Détection des antigènes et des anticorps IgM pour le diagnostic rapide des infections virales : mémorandum OMS

Memoranda are state- Les Memorandums JA1sw1W1A X / / ments concerning the exposent les conclu-/IV[1GI IIkr n a conclusions or recom- sions et recomman- mendations of certain dations de certaines WHO scientific meet- reunions scientifiquesMll/7Dzm rXrrrorand s ings; they are signed de l'OMS; ils sontby the participants in signes par les partici- the meeting. pants a ces reunions. Bulletin de l'Organisation mondiale de la Sante, 58 (3): 417-422 (1980) Detection des antigenes et des anticorps IgM pour le diagnostic rapide des infections virales: Memorandum OMS* Le present Memorandum signale les progres intervenus recemment en ce qui concerne la mise au point de techniques de laboratoire rapides et simplifiees et examine les methodes actuellement utilisables pour la detection directe des antige'nes viraux dans du materiel clinique et/ou la quantification des anticorps constitues d'IgM dans des echantillons de serums preleves pendant la phase aigue des infections. II accorde une attention particuliere aux infections telles que l'hepatite virale, la gastro-enterite a rotavirus, les infections virales de la peau, des tractus genital et respiratoire et la rage. La standardisation et le controle de la qualite des reactifs sont egalement examines et un certain nombre de recommandations sont formulees. L'Organisation mondiale de la Sante a recemment porte son attention sur la mise au point de methodes de diagnostic rapide des infections virales, appli- cables dans les laboratoires des Etats Membres de l'OMS, notamment les laboratoires situes dans les pays en developpement. Deux reunions sur cette question, tenues en 1976 et 1977 (1, 2) ont permis de formuler des recommandations portant sur la mise au point et l'evaluation de diverses techniques, y compris les methodes d'immunofluorescence (IF) et d'immunoperoxydase (IP) et le dosage avec immuno- adsorbant lie A une enzyme (ELISA) pour la detec- tion des antigenes viraux dans du materiel clinique et des anticorps A l'egard des virus dans du serum humain. Des cours de formation et des etudes collec- tives ont ete organises. Entre temps, deux groupes se sont formes qui se preoccupent de faire progresser le diagnostic des infections virales en laboratoire: le * Le present Memorandum a e prepare par les signataires dont les noms figurent aux pages 421-422 a l'occasion d'une consultation informelle qui s'est tenue a la Ciba Foundation, a Londres, en decembre 1978. La version originale anglaise a e publiee dans le Bulletin de l'Organisation mondiale de la Sante, 57 (6): 925-930 (1979). Les demandes de tires a part doivent etre adressees a: Maladies a virus, Division des Maladies transmissibles, Organisation mondiale de la Sante, 1211 Geneve 27, Suisse. European Group for Rapid Laboratory Viral Diag- nosis (EGRLVD) et le Pan-American Group for Rapid Viral Diagnosis (PAGRVD). Ces deux groupes ont eu des reunions et travaillent en collaboration avec l'OMS a la recherche des solutions a apporter aux problemes. Le present Memorandum passe en revue les connaissances les plus recentes en matiere de techniques de detection rapide, dans du materiel clinique, des antigenes et des anticorps viraux, notamment les IgM, et formule des recommanda- tions concernant la standardisation et le contr6le de la qualite des reactifs, les etudes collectives et les programmes d'enseignement. MALADIES A VIRUS Hepatite virale Le diagnostic des infections a virus de l'hepatite A (HAV) est fonde sur la detection du virus dans les feces ou sur la determination des IgM sp&ifiques de 1'HAV dans un seul &hantillon de serum preleve pendant la phase aigue de la maladie. L'examen des 3959 -417- Mt4MORANDUM OMS feces pour deceler les HAV durant la phase aigue de la maladie est d'une valeur limitee car la plupart des HAV sont excretes dans les feces avant I'apparition de la maladie et il ne reste generalement que quelques particules virales au moment o'u se declare l'ictere. L'immuno-microscopie electronique (IEM), le dosage radio-immunologique (RIA) et le titrage immuno- enzymatique (EIA) sont des techniques tres sensibles de detection des HAV dans les feces, mais elles presentent toutes des inconvenients. L'IEM est une methode incommode qui n'est pas universellement applicable aux fins du depistage. Les methodes RIA et EIA permettent l'examen des selles A condition que les reactifs soient choisis avec soin pour assurer une specificite maximale, notamment dans les cas d'epi- demies ou les sujets qui excretent le virus dans les selles peuvent etre identifies avant l'apparition de la maladie et peuvent etre isoles de maniere appropriee. La meilleure methode de diagnostic clinique rapide de l'hepatite A consiste A detecter l'anti-HAV constitue d'IgM dans du serum preleve pendant la phase aigue de la maladie (3, 4). L'EIA comme le RIA peuvent etre modifies pour permettre la detection de l'anti-HAV constitue d'IgM et, en ce qui concerne le RIA, on peut se procurer dans le commerce le materiel necessaire pour executer la technique modifiee. Des techniques EIA et RIA sensibles et specifiques ont ete mises au point pour chacun des marqueurs de l'infection A virus de l'hepatite B (HBV), tels que HBsAg, anti-HBs, HBeAg, anti-HBe, HBcAg et anti-HBc; ces techniques sont disponibles dans le commerce ou le seront sous peu. Ces epreuves ont ete completees par une epreuve d'agglutination du latex pour HBsAg et une epreuve d'hemagglutination passive (PHA) pour HBeAg et anti-HBe; ces tests possedent une sensibilite suffisante. La determina- tion de l'HBsAg dans le serum est la pierre angulaire du diagnostic clinique des infections A HBV comme de la selection des donneurs de sang. Avant de pouvoir recommander l'emploi courant de l'HBeAg, I'anti-HBe, I'HBcAg et l'anti-HBc, il conviendra de mieux elucider leur importance clinique en tant que marqueurs serologiques de l'infectivite. A cet egard, il est particulierement important d'effectuer d'autres etudes concernant l'IgM anti-HBc. Apres une evaluation clinique plus approfondie, les epreuves de l'HBeAg et de I'anti-HBe pourraient se montrer d'une grande valeur pour estimer la gravite et l'evolu- tion probables de l'hepatite chronique et comme indicateurs du risque de transmission horizontale et verticale de l'hepatite B. Actuellement, on ne peut poser un diagnostic d'hepatite non A/non B qu'en excluant la possibilite d'une infection A hepatite A, hepatite B, cytomegalo- virus (CMV) et virus d'Epstein-Barr (EBV) au moyen des methodes de diagnostic pertinentes. Gastro-enterite a rotavirus Quand bien meme la microscopie electronique constitue la methode fondamentale qui a permis la detection des rotavirus dans des echantillons de selles, son emploi est limite en raison du petit nombre de specimens qui peut etre traite et de I'equipement perfectionne qu'elle exige. Les rotavirus humains ont un cycle incomplet en culture cellulaire, par consequent, les techniques d'isolement des virus ne conviennent pas A leur detection; toutefois, les cultures produisent un antigene qui peut etre decele par IF apres centrifugation ou trypsination (5). Les selles provenant de sujets malades contiennent frequemment des quantites considerables d'antigene viral libre ainsi qu'un grand nombre de particules virales. C'est pourquoi on peut employer des techniques serologiques pour la detection des rotavirus; plusieurs etudes ont notamment fait usage de la technique ELISA (6). Le dosage radio- immunologique en phase solide (SPRIA) est quelque peu analogue A la technique ELISA, l'enzyme &ant remplacee par un marqueur radioactif. Ces deux techniques sont tres sensibles et permettent l'examen d'un grand nombre d'echantillons. Le SPRIA comporte l'inconvenient d'exiger un equipement perfectionne et d'entrainer des problemes de securite dus a l'emploi de materiel radioactif. On a recemment decrit une epreuve intitulee agregation en phase solide d'erythrocytes sensibilises (SPACE), qui regroupe certaines des caracteristiques de l'ELISA et du SPRIA, mais qui utilise des globules rouges sensibilises par un anticorps pour detecter la presence du virus (7). La methode consiste A sensibiliser les alveoles en U de plaques de micro-titrage au moyen d'un anticorps anti-virus specifique; apres lavage des plaques, on ajoute une simple suspension a 10% de matieres fecales qu'on laisse adsorber. Les antigenes viraux adsorbes sont alors detectes en ajoutant des erythrocytes sensi- bilises, au moyen de la methode au chlorure de chrome, par une IgG antivirale specifique. Les resultats sont lus de la maniere utilisee pour l'epreuve d'hemagglutination classique, les echantillons posi- tifs montrant un etalement de cellules et les echantil- lons negatifs un culot. Dans une serie d'echantillons de matieres fecales examines A l'insu, I'epreuve SPACE a montre une excellente concordance tant avec l'IF qu'avec l'IEM. L'epreuve SPACE etant une technique en phase solide, elle possede, comme les epreuves ELISA et SPRIA, I'avantage d'eliminer par lavage le materiel f&al de fond apres adsorption du virus, a la difference de l'hemagglutination passive inversee qui est inutilisable avec des echantillons de matieres fecales. Toutes les epreuves decrites ici ont un role a jouer dans la surveillance des infections A rotavirus. Les 418 DIAGNOSTIC RAPIDE DES INFECTIONS VIRALES epreuves ELISA, SPRIA et SPACE sont les plus sensibles et permettent d'identifier, outre le virus, 1'antigene. En attendant que des techniques de cultures de tissus soient mises au point pour la multiplication des rotavirus de toutes les especes, les virus viables ne peuvent etre detectes que par la methode de l'immunofluorescence. Infections virales de la peau et du tractus genital Le virus de l'herpes simplex (HSV) se propage rapidement en culture cellulaire; dans de nombreux cas, des effets cytopathogenes caracteristiques apparaissent apres une nuit d'incubation dans des cellules de singe ou des cellules humaines. Lorsqu'un diagnostic plus rapide est necessaire, la microscopie electronique (EM), avec coloration negative de mate- riel provenant de vesicules ou pustules, s'est montr&e tres suire pour l'identification du groupe. Toutefois, des resultats analogues peuvent etre obtenus avec des echantillons provenant de malades atteints de vari- celle ou de zona. I1 n'est generalement pas necessaire de proceder A des concentrations. Les techniques d'immunofluorescence se sont montrees satis- faisantes pour le materiel provenant de vesicules ou de biopsies des le stade maculopapuleux de l'exan- theme mais variables au stade pustuleux et aux stades plus tardifs. L'IF a egalement ket employee pour identifier les virus de l'herpes preleves sur d'autres sites (cerveau, gorge, col de l'uterus, etc). Un diagnostic rapide peut etre obtenu dans certains cas d'encephalite herpetique en comparant la teneur en anticorps du liquide cephalorachidien A celle du serum, mais il faut dans ce cas employer des temoins. La technique d'immunofluorescence ne devrait pas etre employee pour detecter l'antigene des cellules du liquide cephalorachidien. On a tente d'employer une epreuve ELISA pour HSV-l, mais cette etude n'a pas e completee par d'autres informations. Une epreuve ELISA pour la detection du virus varicello- zonateux a ete comparee A la contre-immuno-electro- phorese (CIE) et A l'hemagglutination-immuno- adherence (IAHA): quand bien meme l'antigene a e facilement detecte dans le liquide de la culture cellulaire, il n'a pas e possible d'evaluer son activite specifique dans le liquide vesiculaire en raison d'une reaction croisee du conjugue avec l'IgG. Les tech- niques d'EM, de cytopathologie et d'IF qui permet- tent la detection des antigenes precoces immediats et des antigenes precoces dans des cultures cellulaires infectees se sont revelees des methodes rapides d'identification des cytomegalovirus dans l'urine et les produits de lavage de la gorge preleves sur des nourrissons congenitalement infectes (8). On a tente sans grand succes une epreuve ELISA pour le virus d'Epstein-Barr. Les techniques dcrites plus haut pour la detection des virus dans des lesions (EM et IF) ont e egale- ment satisfaisantes pour le diagnostic rapide des virus vaccinal et du molluscum contagiosum; pour le virus variolique, I'EM s'est montree satisfaisante, mais l'IF ne s'est pas revelee fiable. I1 n'existe aucune communication concernant l'emploi de 1'ELISA pour la detection de ces types de virus dans des echantillons cliniques provenant de malades infectes. Dans le cas de la rubeole, la plupart des etudes ont evalue les methodes de detection des anticorps (augmentation des titres ou presence d'IgM speci- fique) car les teneurs en anticorps augmentent tres rapidement apres l'apparition de l'exantheme et le virus est difficile a d&tecter dans les &chantillons. II existe actuellement de nombreuses techniques de separation et de mesure des immunoglobulines. Pour la detection de la rougeole, on emploie l'ensemence- ment sur culture cellulaire appropri&e et l'he- madsorption combines au typage serologique, mais si l'on desire un diagnostic plus rapide, on peut employer l'immunofluorescence. On detecte frequemment des Chlamydia dans des frottis provenant d'yeux infectes, par coloration histopathologique des frottis, mais cet agent n'est pas facilement d&cele dans des sp&cimens du tractus geni- tal ou de la gorge. Les techniques de cultures cellu- laires offrent donc des methodes de choix pour un diagnostic en laboratoire sur des specimens cliniques. La methode la plus rapide connue jusqu'ici consiste A centrifuger les speimens sur cellules McCoy, A les traiter au cycloheximide et A proceder, 21 heures plus tard, A une coloration immunofluorescente (9). Maladies respiratoires a virus Bien que, depuis de nombreuses annees, on utilise avec succes l'IF pour la detection des virus respiratoires, cette technique exige un microscope a fluorescence et presente une valeur limitee pour les groupes de virus comportant plusieurs types anti- geniques (rhinovirus, virus coxsackie, &chovirus). L'IF s'est revelee efficace pour le diagnostic des virus respiratoires dont la culture est difficile (coronavirus, virus parainfluenzae de types 4a et 4b et le virus rougeoleux lorsqu'il s'accompagne d'un tableau cli- nique atypique). Depuis de nombreuses annees, on diagnostique avec succes la grippe A et les adenovirus au moyen de l'immunofluorescence, mais cette epreuve a toujours e specifique de type. Une recherche r&cente (10) suggere que si l'on utilise comme inoculum un antigene viral purifie, il est possible de preparer un serum qui est sp&cifique de sous-type lorsqu'il est traite par chromatographie d'affinite. Cette technique devra etre evaluee sur des sp&cimens cliniques. Une rncente etude collective OMS (11), en montrant les limites de la methode de l'immunopero- 419 MEMORANDUM OMS xydase en raison de la peroxydase endogene presente dans le materiel clinique, a conduit A l'evaluation de la methode ELISA pour la detection de l'antigene du virus respiratoire syncitial. Une technique de capture par un anticorps (capture-antibody) a e employee et 23 cellules positives en cultures sur 29 (8007o) ont e confirm&es directement sur des s&retions. Une comparaison approfondie de l'IF et de 1'ELISA pour la detection du virus RS est en cours. Actuellement, l'IF presente sur l'ELISA l'avantage de permettre un diagnostic plus rapide. I1 conviendrait de comparer l'IF, l'ELISA et le SPACE pour les virus respira- toires au moyen d'un essai A double insu. Jusqu'ici, le RIA n'a pas joue un r6le important pour le diagnostic des antigenes des virus respiratoires en laboratoire. La rage Un micro-titrage immunoenzymatique (EIA) qui emploie des cupules de polystyrene sensibilis&es soit par le virus complet soit par la glycoproteine virale permet de detecter les anticorps antirabiques. Le systeme indicateur utilise soit une IgG anti-humaine (de mouton) soit la proteine A du staphylocoque; l'une comme l'autre sont conjugu&s a la peroxydase. Le conjugue de la proteine A s'est revele un detecteur universel pour toute une gamme d'especes. Ce dosage montre une bonne correlation avec les epreuves classiques (12). METHODES IMMUNOLOGIQUES Detection et mesure des anticorps constitues d'IgM Le premier anticorps detectable se trouve generale- ment dans la fraction IgM du serum et il est moins persistant que l'anticorps decele dans la fraction IgG du serum. Actuellement, les principales approches methodologiques, utilisees conjointement ou separe- ment, sont les suivantes: a) separation de l'IgG et de l'IgM; b) utilisation d'antiglobulines marquees sp&cifiques d'IgM; c) utilisation d'une phase solide sensibilisees par une anti-IgM. On peut separer l'IgG de l'IgM en fractionnant le serum par chromatographie sur colonne, par centri- fugation en gradient de densite (par exemple de sucrose), en utilisant la proteine A du staphylocoque qui elimine l'IgG ou par destruction de l'IgM par du mercapto-2 ethanol. Apres chacune de ces methodes, l'epreuve de detection des anticorps peut etre execut&e de la maniere habituelle au moyen des techniques classiques. On peut marquer par de la fluoresceine, de la pero- xydase ou du 1251 les immuns&rums specifiques de l'IgM (par exemple, anti-IgM humaine). Dans toutes ces tecnniques, l'antigene peut etre fixe sur une phase solide. Le serum A titrer (ou une fraction de celui-ci) est incube sur la phase solide puis on ajoute le conju- gue anti-IgM. I1 est relativement facile d'executer ces techniques, mais certains pieges sont a redouter si l'on emploie des serums non fractionnes: 1. Les anticorps constitues d'IgG et le facteur rhumatoide (RF) de la fraction IgM du serum entrai- neront tous les deux des resultats faussement positifs (c'est a dire que l'echantillon semblera contenir l'anticorps constitue d'IgM). L'emploi de F(ab)2 dans la preparation du conjugue eliminera dans une large mesure les problemes causes par le RF. Le serum pourra alors etre adsorbe au moyen d'une immunoglobuline humaine thermo-agregee qui elimi- nera l'activite du RF. 2. On obtient parfois des resultats faussement negatifs dus aux titres eleves d'anticorps constitues d'IgG presents dans le serum A titrer en meme temps que l'anticorps constitue d'IgM. Une autre faqon d'aborder ces deux problemes consiste A employer une phase solide sensibilisee par une anti-IgM. On ajoutera alors le serum A titrer et l'IgM presente se fixera A la phase solide sensibilisee. On peut utiliser comme indicateur un antigene marque ou un antigene non marque suivi d'un anti- corps specifique marque. On a applique avec succes cette technique A la detection directe de l'IgM chez des malades atteints d'hepatite A et de rubeole, et a la detection de l'anti-HBc. Dosage immunologique en couche mince Le dosage immunologique en couche mince (TIA) est une nouvelle technique permettant de doser les reactions antigene-anticorps (13). Cette technique est fond&e sur la propriete que possedent certaines macromol&ules d'etre adsorb&s en couche mince sur une surface de polystyrene. Une surface de ce type sensibilisee par un antigene possede les caract& ristiques d'un immuno-adsorbant et peut fixer les anticorps. La visualisation de l'interaction antigene- anticorps a la surface est realis&e par condensation de vapeur d'eau. La partie sur laquelle se produit une reaction antigene-anticorps est relativement plus hydrophile que le materiel de fond qui est lui plus hydrophobe. Une difference dans les caracteristiques de condensation est facilement visible A l'oeil nu et n'exige aucun materiel perfectionne. Jusqu'ici, on a principalement utilise cette technique pour la mise en evidence des anticorps, mais des etudes preliminaires ont e effectuees pour demontrer la presence d'HBsAg dans le serum. La sensibilite du TIA pour la mise en evidence de l'HBsAg est approximative- ment la meme, lorsqu'on utilise toute une fraction 420 DIAGNOSTIC RAPIDE DES INFECTIONS VIRALES 421 IgG pour la sensibilisation, que celle de la contre- immunoelectrophorese. L'emploi d'une IgG speci- fique pourrait ameliorer la sensibilite de cette epreuve. Standardisation et controle de la qualite des reactifs Dans une large mesure, les facteurs qui entravent les progres des techniques dont il est question ici sont lies A la necessite de produire commercialement des reactifs standardises de haute qualite. Le EGRLVD, le PAGRVD et d'autres groupes s'efforcent d'etablir des normes relatives A plusieurs de ces techniques. Les progres les plus remarquables ont ete realises dans le domaine de l'IF, pour la normalisation des immunserums et des conjugues, et les regles suivantes ont e proposees: a) I1 conviendrait d'eprouver les cellules infectees et les cellules temoins, pour deter- miner la dilution optimale permettant de detecter l'antigene. Cette dilution devrait etre quatre fois plus elev&e au moins que celle qui revele une fluorescence non specifique sur des cellules non infectees. Les cultures cellulaires temoins devraient comporter quatre types de cellules differents. b) II conviendrait de proceder A un titrage limite, en vue de l'evaluation definitive, sur du materiel clinique positif approprie au virus A determiner. c) I1 conviendrait d'eprouver les immunserums A leur dilution optimale sur des secretions pharyngees negatives et, si possible, sur d'autres echantillons cliniques humains negatifs. d) Il conviendrait d'eprouver les immunserums sur des cultures cellulaires infectees par une collection repre- sentative de virus, par exemple, le virus respiratoire syncitial, les virus parainfluenzae 1, 2, 3, 4a et 4b, le virus ourlien, les virus grippaux A et B, le virus morbilleux, le virus de l'herpes, les cytomegalovirus et deux enterovirus au moins. Ces immunserums, A leur dilution optimale, ne devraient produire aucune reaction non specifique. Des criteres analogues sont employes pour determiner l'efficacite des conjugues anti-especes. Ces criteres ne seront applicables que dans les conditions du systeme d'epreuve; par consequent les utilisateurs des reactifs auront tout interet A employer la technique de coloration comportant une colora- tion de contraste, ainsi qu'il est propose dans le Manuel de techniques de laboratoire pour le diag- nostic rapide des infections virales.a Des criteres analogues seront necessaires pour evaluer tous les reactifs utilises dans les techniques de diagnostic rapide. I1 est important que les epreuves d'evaluation des reactifs et des methodes soient effectuees par des personnes hautement competentes. a Manuel de techniques de laboratoire pour le diagnostic rapide des infections virales. Geneve, Organisation mondiale de la Sante (Publication offset, No.47) (sous presse). RECOMMANDATIONS Generales 1. L'OMS devrait envisager de constituer un comite charge de mettre en oeuvre la standardisation et le controle de la qualite des reactifs. 2. Les programmes de formation de l'OMS en matiere de diagnostic virologique rapide devraient etre prepares en collaboration avec les divers groupes d'experts, tant pour ce qui est des cours que de la formation individuelle. 3. L'OMS devrait envisager la creation, dans des pays en developpement, de centres de recherche, de reference et de formation en matiere de diagnostic virologique rapide. 4. Il conviendrait d'encourager, entre les labora- toires de pays developpes et en developpement, des etudes collectives visant a comparer les techniques classiques et les techniques nouvelles, simples et rapides. Recherches complementaires 1. Il conviendrait d'examiner le potentiel des tech- niques d'agregation en phase solide d'erythrocytes sensibilises (SPACE) et de dosage immunologique en couche mince (TIA), en comparant leur sensibilite et leur precision avec celles d'autres techniques classiques. 2. Il conviendrait d'effectuer d'autres recherches visant A eprouver la capacite du dosage avec immunoadsorbant lie A une enzyme (ELISA) de detecter les antigenes viraux dans une gamme elargie de specimens cliniques. 3. I1 conviendrait d'examiner l'utilisation des conjugues de la proteine A dans une gamme elargie d'infections virales. 4. II conviendrait d'entreprendre des etudes collectives concernant les diverses techniques de separation et de mesure de l'IgM. * * J. Almeida, The Wellcome Research Laboratories, Beckenham, Kent, Angleterre P. Atanasiu, Institut Pasteur, Paris, France A. J. Beale, The Wellcome Research Laboratories, Beckenham, Kent, Angleterre M. Chernesky, Regional Virology Laboratory, St Joseph's Hospital, Hamilton, Ontario, Canada P. S. Gardner, Department of Virology, Royal Vic- toria Infirmary, Newcastle upon Tyne, Angle- terre E. H. Houwink, Groupe de Developpement scienti- fique Organon, Oss, Pays-Bas 422 MEMORANDUM OMS J. E. Maynard, Center for Disease Control, Bureau of Epidemiology, Phoenix, AZ, Etats-Unis d'Amerique P. K. Nakane, Department of Pathology, University of Colorado School of Medicine, Denver, CO, Etats-Unis d'Amerique L. -A. Nilsson, Institut de Microbiologie medicale, Universite de Goteborg, Suede 0. Sobeslavsky, Medecin, Maladies a virus, Organi- sation mondiale de la Sante, Geneve, Suisse A. Voller, Nuffield Laboratories of Comparative Medicine, The Zoological Society of London, Londres, Angleterre BIBLIOGRAPHIE 1. Techniques de laboratoire pour le diagnostic rapide des infections virales: Memorandum. Bulletin de l'Organisation mondiale de la Sante, 56: 99-103 (1978). 2. Progres en matiere de diagnostic rapide des infections virales: Memorandum. Bulletin de l'Organisation mondiale de la Sante, 56: 767-771 (1978). 3. BRADLEY, D. W. & MAYNARD, J. E. Serodiagnosis of viral hepatitis A by radioimmunoassay, Laboratory management, 16: 29-34 (1978). 4. DUERMEYER, W. & VAN DER VEEN, J. 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