Vaccins anti-hépatite B préparés dans des levures par des méthodes de génie génétique : mémorandum d'une Réunion de l'OMS

Bulletin del'Organisation mondialedela SanteO, 63 (4): 689-694(1985) © Organisation mondiale de la Sante 1985 Vaccins anti-hepatite B prepares dans des levures par des methodes de genie genetique: M.emorandum d'une Reunion de 1'4OMS* Une reunion consultative d'experts organisee par l'OMS et portant sur la production du vaccin anti-hdpatite B prdpare' par des mdthodes de genie genettique en utilisant une levure (Saccharomyces cerevisiae) comme hote s'est tenue du 19 au 21 novembre 1984 d Geneve, Suisse. Les r&cents progres de la ge'neitique mol6culaire ont permis l'identification de genes codant pour des substances biologiquement actives, l'analyse fine de ces genes ainsi que leur transfert dans des micro-organismes hotes permettant leur expression dans des conditions contro6kes, c'est-a-dire l'obtention d'une synthese efficace du produit pour lequel ils codent. Des lors, il estpermis d'appliquer cette methodologie nouvelle a lafabrica- tion de vaccins. C'est ainsi que le gene codantpour l'antigene de surface du virus de l'hepa- tite B (HBsAg, protdine de l'enveloppe virale) a dte' clone' et inse're' dans plusieurs vecteurs d'expression. L'expression de ces genes a dte' obtenue apres transfert des plasmides recombinants dans des levures. Au cours de cette reunion, d laquelle participaient des repre'sentants de sept firmes pharmaceutiques, on a e6nonce' des directives concernant le controle du vaccin anti-he6patite B produit dans des levures et les e'preuves auxquelles il devra e'tre soumis. HtPATITE B -LA MALADIE Les virus de l'hepatite, qui sont au moins au nombre de 3 (le virus de l'hepatite A, le virus de l'hepatite B et celui de l'hepatite non-A non-B) sont susceptibles de provoquer une infection systemique avec des alterations pathologiques du foie. L'hepatite B est la plus importante des hepatites virales. Dans certains pays, elle represente la moitie des hepatites cliniques et elle est responsable de la plupart des cas mortels avec un taux de letalite d'environ 1 %. Cinq a dix pour cent des patients atteints d'une hepatite B deviennent des porteurs chroniques. On sait mainte- nant qu'en plus des symptomes qui accompagnent la forme aigue de l'hepatite B, l'infection non resorbee donne lieu a des sequelles dont certaines maladies chroniques du foie, des cirrhoses et des carcinomes hepatocellulaires. Dans certaines regions d'Asie et d'Afrique au sud du Sahara, le carcinome hepato- cellulaire, une des causes principales de mortalite par cancer chez les hommes, a pour origine manifeste une infection par le virus de l'hepatite B. On compte actuellement dans le monde plus de 200 millions de porteurs chroniques du virus de l'hepatite * Ce Memorandum a e prepare par les signataires dont les noms figurent aux pages 693-694. La version originale en anglais a e publi&e dans le Bulletin de l'Organisation mondiale de la Sante, 63(1): 57-61 (1985). Les demandes de tires a part doivent etre adress&es a la Division des Maladies transmissibles, Organisation mondiale de la Sante, Geneve, Suisse. B et qui en constituent le reservoir principal; ils se repartissent geographiquement de la maniere sui- vante: en Europe du Nord, en Amerique du Nord et dans certaines regions de l'Australie, avec une preva- lence inferieure ou egale a 0,1 7o; en Europe centrale et en Europe orientale, avec une prevalence pouvant atteindre 5%0, et une frequence plus elevee en Europe meridionale et dans les pays riverains de la Mediter- ranee; dans certaines regions d'Amerique centrale et d'Amerique du Sud, avec une frequence de 5%o ou plus; au Moyen-Orient, avec une frequence de 5 a 10%7o et enfin dans certaines regions d'Afrique, d'Asie et du Pacifique oiu la prevalence peut atteindre 20%. Le virus de l'hepatite B se transmet par contact direct avec le sang ou d'autres liquides corporels des porteurs chroniques ou des sujets atteints d'infection aigue. Dans les pays ou l'incidence de la maladie est faible, le risque d'infection par le virus de l'hepatite B est neanmoins eleve pour quelques groupes d'indivi- dus: certaines categories du personnel medical, les malades traites par hemodialyse ou par des produits sanguins obtenus a partir de grandes quantites de plasma humain, les residents d'institutions pour handicapes mentaux, les prisonniers, les toxicomanes et les groupes a forte promiscuite sexuelle. Dans cer- taines regions oiu l'incidence de la maladie est eleveee, comme l'Asie du Sud-Est, le virus de l'hepatite B se propage principalement par transmission de mere a 4571 -689- 690 MtMORANDUM enfant pendant la periode perinatale; on observe aussi une propagation horizontale par d'autres contacts familiaux. Dans d'autres regions a incidence elevee, comme l'Afrique, la propagation horizontale constitue le principal mode de transmission. La p6riode d'incubation de l'hepatite B est longue. Six semaines a six mois peuvent s'ecouler etitre l'expo- sition au virus et l'apparition des premiers signes cliniques. La maladie d6bute generalement par une grande fatigue accompagn6e d'anorexie. Des myal- gies et des douleurs abdominales se manifestent egale- ment dans certains cas. Plus tard, un ictere peut appa- raltre, accompagne d'une forte coloration des urines, d'une d6coloration des selles et d'une hepatomegalie douloureuse a la palpation. Dans d'autres cas, la maladie se declare rapidement avec appparition d'un ictere precoce associe a de la fievre, des frissons et une hyperleucocytose. Dans certains cas, l'ictere passera inapersu et le patient ne ressentira qu'une sorte d'etat grippal. I1 est important de signaler que les personnes atteintes de cette forme attenuee, sans ictere, sont susceptibles de devenir des porteurs chroniques de l'hepatite B de la meme maniere que celles qui deve- loppent les symptomes cliniques. Le virus de l'hepatite B (HBV) se presente sous la forme d'une particule de 42 nm contenant de l'ADN bicatenaire. L'infection par le virus de l'he'patite B se manifeste par la presence d'au moins trois marqueurs antigeniques: l'antigene de surface du virus de l'hepatite B (HBsAg), l'antigene central (HBcAg) et l'antigene e (HBeAg), resultant de la replication du virus dans les hepatocytes. L'antigene de surface se rencontre soit sous forme de particules spheriques de 18 a 22 nm (qui peuvent parfois etre soit legerement plus petites soit legerement plus grosses) soit sous forme de particules tubulaires. I1 possede un determi- nant commun a et generalement au moins deux sous- determinants s'excluant mutuellement, d ou y et w ou r. On a egalement reconnu d'autres sous-specifi- cites. Le virus de l'hepatite B n'a pas encore pu etre propage en culture cellulaire et les petits animaux de laboratoire n'y sont pas sensibles. L'infection peut etre transmise a certains singes parmi lesquels le chim- panze constitue le seul modele animal qui soit sensible A I'hepatite B et aux deux formes de l'hepatite non-A non-B, a courte et a longue periode d'incubation. Elaboration de vaccins Vu le besoin urgent d'un vaccin anti-hepatite B, notamment pour proteger les groupes particuliere- ment exposes, les normes OMS relatives a la fabrica- tion d'un vaccin a partir du plasma ont ete formulees en 1981 et revisees en 1983.a II a ete demontre que les a Document OMS non publie WHO/BS/83/1391/revision 2, 1983. proteines de l'enveloppe virale separees, contenant I'antigene de surface du virus de l'hepatite B, suscitent la production d'anticorps protecteurs. I1 est donc possible d'utiliser comme vaccin soit les parti- cules de 22 nm de cet antigene de surface, purifiees et inactivees, soit des sous-unites de cet antigene. Toute- tefois, la preparation de tels vaccins a partir d'anti- genes viraux d'origine humaine, non obtenus en -ulture cellulaire mais extraits du plasma de sujets infectes (porteurs chroniques d'antigenes de l'hepa- tite B) constitue une approche entierement nouvelle en matiere de production de vaccins et il faut donc accorder une importance particuliere aux 6preuves applicables a la production et au controle de qualite, d'autant plus que l'on sait maintenant que le sang et le plasma humains peuvent contenir un certain nombre d'agents infectieux dont le LAV (ou HTLV III). I1 faudra donc veiller a selectionner tres soigneusement les donneurs de plasma, et a choisir judicieusement les methodes de separation et d'inactivation de l'antigene de facon a assurer que tout agent infectieux potentiel qui pourrait etre encore present apres la purification de l'antigene a ete effectivement inactive. Dans la plupart des pays, la quantite de vaccin qu'il. est possible de produire est limitse par la quantite de plasma utilisable. La production de ce vaccin neces- site un traitement pousse et des epreuves d'innocuite rigoureuses qui assurent la purete du produit, lequel doit etre debarrasse de tout contaminant present a l'origine dans le plasma. La diffusion du vaccin anti- hepatite B a ete considerablement freinee par la crainte qu'a suscite dans le public l'existence poten- tielle d'une contamination du plasma par des micro- organismes vivants (par exemple l'agent etiologique du syndrome d'immunodeficit acquis (SIDA)) even- tuellement capables de resister aux processus de puri- fication et d'inactivation. II a cependant e montre que les differentes methodes utilisees pour la purifica- tion de l'antigene inactivent efficacement des virus animaux appartenant aux groupes principaux. I1 a de plus ete demontre que les vaccins anti-hepatite B obtenus a partir de plasma qui repondent aux normes de l'OMS sont d'une innocuite totale.b L'HBV se differencie des autres familles de virus a ADN par plusieurs de ses constituants structuraux. Ce virus a un tegument (plus important qu'une membrane ou une enveloppe) constitue de proteines, de lipides et de glucides et qui porte un complexe antigenique unique, l'antigene de surface de l'hepatite B (HBsAg). Son genome est constitue d'un ADN bicatenaire circulaire d'une masse moleculaire relative d'environ 2 x 106, dont une partie est monocatenaire, ce qui est inhabituel chez les virus. Le virus a ete recueilli dans le plasma d'un porteur de l'hepatite B, puis 1'ADN a ete extrait des particules b British medicaljournal, 289: 1243-1244 (1984). VACCINS ANTI-HEPATITE B OBTENUS PAR GtNIE GtNETIQUE 691 virales et clone dans Escherichia coli. Le gene codant pour I'antigene de surface a alors pu etre isole. PRINCIPES DE LA PRODUCTION DE VACCINS PAR LES MtTHODES DE RECOMBINAISON DE L'ADN ET STANDARDISATION ET CONTR6LE DES PRODUITS Les progres de la genetique moleculaire et de la chimie des acides nucleiques ont permis d'identifier les genes codant pour des substances biologiquement actives, de les analyser avec precision et de les trans- ferer dans des micro-organismes ou ils s'expriment dans des conditions contr8lees permettant une syn- these efficace du produit pour lequel ils codent. Un gene qui code pour un produit donne peut etre isole et reproduit par insertion de molecules naturelles ou synthetiques d'ADN dans un vecteur approprie, qui est alors introduit dans un micro-organisme h6te. Les clones qui contiennent le gene voulu sont ensuite selectionnes individuellement. Ce processus, qui constitue la methode du clonage des genes, comporte une 'tape cle: l'insertion du gene dans le vecteur, qui se fait A l'aide d'enzymes de restriction hautement specifiques (endonucleases qui coupent la molecule d'ADN vecteur en des sites predetermines) et de ligases (qui soudent le gene au vecteur). Un gene est caracterise par une sequence specifique de nucleotides sur un des brins de la molecule d'ADN bicatenaire. Quand les brins sont separes, chacun sert de matrice a la synthese d'une copie complementaire, ce qui permet la reproduction fidele des genes avec conservation de la sequence lineaire des quatre nucleotides. Le decodage de cette information et la synthese du produit du gene s'effectuent en deux phases: il y a d'abord transcription de la chaine d'ADN sous la forme d'un ARN messager (ARNm) puis traduction de l'information portee par la mole- cule d'ARNm en une sequence d'acides amines. Des facteurs complexes interviennent dans l'expression dans un organisme de genes qui lui sont etrangers. D'importants travaux de recherche sont actuellement consacres a l'efficacite et au controle de l'expression de sequences d'ADN clonees et stables. Les directives enoncees ci-dessous seront A prendre en consideration pour le controle et les essais du vaccin anti-hepatite B fabrique par des methodes de recombinaison de l'ADN; elles pourront aider les firmes qui desirent obtenir des certificats d'essais cliniques et des autorisations de mise sur le marche a rassembler les informations necessaires. Ces direc- tives ont e formulees de facon A tenir compte de l'echelle de la production commerciale. On a particu- lierement insiste sur les controles en cours de fabrica- tion, qui se sont reveles extremement efficaces, par exemple pour le controle des vaccins bacteriens et viraux, aii lieu de ne prendre en consideration que les essais a effectuer sur le produit final. Il est A prevoir que certaines normes d'ordre general telles que celles qui s'appliquent aux epreuves d'activite, de purete, de toxicite anormale, de pyrogenicite et de sterilite, s'appliqueront egalement aux vaccins anti-h6patite B produits par des methodes de recombinaison de 1'ADN. Certaines de ces normes figurent deja dans les normes OMS pour le vaccin anti-hepatite B fabrique a partir de plasma,c ou dans d'autres documents de l'OMS. La nouveaute des vaccins obtenus par genie g'netique et les proced's utilis's pour leur production industrielle devront toutefois dicter la nature des precautions a prendre lors de leur controle. Certaines epreuves devront etre effectuees sur chaque lot de vaccin, alors que d'autres ne seront necessaires que pour etablir la validite, l'acceptabilite et la reproductibilite de la methode de fabrication industrielle. GAndralitds Une description detaillee de la strategie de fabrication du produit devra etre etablie. On devra apporter la preuve que l'HBsAg obtenu par genie genetique possede bien les caracteristiques voulues. II faudra insister sur la rigueur de l'identification et de la caracterisation, par des methodes chimiques et biologiques, du produit obtenu dans la levure. La plus legere variation d'ordre structural, biologique ou immunologique entre le produit et l'antigene naturel devra etre etudiee en detail. De telles alterations pour- raient se produire soit au niveau du gene, soit au niveau post-traductionnel, soit encore au cours de la purification. Des variations entre les lots de produits peuvent etre attribuees a l'instabilite du plasmide ou au fait qu'il ne reste pas dans la levure pendant la fermentation. II sera necessaire d'exercer un controle rigoureux sur l'apparition d'eventuelles contamina- tions microbiennes au cours de la fermentation. On accordera une attention particuliere A la purete du produit, pour les raisons suivantes: a) des produits indesirables du gene peuvent etre co-exprimes en meme temps que l'HBsAg; l'appari- tion de tels produits peut etre due a une initiation de la transcription au niveau de plusieurs sites sur le plasmide ou a une modification du plasmide au cours de la fermentation, qui affecterait les processus de transcription, d'initiation ou de terminaison et pourrait favoriser 1'expression d'autres genes du plasmide; b) la presence, dans le produit, de composes issus des cellules hotes et qu'on ne trouve pas dans le vaccin obtenu a partir de plasma, peut avoir des conse- quences nefastes lorsqu'on administre le produit 'a l'homme; c) des contaminations specifiques du produit final peuvent provenir des agents utilises dans le processus de purification (colonne, anticorps). c Voir note a, page 690. 692 MEMORANDUM Strat6gie pour le clonage et l'expression du ge'ne 1) La cellule h6te et les vecteurs d'expression utilises pour la production devront etre decrits en dMtail. Cette description devra comporter des preci- sions sur la construction, la genetique et la structure des vecteurs d'expression, ainsi que l'origine et l'iden- tification du gene qui doit etre clone. 2) La sequence nucleotidique du gene et des regions du plasmide (ou d'autres vecteurs utilises pour la pro- duction) qui lui sont adjacentes devra etre fournie. La cartographie de restriction du plasmide dans lequel est insere le gene peut aussi fournir des informations utiles. 3) Les procedes utilises pour favoriser et controler l'expression des genes clones dans la cellule hote devront etre decrits en detail. 4) A la fin de la fermentation, la proportion de cellules qui possedent le plasmide devra etre evalu6e pour chaque lot. Procedes defabrication industrielle 1) On donnera une description du systeme de lot de semence utilise, comportant le nombre de flacons de semence disponibles et les details concernant le stockage. La stabilite des vecteurs d'expression dans les cellules de semence, dans les conditions de stockage et de remise en culture utilisees, doit faire l'objet d'une attention particuliere. Toute instabilite du plasmide dans la culture de semence susceptible d'impliquer des rearrangements, des deletions ou des insertions de nucleotides devra etre exposee en de- tail. 2) Une description detaillee des procedes de fer- mentation utilises pour la fabrication du produit devra etre fournie aux autorites nationales de controle en precisant la frequence, le degre et la nature de toute contamination microbienne observee dans les fermen- teurs A la fin des cycles de fermentation, et en men- tionnant aussi la sensibilite des methodes utilisees pour detecter ces contaminations. 3) On devra presenter des resultats sur la constance du rendement en HBsAg A la fin de chaque cycle de fermentation, ainsi qu'une description des epreuves qui ont permis d'obtenir ces donnees. 4) La structure des vecteurs d'expression et les caracteristiques de la cellule hote devront etre regu- lierement contr6l6es a la fin des cycles complets de fermentation; toute modification observee devra etre documentee. 5) On fournira une description des methodes utili- sees pour purifier l'HBsAg. L'efficacite du procede de purification, visant A eliminer les proteines de la cellule hote, les acides nucleiques et les autres impure- tes, ainsi que sa reproductibilite, devront etre prouvees. A cet egard, il peut etre utile de realiser une etude pilote. Toutes les informations concernant les substances chimiques et biologiques ajoutees au cours de la fabrication devront etre fournies, et leur absence ou leur presence dans le produit final devra etre dufment justifiee et documentee. La sensibilite des epreuves utilisees pour la detection des proteines, de l'ADN et d'autres contaminants issus des levures devra etre dfiment demontree. 6) Le produit final en vrac en solution aqueuse devra etre caracterise par des methodes biologiques, immunologiques et physico-chimiques appropriees. On devra obtenir, au moins a une occasion, des infor- mations sur la sequence suffisantes pour caracteriser le produit. Si le gene code pour une methionine en position N-terminale, on devra tenir compte de la presence possible de cet acide amine dans le produit. On pretera egalement une attention particuliere a la sequence des acides amines dans les regions N- et C- terminales. Si possible, on comparera la sequence du produit et celle de l'antigene naturel. La caracteri- sation physico-chimique du produit devra comporter des techniques permettant d'etablir sa geometrie, par exemple la taille de la particule antigenique. LES VACCINS EN COURS DE PRODUCTION A la suite de la mise en evidence, pour la premiere fois, de l'expression de l'HBsAg dans la levure (Saccharomyces cerevisiae) par des techniques de recombinaison de 1'ADN, par Valenzuela et al. ,d plusieurs fabricants ont exploite cette technique pour la production industrielle de vaccins. Lors de la reu- nion, sept fabricants ont expose les progres de la mise au point du vacin anti-hepatite B. Des sequences d'ADN d'HBV codant pour l'HBsAg obtenues a partir d'ADN d'HBV clone, ou, dans un cas, une sequence partiellement synthetique, ont ete incorpo- rees dans plusieurs plasmides recombinants choisis afin de permettre l'expression du gene dans la levure. Promoteur, sequence de terminaison et sequence marqueur ont et juxtaposes dans les vecteurs d'expression selon des positions appropriees. Plusieurs fabricants ont utilise entre autres comme promoteurs la glyceraldehyde-3 phosphate-deshydro- genase et la phosphatase (PHO.5) de la levure. Les genes utilises pour la selection des levures contenant des plasmides recombinants sont TrpI ou Leu2. Des molecules d'ADN clone provenant d'HBV apparte- nant aux sous-groupes adw, ayw ou adr ont et utili- sees comme sources de genes codant pour l'antigene de surface. Le gene d'HBV insere codait pour les 226 acides amines de l'HBsAg produit. L'HBsAg produit par fermentation a l'echelle industrielle reste associe aux cellules de levure. I1 est ensuite libere par rupture mecanique des cellules et purifie par plusieurs methodes appliquees sequentiel- d Nature (London), 298: 347 (1982). VACCINS ANTI-HEPATITE B OBTENUS PAR GENIE GENETIQUE 693 lement: a) purification par immuno-adsorption, b) utilisation selective de l'interaction hydrophobe, c) echanges ioniques et d) chromatographie d'exclu- sion sur gel. Les antigenes ont egalement ete purifies par centrifugation isopycnique et centrifugation zonale en gradient de densite. La purete des produits ainsi obtenus etait superieure a 90%7o en ce qui concerne leur contenu proteique. Les particules d'HBsAg obtenues a partir du plasma ont une taille relativement uniforme (environ 22 nm) et contiennent des lipides et des glucides provenant des cellules hotes d'origine. L'HBsAg pre- pare dans la levure se presente sous la forme de parti- cules complexes d'environ 15-30 nm de diametre (en moyenne 17-20 nm) exclusivement composees d'un polypeptide glycosyle monomere de masse molecu- laire relative (Mr) 23 000-25 000 associe a des lipides de la cellule h8te. Le produit synthetise dans la levure, injecte a des animaux de laboratoire apres adsorption sur Al(OH)3, s'est revele capable de susciter une reponse anti-HBs. Des chimpanzes immunises avec au moins 2 des vaccins experimentaux ont resiste a une epreuve virulente par une dose correspondant a un millier de fois la dose infectante. Chez l'animal, le pouvoir immunogene des produits obtenus a partir de la levure est similaire a celui des vaccins fabriques a partir de plasma. Le nouveau vaccin fait actuellement l'objet d'etudes cliniques dans plusieurs pays. RECOMMANDATIONS 1. Il est recommande d'utiliser des anticorps monoclonaux pour identifier les epitopes de l'HBsAg responsables de la protection et pour standardiser le contenu en ces epitopes des vaccins obtenus par recombinaison de l'ADN. Aux Etats-Unis d'Ame- rique, la Food and Drug Administration est en mesure d'examiner d'autres anticorps monoclonaux pour rechercher leur aptitude a conferer aux chimpanzes une protection passive. 2. Un groupe permanent d'experts devra etre cree a l'echelon international pour conseiller les autorites sanitaires, sur demande, sur l'emploi des nouveaux vaccins contre l'hepatite dans des essais cliniques et des essais sur le terrain. Ce groupe aura egalement un role consultatif et collaborera etroitement avec les fabricants pour la planification et l'execution des etudes cliniques et des etudes de terrain, sous reserve de l'approbation par le Comite du Secretariat OMS pour la recherche impliquant des sujets humains (SCRIHS). 3. Les normes provisoires de l'OMS relatives aux vaccins anti-hepatite B produits dans des levures par des methodes de recombinaison de l'ADN devront etre examinees des que possible par le Comite OMS d'experts de la Standardisation biologique. 4. Un groupe international d'experts devra etre reuni en vue d'etablir des methodes standardisees suffisamment specifiques et sensibles pour permettre la detection d'acides nucleiques dans les produits biologiques et pour etablir des substances de reference a cette fin. 5. Les vaccins anti-hepatite B prepares dans des levures devront faire l'objet d'etudes comparatives. Les fabricants sont invites a soumettre a I'OMS des echantillons d'au maximum 3 lots de produit final en vrac (HBsAg purifie en solution aqueuse) et d'au maximum 3 lots de vaccin final. Les fabricants qui participaient a la reunion ont d'ores et deja accepte de soumettre leurs produits. Toute information sur les produits communiquee 'a 'OMS sera traitee confiden- tiellement. L'OMS soumettra ces echantillons, apres leur avoir attribue un numero de code, a l'Office of Biologics Research and Review et a la Food and Drug Administration, Etats-Unis d'Amerique, et au National Institute of Biological Standards and Control, Angleterre, qui procederont a des etudes experimentales comparatives comportant: a) des titrages in vitro de l'antigene; b) des epreuves de specification des epitopes, par exemple avec une serie d'anticorps monoclonaux anti- HBsAg; c) des etudes d'immunogenicite pour la souris par comparaison avec le vaccin OMS de reference propose contre l'hepatite B, avec la recherche dans l'immunserum de souris d'anticorps diriges contre des epitopes + a + specifiques (de synthese); d) la determination des caracteristiques physico- chimiques et moleculaires des produits. Les resultats de ces travaux seront soumis a 1'OMS, sous leur numero de code, par le laboratoire competent. L'OMS informera alors chaque fabricant des resultats des essais realises sur ses echantillons, accompagnes des resultats obtenus avec les autres echantillons designes par leur numero de code. La quantite minimale de produit necessaire pour les epreuves est: a) 2 x 20 ml de chaque vaccin en vrac a une concentration superieure ou egale a 50-100 ,g de proteine d'HBsAg par ml; b) 2 x 20 ml de chaque vaccin final. * * H. Arimura, Green Cross Corporation, Osaka, Japon A.J. Beale, Wellcome Biotechnology Ltd, Beckenham, Kent, Angleterre R. Beswick, BIOGEN SA, Carouge, Geneve, Suisse 694 MEMORANDUM G. Bitter, AMGEN, Thousand Oaks, CA, Etats-Unis d'Amerique W.N. Burnette, AMGEN, Thousand Oaks, CA, Etats- Unis d'Amerique M. Dewilde, Smith Kline-RIT, Rixensart, Belgique F. Dorner, IMMUNO AG, Orth/Donau, Autriche S. Drew, Merck Sharp & Dohme Research Labora- tories, Rahway, NJ, Etats-Unis d'Amerique F. Filatov, Institut de Virologie, Academie des Sciences medicales, Moscou, URSS R.J. Gerety, Infectious Diseases Branch, Division of Blood and Blood Products, Office of Biologics Research & Review, Bethesda, MD, Etats-Unis d'Amerique F. Hamada, Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute, Kumamoto City, Japon M.R. Hilleman, Merck Institute for Therapeutic Research, Merck Sharp & Dohme Research Laboratories, West Point, PA, Etats-Unis d'Amerique C. Huygelen, Division biologique, Smith-Kline RIT, Rixensart, Belgique J.L. Melnick, Department of Virology and Epidemio- logy, Baylor College of Medicine, Houston, TX, Etats-Unis d'Amerique (President) K. Murray, Department of Molecular Biology, University of Edinburgh, Edimbourg, Ecosse N. Ohtomo, Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute, Kumamoto City, Japon G.C. Schild, Division of Viral Productions, National Institute for Biological Standards and Control, Hampstead, Londres, Angleterre T. Suyama, Green Cross Corporation, Osaka, Japon P. Wingfield, BIOGEN SA, Carouge, Geneve, Suisse M. Winther, Wellcome Biotechnology Ltd, Beckenham, Kent, Angleterre A.J; Zuckerman, Department of Medical Micro- biology, London School of Hygiene and Tropical Medicine, Londres, Angleterre (Rapporteur) Secrdtariat F. Assaad, Division des maladies transmissibles, OMS, Geneve, Suisse R. Bell-Madsen, Immunologie, OMS, Geneve, Suisse H. Shimojo, National Institute of Health, Tokyo, Japon (Conseiller temporaire, Bureau regional de l'OMS pour le Pacifique occidental, Manille, Philippines) P. Sizaret, Produits biologiques, OMS, Geneve, Suisse 0. Sobeslavsky, Maladies a virus, OMS, Geneve, Suisse T. Umenai, Bureau regional de l'OMS pour le Pacifique occidental, Manille, Philippines.