetiques selectifs permettant de les differencier des souches sauvages. II convient de poursuivre l'evaluation, sur des animaux d'experience et sur des volontaires, de la synergie obtenue avec deux ou plusieurs agents immu- nogenes. Cela facilitera l'elaboration de vaccins non vivants associes (par exemple vaccin contre le cholera ou les diarrhees A ETEC contenant a la fois des anti- genes somatiques et des antigenes derives des toxines comme les sous-unites B), ainsi que l'identification des antigenes qui sont necessaires dans les souches de vaccins vivants. RECOMMANDATIONS POUR LA POURSUITE DE L'ELABORATION DE VACCINS ANTITYPHOiDIQUES Vaccins administres par voie parenterale Comme les vaccins actuellement en usage provo- quent des reactions assez intenses et ne conferent pas une protection complete, il est necessaire de les am& liorer. Des methodes d'inactivation peu brutales seront utilis&es pour preparer des vaccins qui soient immunogenes tout en provoquant moins de reactions; des vaccins de ce type ont e recemment mis au point en URSS: il conviendrait d'etudier leur efficacite au moyen d'essais controles sur le terrain. Une autre approche pour mettre au point un vaccin ne declen- chant pas de reactions consisterait a isoler les structures glucidiques de l'antigene 0 exemptes du lipide toxique A, ou A preparer ces structures par voie de synthese, puis A les coupler a une proteine de trans- port pour les rendre immunogenes; des etudes con- formes A ce schema sont en cours en Suede. Comme les reactions provoquees par l'injection intradermique de vaccin antityphoidique sont tres faibles, il con- viendrait de comparer, lors d'une etude controlee sur le terrain, la vaccination par voie intradermique et la vaccination par voie sous-cutan&. Dans ce genre d'etude, il est necessaire de comparer aussi bien les doses que les voies d'administration. Vaccins buccaux inactives Jusqu'ici, les vaccins antityphoidiques buccaux inactives qui ont e experimentes se sont montres d'une efficacite douteuse; il convient d'en poursuivre l'Ftude. La preference devra aller A des preparations dot&es d'une plus grande antigenicite chez les ani- maux. D'autres orientations sont possibles pour les recherches: a) essai de differentes methodes d'inacti- vation; b) amelioration des methodes (schemas) d'application, par exemple primovaccination par voie parenterale et rappel par voie buccale; et c) utilisation d'adjuvants actifs par voie buccale. Vaccins buccaux vivants Comme il n'existe malheureusement aucun modele de laboratoire pour reconnailtre l'attenuation de la virulence chez S. typhi, un modele de ce type doit etre mis au point. On poursuivra les tentatives en vue d'isoler, par les methodes de la genetique, des souches immunogenes stables. Les efforts tendant A evaluer le nouveau vaccin depourvu de galactose-epimerase devront etre poursuivis. Analyse du role de l'immunite a mediation cellulaire I1 est important de mettre au point des methodes simples qui permettent d'eprouver l'immunite A 271 MEMORANDUM OMS mediation cellulaire dirigee contre le bacille de la typhoide. I1 faudrait notamment etudier la possibilite de preparer A cette fin un antigene pour cutireaction analogue a la tuberculine. Les vaccins potentiels devraient &re mis a l'epreuve pour voir s'ils possedent la capacite de stimuler l'immunite de ce type. RECOMMANDATIONS POUR LA POURSUITE DE L'ELABORATION DE VACCINS ANTI-SHIGELLA Vaccins buccaux inactives Les vaccins buccaux inactives se sont jusqu'ici montres inefficaces contre la shigellose; le perfection- nement des methodes de preparation de ce type de vaccin ne merite peut-&re pas la priorite. Vaccins buccaux vivants I1 semble que, pour provoquer la maladie et susciter en meme temps l'apparition de la resistance, il faut qu'il y ait colonisation, penetration et multiplication dans les cellules epitheliales. La penetration est absente avec les souches vaccinales attenuees actuelles. Le recours aux techniques de la genetique permettrait peut-&re d'elaborer des souches qui ne p&netreraient pas A l'int&rieur de la muqueuse et, par consequent, ne provoqueraient pas la maladie, mais seraient capables de coloniser la surface de la muqueuse en constituant un stimulus antigenique suf- fisant pour assurer la protection. La mise au point d'un vaccin vivant, sur et efficace, contre S. dysen- teriae serait particulierement pr&cieuse. L'importance des enterotoxines de Shigella dans la pathogenie de la shigellose de tous les serogroupes doit ere elucidee, et des etudes doivent ere realisees en vue de definir la duree de l'immunite intestinale a l'egard de la maladie naturelle. DIARRHEES A VIRUS Etudes epidemiologiques I1 convient de realiser des etudes epidemiologiques, tout particulierement du type longitudinal, pour determiner l'incidence des diarrhees provoquees par des agents viraux sp&cifiques. De la sorte, il sera possible de determiner l'importance relative des divers agents et de fixer les priorites en consequence. II est necessaire de determiner l'importance des maladies a rotavirus dans diverses populations et de pr&ciser l'eventail de ces maladies. Ces informations de base sur l'histoire naturelle des infections a rota- virus sont essentielles pour determiner quelles seraient les populations qui tireraient le plus grand profit de la mise au point de vaccins. Les etudes permettraient de determiner a) le nombre de s&otypes et la presence de differences antigeniques mineures; b) la frequence des reinfections; c) les groupes d'age les plus severement frappes; et d) l'importance a long terme des rotavirus pour la sante infantile. Des reactifs de reference permettant l'application aux rotavirus de la technique ELISA devraient &re fournis sous les auspices de l'OMS. Un approvisionne- ment plus abondant en reactifs de ce type faciliterait les etudes epidemiologiques et serait particulierement important pour la caracterisation des souches vacci- nales envisageables pour la preparation de vaccins. Rotavirus Les rotavirus humains ne croissent pas suffisam- ment bien pour atteindre les titres importants que n&cessiterait leur emploi direct dans la mise au point d'un vaccin; il convient donc d'accorder une priorite elevee A l'etude de methodes assurant une reproduc- tion plus efficace de ces organismes. Les anticorps IgA intestinaux diriges contre les rota- virus revatent une importance decisive dans la pr& vention des maladies occasionn&es par ces virus; il convient cependant de realiser des etudes compl& mentaires pour etablir la dur&e de la reponse immuni- taire et trouver des moyens de renforcer cette reponse. Les titres d'anticorps anti-rotavirus doivent etre etudi&s dans des s&retions telles que la salive et le lait maternel pour d&terminer s'ils refletent correctement le titre des anticorps dans le liquide de l'intestin grele. Dans une maladie ou les anticorps locaux au niveau de l'intestin jouent un role aussi important dans la resistance, il est difficile d'expliquer le faible taux de morbidite chez les nouveau-nes infectes. Le meca- nisme de cette resistance doit ere etudie. Des eudes longitudinales doivent etre realisees pour determiner le role de l'alimentation maternelle dans l'histoire naturelle des infections A rotavirus. L'etude doit porter sur les facteurs epidemiologiques, immunologiques et sociaux. Les connaissances ainsi rassemblees aideraient a prendre une d&cision con- cernant la pratique eventuelle de la vaccination contre les rotavirus chez les femmes en age de procr&er. L'administration passive d'anticorps anti-rotavirus par la voie digestive a suscite chez divers modeles animaux l'apparition d'une resistance a une dose d'epreuve de rotavirus: on pourrait donc envisager d'etudier chez l'homme l'effet de l'administration per os d'anticorps diriges contre les rotavirus humains. Une autre approche consisterait dans l'administration buccale d'un «lait immun>> de vache (qui contient des anticorps anti-rotavirus). I1 faut rechercher un animal chez qui la maladie puisse ere provoquee au-dela du debut de l'existence. Ce point est important pour l'&tude de l'innocuite et 272 IMMUNITE INTESTINALE ET ELABORATION DE VACCINS 273 de 1'efficacite des vaccins envisages contre les rotavirus. Agents du groupe Norwalk De nouveaux efforts doivent etre faits pour trouver des modeles animaux permettant l'tude des maladies provoqu&es par les agents du groupe Norwalk. L'absence d'immunite A long terme contre ces agents qu'on observe chez des volontaires souleve des problemes qui laissent perplexe en ce qui concerne l'immunite intestinale. I1 convient d'elucider les raisons du phenomene. Autres agents viraux I1 faudra poursuivre les efforts pour rechercher et caracteriser d'autres agents viraux qui seraient associes a la gastro-enterite a virus et pour en deter- miner l'importance. RECOMMANDATIONS CONCERNANT LES ETUDES GtNtTIQUES I1 y a tout lieu de croire qu'il est possible de tirer parti des progres r&cents de la genetique microbienne et de la biochimie de l'ADN en les appliquant aux problemes pratiques de la mise au point de vaccins contre les infections intestinales. Cela exige une juste appreiation A la fois de l'utilite potentielle et des limitations de la methode genetique. Si l'on voit souvent dans la genetique un domaine technique complexe, il est en realite possible de realiser des croisements genetiques a l'aide de milieux bacterio- logiques moins complexes que ceux que l'on utilise au laboratoire pour poser le diagnostic des maladies intestinales. On peut rapidement acquerir une forma- tion qui permette d'effectuer une analyse plasmidique relativement detaillee des souches en employant des reactifs assez bon marche et en utilisant un materiel aussi peu complexe qu'un appareil permettant de fabriquer sur place des plaques de gelose et une source de courant continu. Et de fait, ces methodes ont deja e enseign&es, avec le soutien de l'OMS, A des techni- ciens et des cliniciens de pays en developpement qui ont pu les appliquer avec profit une fois de retour dans leur pays. II est par consequent recommande de continuer A encourager la formation conjointe et la collaboration des epidemiologistes, des immunologistes et des microbiologistes avec les experts de la genetique et de la biologie mol&culaire. En plus des etudes genetiques citees dans les sections qui precedent, plusieurs elements sont n&cessaires: a) un meilleur choix et une plus grande variete de souches donatrices et r&ceptrices bien caract&risees d'agents ent&ropathogEnes qui faciliteraient l'etude des d&terminants genetiques de la pathogenie; b) une meilleure caracterisation des plasmides Ent des ETEC de l'homme, et l'elucidation de leurs rela- tions avec ceux des animaux; c) des etudes sur la nature et la base genetique (chromosomique ou extrachromosomique) de la colonisation par les ETEC humains, V.cholerae et d'autres agents pathogenes intestinaux; et d) la dtermination du role eventuel des plasmides dans la pathogenie de la salmonellose, de la shigellose et du chol&a. MISE EN PLACE DE NOUVELLES POSSIBILITES D'EXPERIMENTATION SUR DES VOLONTAIRES DANS DES ZONES D'ENDEMIE OU DE NON-ENDEMIE Certaines questions concernant la pathogenie et l'immunite des diarrhees infectieuses, quelles qu'elles soient, ne peuvent recevoir une reponse definitive qu'au moyen d'etudes sur des volontaires. II est donc indispensable de mettre en place des moyens permet- tant de realiser ce genre d'etude dans des zones d'endemie ou de non-endemie. II faut pouvoir etudier ainsi: I) la reaction a une dose d'epreuve, administree par voie buccale, d'agents bacteriens ou viraux vivants pour pouvoir definir le cours naturel de la maladie; 2) la reponse immunitaire sous forme de l'appari- tion d'anticorps dans le serum ou les autres liquides organiques; et 3) la valeur de la protection assur&e par les divers vaccins A l'etude. Dans tous ces travaux, on devra respecter scrupu- leusement les regles de la deontologie pour choisir les volontaires et les informer de leurs droits. Les centres d'etude sur des volontaires doivent etre administres sous la direction de chercheurs locaux. L'examen des protocoles doit etre confie a des commissions locales de deontologie form&es de quelques personnalites qui ne prennent pas directement part au projet. * * D. Barua, medecin, service des Infections bacte- riennes et veneriennes, Organisation mondiale de la Sante, Geneve, Suisse P. Bres, chef du service des Maladies A virus, Organi- sation mondiale de la Sante, Geneve, Suisse J. P. Craig, Department of Microbiology and Immu- nology, Downstate Medical Center, State Univer- sity of New York, Brooklyn, New York, Etats-Unis d'Amerique 274 MEMORANDUM OMS S. Falkow, School of Medicine, University of Wash- ington, Seattle, Washington, Etats-Unis d'Am&- rique A. I. Goussev, medecin, service de l'Immunologie, Organisation mondiale de la Sante, Geneve, Suisse J. Holmgren, Departement de Bacteriologie, Institut de Microbiologie medicale, Universite de Gote- borg, Suede I. Joo, centre collaborateur OMS de reference et de recherche pour les vaccins bacteriens, Institut <<Human>> de Production et de Recherche sero- bact&iologiques, Budapest, Hongrie A. Z. Kapikian, Laboratory of Infectious Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Bethesda, Maryland, Etats-Unis d'Am& rique M. H. Merson, Laboratoire de Recherches sur le Cholera, Dacca, Bangladesh N. F. Pierce, Baltimore City Hospitals, Baltimore, Maryland, Etats-Unis d'Amerique A. Zahra, Directeur de la Division des Maladies trans- missibles, Organisation mondiale de la Sante, Geneve, Suisse