Procedimento operacional padrão para testar a suscetibilidade dos mosquitos adultos aos inseticidas em bioensaios com garrafas da OMS

Procedimento operacional padrão para testar a suscetibilidade dos mosquitos adultos aos inseticidas em bioensaios com garrafas da OMS Versão: WHO Bottle-bioassay/01/14 January 2022

1POP para testar a suscetibilidade dos mosquitos adultos aos inseticidas em bioensaios com garrafas da OMS 1. Introdução, âmbito e finalidade Este procedimento operacional padrão (POP) descreve o processo para avaliar a suscetibilidade de mosquitos vetores adultos aos inseticidas, utilizando o bioensaio de garrafa da Organização Mundial da Saúde (OMS). O bioensaio de garrafa deve ser utilizado para avaliar a suscetibilidade do vetor aos inseticidas que são instáveis ou incapazes de impregnar os papéis de filtro normais Whatman n.º 1. Este POP destina-se a testar a suscetibilidade a estes inseticidas e não deve ser usado para reguladores de crescimento que tenham impacto sobre a fecundidade/fertilidade dos mosquitos. O procedimento para testar os reguladores de crescimento de insetos é apresentado no POP PPXN-Bioassay/01/14 January 2022. Para os inseticidas que podem impregnar papéis de filtro, o POP para os tubos de teste da OMS deve ser seguido (ver WHO Tube test/01/14 January 2022). O bioensaio com garrafas da OMS é uma versão modificada do bioensaio com garrafas dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) dos Estados Unidos e foi desenvolvido para harmonizar os pontos finais do teste com os do teste com tubos da OMS, para que a mortalidade dos mosquitos seja avaliada no mesmo tempo após a exposição (1). O bioensaio com garrafas da OMS é um teste direto de resposta à exposição, que mede a mortalidade dos mosquitos uma hora após a exposição a uma concentração padrão conhecida (ex., a concentração discriminatória) de um inseticida. A mortalidade dos mosquitos nos testes é registrada 24 horas (ou 72 horas) após o período de exposição de uma hora. Este POP fornece instruções para a preparação e impregnação das garrafas, exposição dos mosquitos,registro e interpretação dos resultados dos testes. 2. Insumos Garrafas Wheaton® de 250 ml com tampas de rosca – 6 garrafas por composto de inseticida a ser testado (12 para clorfenapir). Se as garrafas forem lavadas e reutilizadas, assegure que foram devidamente limpas seguindo o procedimento de “lavagem de garrafas” descrito mais adiante. Espátula de pesagem Microbalança (balança eletrônica) Misturador vortex Lente de aumento ou lupa binocular 2 frascos de vidro âmbar (volumes 50–100 ml cada). Alternativamente, qualquer frasco de vidro limpo envolto em folha de alumínio pode ser usado. Um conjunto de micropipetas calibradas (ex., 100 µl, 200 µl e 1000 µl) POP para testar a suscetibilidade dos mosquitos adultos aos inseticidas em bioensaios com garrafas da OMS 2 Temporizador (cronômetro) Monitores de umidade e temperatura calibrados e rastreáveis Um recipiente plástico de 20 L ou uma pia de 20 L Aspiradores para coleta de mosquitos (aparelhos alimentados por baterias devem ser usados para evitar qualquer exposição a inseticidas ou a inalação de alérgenos) Gaiolas para mosquitos (dimensões mínimas 20 cm x 20 cm) Suportes Equipamento de proteção individual adequado (jaleco, luvas de latex) Câmara de testes ou insetário com clima controlado a 27 °C ± 2 °C e umidade relativa a 75% ± 10% 3. Reagentes e consumíveis Inseticida grau técnico (ingrediente ativo [IA]) ou sua solução estoque Acetona (reagente para análise) Surfactante apropriado, se necessário (ex., MERO® i.e. 81% éster metílico de óleo de colza, fabricado pela Bayer)1 Copos de papel para manter os mosquitos adultos (440 mL; 10 cm altura x 9,5 cm largura) (i.e. uma câmara de armazenamento para um lote de 25 mosquitos do teste) Redes de malha estreita em quantidade suficiente para cobrir os copos/potes de papel e elásticos para prender os pedaços de rede aos copos/potes Ponteiras plásticas descartáveis para as micropipetas (ex., 100 µL, 200 µL e 1000 µL) 1 Um surfactante alternativo, mas ainda em avaliação, é o Span 80. 3POP para testar a suscetibilidade dos mosquitos adultos aos inseticidas em bioensaios com garrafas da OMS Pipetas de vidro descartáveis de vários volumes Algodão hidrófilo de qualidade médica Solução de açúcar a 10% (glicose dissolvida em água a 10% p/v) Folha de alumínio Papel manteiga para pesar o inseticida (ou microcopos de alumínio) Fita adesiva Marcadores de tinta permanente para rotular as garrafas, tampas e pipetas Ficha de registro de dados (Anexo 2), canetas e lápis para registrar os dados Luvas descartáveis Acetona (para limpeza) Etanol (para limpar as bancadas de trabalho) TFD4 ou Decon 90 (para limpar equipamentos em contato com compostos químicos) POP para testar a suscetibilidade dos mosquitos adultos aos inseticidas em bioensaios com garrafas da OMS 4 4. Saúde, segurança e proteção ambiental  Antes de utilizar qualquer composto químico, a equipe do laboratório deve ler e compreender a avaliação de riscos, as fichas deinformação de segurança do material e o controle de substâncias perigosas para a avaliação de saúde para cada químico utilizado.  Equipamento de proteção individual adequado deve ser usado sempre que se manuseiam inseticidas, incluindo jaleco, luvas, óculos de proteção e máscara facial ao pesar produtos químicos.  Garantir que todas as áreas de trabalho estão livres de outros materiais e limpas antes da realização do teste.  Toda equipe que trabalha no laboratório deve ter recebido treinamento inicial e o treinamento deve estar registrado na pasta individual de treinamentos.  Toda equipe que utiliza este procedimento deve estar treinada na operação segura das câmaras de exaustão química.  Eliminar adequadamente todos os resíduos, seguindo as orientações de segurança nacionais/institucionais.  Ao trabalhar com mosquitos, minimizar a fuga, mantendo todas as portas e janelas fechadas. Se alguns mosquitos escaparem, use imediatamente uma raquete elétrica para os eletrocutar. 5. Criação e preparação dos mosquitos Este bioensaio requer 150 mosquitos fêmea adultos, não alimentados com sangue, com idade de 3 a 5 dias. Os mosquitos precisam estar em jejum por 2 horas, antes de serem usados nos testes. Durante a criação, os mosquitos devem ser bem alimentados e mantidos em bandejas sem alta densidade durante as fases larvares e em gaiolas sem alta densidade durante a fase adulta. Isso é importante para minimizar a mortalidade devida a outras causas que não a exposição ao inseticida. Durante o período de exposição, é importante que o número de mosquitos por garrafa seja 25 ou o mais próximo possível de 25, mas não deve exceder 25, para evitar lotação dentro da garrafa. 5POP para testar a suscetibilidade dos mosquitos adultos aos inseticidas em bioensaios com garrafas da OMS 6. Preparação das soluções estoque das concentrações discriminatórias Alguns inseticidas podem ser dissolvidos apenas em acetona, mas outros (por ex., clotianidina, flupiradifurona, imidacloprid) tendem a cristalizar se forem dissolvidos apenas em acetona. A absorção de um inseticida cristalizado pelo organismo do inseto é muito baixa. Por conseguinte, um surfactante como o MERO® deve ser adicionado à acetona, antes de se preparar a solução estoque, a fim de evitar a cristalização do inseticida. Processo para a preparação e armazenamento da solução estoque 6.1. Verifique a concentração discriminatória do inseticida e o surfactante: As concentrações discriminatórias do inseticida e as quantidades adequadas de MERO® a serem usadas com diferentes compostos são apresentadas nas Tabelas 1 e 2 para Anopheles e Aedes spp., respectivamente. O Anexo 1 apresenta os cálculos para a quantidade de inseticida, solvente e surfactante para preparar a solução estoque. 6.2. Prepare a garrafa de vidro para armazenar a solução estoque: Use uma garrafa de vidro limpa e à prova de luz (de cor âmbar ou envolta em folha de alumínio, se for transparente) com um volume apropriado e rotule com a concentração e a data da solução estoque. 6.3. Prepare a solução estoque: • Prepare a balança electrônica: Coloque um pedaço de papel limpo para pesar (ou um microcopo de alumínio) na balança e tare para zero. • Com acetona como solvente: Para preparar um concentração de teste de 25 µg de IA para uma garrafa de vidro de 250 ml, pese 25 mg do IA usando uma espátula limpa e dissolva-o completamente em 1 L de acetona (solvente) ou qualquer outra mistura de solvente/surfactante recomendada pelo fabricante (ex., MERO® + acetona, ver procedimento abaixo). Alternativamente, para preparar um pequeno volume da solução estoque (ex., 5 mL), coloque 125 µg do IA na garrafa e adicione 5 ml de solvente/surfactante. Esta solução estoque conterá 25 µg de IA por mL da solução estoque. • Com acetona + MERO® (concentração de 1500 ppm) para testar o Aedes spp.: Pipete 0,17 mL (170 µL) de Mero® e misture com 100 mL de acetona em uma garrafa.. • Com acetona + MERO® (concentração de 800 ppm) para testar todos os Anopheles spp., exceto An. albimanus: Pipete 89 µL de Mero® e misture com 100 mL de acetona em uma garrafa ou, para um volume menor, pipete 8,9 µL de Mero® com 10 mL de acetona. • Com acetona + MERO® (concentração de 200 ppm) para testar An. albimanus: Para An. albimanus, a concentração de MERO® para o bioensaio com garrafa é inferior à usada para outros Anopheles spp (1). Para obter uma concentração de 200 ppm, pipete 22 µL de Mero® e misture com 100 mL de acetona em uma garrafa de vidro ou, para um volume menor, pipete 2,2 µl de Mero® com 10 mL de acetona. POP para testar a suscetibilidade dos mosquitos adultos aos inseticidas em bioensaios com garrafas da OMS 6 Tabela 1. Concentrações discriminatórias de inseticida para os bioensaios de garrafa OMS com mosquitos Anopheles spp. suscetíveis Classe de inseticida Inseticida Espécie Concentração discriminatória (1 h de exposição) Tempo de repouso Solvente ou solvente + surfactante Piretroides Transflutrina An. albimanus, An. stephensi, An. funestus s.s., An. minimus, An. gambiae s.s. 2 µg/garrafa 24 h Acetona Neonicotinoides Clotianidina An. albimanus, An. stephensi 10 µg/garrafa 24 h Acetona + MEROa 200 ppm Acetona + MEROa 800 ppm An. funestus s.s., An. gambiae s.s. 4 µg/garrafa 24 h Acetona + MEROa 800 ppm An. minimus 6 µg/garrafa 24 h Acetona + MEROa 800 ppm Butenólidos Flupiradifurona An. albimanus 500 µg/garrafa 24 h Acetona + MEROa 200 ppm An. stephensi, An. gambiae s.s. 60 µg/garrafa 24 h Acetona + MEROa 800 ppm An. funestus s.s., An. minimus 100 µg/garrafa 24 h Acetona + MEROa 800 ppm Pirroles Clorfenapir An. gambiae s.s., An. stephensi, An. funestus s.s., An. albimanus 100 µg/garrafa 72 h Acetona aMERO® (81% éster metílico de óleo de colza; fabricado por Bayer CropScience) Tabela 2. Concentrações discriminatórias de inseticida para os bioensaios de garrafa OMS com mosquitos Aedes spp. suscetíveis Classe de inseticida Inseticida Espécie Concentração discriminatória (1 h de exposição) Solvente ou solvente + surfactante Piretroides Transflutrina Ae. aegypti e Ae. albopictus 3 µg/garrafa Acetona Metoflutrina Ae. aegypti e Ae. albopictus 1 µg/garrafa Acetona Pralletrina Ae. aegypti e Ae. albopictus 30 µg/ garrafa Acetona Neonicotinoides Clotianidina Ae. aegypti 20 µg/ garrafa Acetona + MEROa 1500 ppm Ae. albopictus 10 µg/garrafa Acetona + MEROa 1500 ppm Butenólidos Flupiradifurona Ae. aegypti e Ae. albopictus 80 µg/ garrafa Acetona + MEROa 1500 ppm aMERO® (81% éster metílico de óleo de colza; fabricado por Bayer CropScience) 7POP para testar a suscetibilidade dos mosquitos adultos aos inseticidas em bioensaios com garrafas da OMS 6.4. Armazene e use a solução estoque • Mantenha a garrafa da solução estoque bem fechada, para evitar a evaporação da acetona, e armazene a garrafa em refrigerador a 4–8 ºC por no máximo 2 meses. • Para usar a solução estoque, tire a garrafa do refrigerador, coloque à temperatura ambiente (normalmente durante 30 minutos a 1 hora), retire o volume necessário com uma pipeta, feche imediatamente a garrafa e coloque de volta no refrigerador para futura utilização. Nota: se a garrafa que contém a solução estoque for aberta sem ser colocada à temperatura ambiente, o vapor de água pode condensar na garrafa e hidrolisar o inseticida ou a solução usada para impregnação da garrafa pode não secar adequadamente devido à presença de moléculas de água. 7. Procedimento para o bioensaio de garrafas Nota: Para testar o clorfenapir, será necessário efetuar os seguintes procedimentos em paralelo com ambos os mosquitos fêmea coletados em campo e provenientes de uma criação de laboratório. Passo 1: Impregnação das garrafas 7.1. Prepare garrafas limpas e secas: Pegue o número requerido de garrafas de vidro de 250 mL limpas e vazias, com tampas de rosca e seque-as num forno durante 20 minutos ou abertas por 1 a 2 horas, dependendo do nível de umidade (Fig. 1). Fig. 1. Garrafas abertas e tampas secando horizontalmente em um local escuro Fonte: foto por cortesia do Institut de Recherche pour le Développement, Montpellier, França 7.2. Se a solução estoque e os surfactantes tiverem sido guardados em um refrigerador: Retire as garrafas do refrigerador e deixe-as em temperatura ambiente repousando por 30 minutos a 1 hora, sem tirar a tampa. POP para testar a suscetibilidade dos mosquitos adultos aos inseticidas em bioensaios com garrafas da OMS 8 7.3. Identifique tanto as garrafas como as tampas com o nome, a concentração de inseticida (µg/garrafa) ou controle e data do teste. 7.4. Impregne o interior e as tampas das garrafas controle e de exposição: Faça a impregnação das garrafas controle primeiro e, depois, das garrafas com inseticida. Faça a impregnação das garrafas uma por uma seguindo os passos descritos abaixo e apresentados na Fig. 2. 7.4.1. Segure a garrafa em um ângulo de aproximadamente 45o com o gargalo apontado para cima. Adicione 1 mL de acetona (para as garrafas controle) e 1 mL de solução estoque de inseticida (para as garrafas de exposição) usando uma pipeta. Coloque a tampa e gire a garrafa pelo menos 5 vezes para impregnar a base (Fig. 2, passo 1). 7.4.2. Incline a garrafa ligeiramente em um ângulo com a tampa virada para baixo e gire pelo menos 5 vezes para impregnar a parte superior da garrafa e a tampa (Fig. 2, passo 2). 7.4.3. IIncline a garrafa em um ângulo ade aproximadamente 45o com a tampa virada para baixo e gire pelo menos 5 vezes para impregnar a tampa e o gargalo da garrafa (Fig. 2, passo 3). Repita os passos 7.4.1 a 7.4.3 pelo menos uma vez. 7.4.4. Coloque a garrafa de lado sobre uma superfície plana. Role a garrafa para a frente e para trás pelo menos 10 vezes antes de agitar uma vez e role outras 10 vezes ou mais, para garantir que todos os lados foram impregnados (Fig. 2, passo 4). 7.4.5. Repita os passos 7.4.1 a 7.4.4 pelo menos 3 vezes. Coloque a garrafa em uma câmara de exaustão e ligue a corrente para iniciar o exaustor. 7.4.6. Retire a tampa da garrafa para que a acetona evapore. Coloque a tampa virada para cima dentro da câmara de exaustão com a parte interior exposta ao ar. Nota: a evaporação da acetona pode causar alguma pressão na garrafa. Essa é uma situação normal, por isso, seja cuidadoso ao retirar a tampa da garrafa 7.4.7. Segure a garrafa em um ângulo de aproximadamente 45o com o gargalo virado para cima. Gire pelo menos 5 vezes para impregnar a base da garrafa (Fig. 2, passo 5). 7.4.8. Incline ligeiramente a garrafa em um ângulo com o gargalo virado para baixo, tendo o cuidado de não deixar verter qualquer líquido restante e rode pelo menos 5 vezes para impregnar a parte superior da garrafa (Fig. 2, passo 6). Repita os passos 7.4.7 e 7.4.8 pelo menos duas vezes. 9POP para testar a suscetibilidade dos mosquitos adultos aos inseticidas em bioensaios com garrafas da OMS 7.4.9. Coloque a garrafa de lado na câmara de exaustão. Role a garrafa para a frente e para trás pelo menos 10 vezes antes de agitar uma vez e role outras 10 vezes ou mais, para garantir que todos os lados foram impregnados (Fig. 2, passo 7) 7.4.10. Repita os passos 7.4.7 a 7.4.9 pelo menos 3 vezes até que o solvente tenha evaporado e deixe de ser visível. Verifique o solvente segurando a garrafa em um ângulo de aproximadamente 45o, com o gargalo virado para cima e espere para ver se resta algum solvente no fundo da garrafa. 7.5. Deixe as garrafas secarem durante 24 horas: Envolva as garrafas em folha de alumínio, para proteger o conteúdo da luz. Deixe as garrafas abertas e as tampas em uma câmara de exaustão sem uso (ou sala separada com ventilação) por 24 horas. Passadas as 24 horas, verifique se o interior das garrafas secou completamente. Nota: Enquanto as garrafas e as tampas secam, a câmara de exaustão deve ser mantida ligada e não deve ser limpa nem usada por outros operadores. Outros equipamentos e vidraria, ex. pipetas, podem ser limpos e retirados da câmara de exaustão, mas essa limpeza não deve interferir com a secagem das garrafas na câmara de exaustão. 7.6. Armazene as garrafas: Coloque as tampas nas garrafas e guarde-as em lugar escuro, fresco e seco até o uso.. Nota: O procedimento para impregnar as garrafas uniformemente pode ser praticado inicialmente impregnando uma ou mais garrafas com uma mistura de acetona e um agente colorante (ex. um corante ou tinta). Fig. 2. Procedimento para impregnação uniforme das garrafas com a mistura acetona/surfactante Fonte: Institut de Recherche pour le Développement, Montpellier, França 1 x3 x5 x5 x1 x10 x5 2 3 4 x2 5 6 7 x2 x5 x5 x1 x10 Coloque as garrafas na câmara de exaustão x3 POP para testar a suscetibilidade dos mosquitos adultos aos inseticidas em bioensaios com garrafas da OMS 10 Passo 2: Exposição dos mosquitos (Fig. 3) 7.7. Prepare as garrafas para a introdução dos mosquitos: Alinhe as garrafas com as suas tampas rosqueadas frouxamente para que seja fácil introduzir os mosquitos. Coloque um pedaço de rede sobre o gargalo de cada garrafa e prenda com um elástico. Nota: Os mosquitos fêmea adultos com 3–5 dias de idade não devem alimentar-se por 2 horas antes do teste Fig. 3. Diagrama mostrando o processo de exposição dos mosquitos nas garrafas Período de exposição (1 h): Introduza 25 mosquitos em cada garrafa de tratamento e controle Mosquitos silvestres Linhagem suscetível (somente para testes com clorfenapir) Tratamento TratamentoControle Controle Período de repouso (24 h ou 72 h): Transfira os mosquitos para os copos de repouso de papel. Forneça acesso à solução de água com açúcar. Faça leitura de mortalidade ao final das 24 h (ou 72 h para clorfenapir) = 25x 7.8. Aspire e introduza mosquitos nas garrafas: Introduza primeiro os mosquitos em todas as garrafas controle e depois nas garrafas impregnadas com inseticida. Use aspiradores diferentes para as garrafas controle e para as garrafas revestidas com inseticida. 7.8.1. Usando de preferência um aspirador mecânico, colete 25 mosquitos não alimentados com sangue para serem introduzidos em cada garrafa. 7.8.2. Introduza o aspirador com os 25 mosquitos na garrafa através do orifício na rede que cobre o gargalo da garrafa. Posicione a abertura do aspirador na parte central da garrafa e bata suavemente, liberando os mosquitos dentro da garrafa. 7.8.3 Coloque rapidamente a tampa na garrafa, para impedir que os mosquitos fujam. 7.8.4. Coloque a garrafa em posição vertical e ligue o cronômetro para registrar o tempo de exposição de 1 hora. 7.9. Deixe os mosquitos na garrafa durante uma hora. 11 POP para testar a suscetibilidade dos mosquitos adultos aos inseticidas em bioensaios com garrafas da OMS 7.10. Durante o tempo de exposição, prepare os 6 copos de papel para repouso: Coloque um pedaço de rede perfurado mas tapado com algodão sobre a abertura de cada copo de papel de 440 mL e prenda com um elástico. 7.11. Transfer mosquitoes to the holding paper cups and hold them for 24 hours (or 72 hours for chlorfenapyr): Aspire suavemente os mosquitos para fora da garrafa, de preferência usando um aspirador mecânico e libere-os dentro dos copos de repouso cobertos com a rede.2 Coloque um chumaço de algodão embebido em solução de açúcar a 10 % sobre a rede. Para garantir a consistência dos resultados, especialmente com compostos que têm um modo de ação particular (por ex., o clorfenapir), mantenha os copos de tratamento e de controle rigorosamente a 27 °C ± 2 °C e 75 % ± 10 % de umidade relativa durante todo o teste. 7.12. Registre os mosquitos caídos: : Logo após transferir os mosquitos para os copos de papel, registre o número de mosquitos caídos, conforme a definição da Tabela 3. 7.13. Registre a mortalidade após 24 horas (ou 72 horas para o clorfenapir): Conte e registre o número de mosquitos encontrados mortos e vivos 24 horas após a exposição (ou 72 horas para o clorfenapir), conforme as definições apresentadas na Tabela 3. Introduza os dados na ficha de registro ou no sistema electrônico de coleta de dados. Tabela 3. Orientações da OMS para queda e mortalidade de mosquitos após o teste Mosquitos considerados vivos após 1 h de exposição, ou 24 h, 48 h ou 72 h após a exposição Mosquitos considerados caídos após 1 h de exposição ou mortos 24 h, 48 h ou 72 h após a exposição • Consegue manter-se de pé e voar de forma coordenada • Sem sinal de vida; imóvel; não se mantém de pé • Qualquer mosquito que não consegue manter-se de pé (ex., tem 1 ou 2 pernas) • Qualquer mosquito que não consegue voar de forma coordenada • Qualquer mosquito deitado de costas, mexendo as pernas e as asas mas que não consegue levantar vo • Qualquer mosquito que consegue pôr-se de pé e levantar voo por instantes mas cai imediatamente Fonte: adaptado da página 77 do relatório da décima quinta reunião do grupo de trabalho do WHOPES (2) 2 AUma sugestão alternativa feita na reunião consultiva da OMS em Outubro de 2021 para revisar os resultados do estudo laboratorial multicêntrico para determinar as concentrações de inseticida para monitorar a resistência (1), foi primeiro liberar os mosquitos de uma garrafa dentro de uma gaiola de liberação e depois coletar os mosquitos da gaiola. Tem sido afirmado que isso melhora a taxa de sobrevivência dos mosquitos controle. Contudo, este método não foi usado no estudo da OMS. POP para testar a suscetibilidade dos mosquitos adultos aos inseticidas em bioensaios com garrafas da OMS 12 8. Critérios para a rejeição do teste Para todos os inseticidas o teste deve ser descartado e repetido se a mortalidade do controle for >20 %. Para o clorfenapir, o bioensaio deve ser descartado se a mortalidade no grupo controle da amostra de mosquitos silvestres ou no grupo controle da amostra da linhagem suscetível for >20 %, ou se a temperatura durante o bioensaio estiver fora do intervalo 27 °C ± 2 °C. 9. Registro de dados e cálculo dos resultados dos testes Durante o teste, os dados devem ser inseridos em formulários de registro de dados em papel ou digitais. O Anexo 2 deste POP fornece um modelo em papel. Formulários digitais baseados em DHIS2 estão disponíveis na página eletrônica do Programa Global de Malária da OMS.3 O ponto final do teste é a mortalidade dos mosquitos 24 horas (ou 72 horas para o clorfenapir) após 1 hora de exposição ao inseticida. Por conseguinte, o número de mosquitos mortos é contado 24 horas (ou 72 horas) após um período de exposição de 1 hora. A mortalidade dos mosquitos deve ser calculada separadamente para as garrafas de tratamento e para as garrafas controle e, no caso do clorfenapir, separadamente para os mosquitos silvestres e para a linhagem suscetível. Portanto, para o clorfenapir, as mortalidades devem ser calculadas em cada um destes 4 grupos de mosquitos: controle de silvestres, tratamento de silvestres, controle da linhagem suscetível e tratamento da linhagem suscetível. A mortalidade no grupo de tratamento é calculada somando o número de mosquitos mortos em todas as réplicas com garrafas com inseticida e depois expressando-a como percentagem do número total de mosquitos nessas réplicas. A mortalidade no grupo controle é calculada do mesmo modo: Mortalidade no tratamento (%) = Número de mosquitos fêmea tratados mortos Número total de mosquitos fêmea tratados x 100 Mortalidade no controle = (%) Número de mosquitos fêmea controle mortos Número total de mosquitos fêmea controle x 100 • Se a mortalidade do controle for <5 %, nenhuma correção dos resultados do teste é necessária. • Se a mortalidade do controle for ≥5 % e ≤20 %, a mortalidade do teste deve ser corrigida com a mortalidade do controle usando a fórmula de Abbott, como se segue: Mortalidade corrigida = (% mortalidade de tratamento – % mortalidade do controle) (100 – % mortalidade do controle) x 100 3 https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/prevention/vector-control/dhis-data-collection-and-collation-tools 13 POP para testar a suscetibilidade dos mosquitos adultos aos inseticidas em bioensaios com garrafas da OMS 10. Interpretação dos resultados do teste Para todos os inseticidas, exceto para o clorfenapir: • Suscetibilidade: uma população de vetores é considerada suscetível a um inseticida, se a mortalidade dos mosquitos (corrigida pela fórmula de Abbott) for ≥98 %. • Possível resistência: Se a mortalidade observada (corrigida pela fórmula de Abbott, se necessário) for ≥90 % mas <98 %, a presença de resistência é possível, mas não confirmada. Os resultados do teste devem ser confirmados repetindo o teste com uma nova amostra da mesma população de mosquitos. (Nota: evitar usar F1 dos mosquitos testados.) Se 2 testes revelarem consistentemente uma mortalidade <98 %, a resistência está confirmada • Resistência confirmada: uma população de vetores é considerada resistente a um inseticida, se a mortalidade (corrigida pela fórmula de Abbott) for < 90%. Para o clorfenapir: Os bioensaios com garrafas da OMS com clorfenapir revelaram alguma variabilidade interlaboratorial nos resultados do teste devido à forte influência das condições do teste (especialmente a temperatura durante os bioensaios). Por conseguinte, para confirmar a resistência ao clorfenapir em uma população de vetores silvestres, pelo menos 3 bioensaios com garrafas da OMS precisam ser realizados com a mesma população de vetores. Além disso: • a temperatura deve ser mantida em 27 °C ± 2 °C e a umidade relativa em 75 % ± 10 % durante os 3 testes; • a mortalidade dos mosquitos em teste 72 horas após a exposição deve ser <90 % nos 3 testes; e • a mortalidade na linhagem laboratorial suscetível, testada em paralelo com os mosquitos silvestres, deve ser ≥98 % nos 3 testes. 11. Procedimento de lavagem das garrafas Apresentamos, abaixo, duas opções diferentes para lavagem das garrafas, conforme a disponibilidade de agentes de lavagem. Método de lavagem genérica usando Decon ou TFD4 1. Remova quaisquer rótulos adesivos das garrafas antes da lavagem. 2. Adicione aproximadamente 10 mL de acetona em cada garrafa a ser lavada e feche com uma tampa. 3. Agite vigorosamente as garrafas, uma a uma. 4. Descarte a acetona. 5. Prepare uma solução de Decon a 2–5 % (ou produto equivalente, por exemplo, detergente alcalino TFD4 a 10 %) em água quente em um recipiente aberto de 20 L ou pia. POP para testar a suscetibilidade dos mosquitos adultos aos inseticidas em bioensaios com garrafas da OMS 14 6. Mergulhe as garrafas e as tampas rinsadas com acetona na solução de Decon e deixe durante a noite. 7. No dia seguinte, retire as garrafas e as tampas da solução, esfregue bem todas as garrafas e tampas com a solução de Decon usando uma escova limpa e enxague bem por 3 vezes com água da torneira. 8. Mergulhe as garrafas e as tampas em água limpa da torneira, em um recipiente ou pia durante 24 horas. 9. Retire as garrafas, enxague com água limpa da torneira e seque-as durante 6–8 horas num suporte viradas para baixo (como mostrado na Fig. 4) ou seque as garrafas e as tampas em estufa a 50 oC por 20–30 minutos. Aumente o tempo de secagem se umidade ainda for visível nas garrafas. Procedimento para lavagem em locais onde o Decon ou TFD4 não estão disponíveis 1. Remova quaisquer rótulos adesivos das garrafas antes da lavagem. 2. Rinse as garrafas com acetona, se disponível, conforme descrito acima. 3. Prepare uma solução de sabão a 10 % em água quente em um recipiente aberto de 20 L ou pia. 4. Mergulhe as garrafas e as tampas na água com sabão durante 24 horas. 5. Retire-as da água com sabão e i) esfregue bem todas as garrafas e tampas com a solução de sabão, usando uma escova limpa e enxague bem por 3 vezes com água da torneira, ou ii) lave-as em uma máquina de lavar louça com água quente. 6. Mergulhe as garrafas e as tampas em água limpa da torneira em um recipiente ou pia durante 24 horas. 7. Retire as garrafas, enxague com água limpa da torneira e seque-as num suporte durante 6–8 horas viradas para baixo (como mostrado na Fig. 4), ou seque as garrafas e as tampas em estufa a 50 °C por 20–30 minutos. Aumente o tempo de secagem, se umidade ou gotículas de água ainda forem visíveis nas garrafas. Para ter a certeza de que não restam resíduos de inseticida nas garrafas lavadas, é recomendável verificar a qualidade da lavagem selecionando ao acaso algumas garrafas secas e expondo 5 mosquitos em cada uma delas, registrando os que caem ao fim de uma hora de exposição e a mortalidade 24 horas de repouso após a exposição. 15 POP para testar a suscetibilidade dos mosquitos adultos aos inseticidas em bioensaios com garrafas da OMS Fig. 4. Método de secagem das garrafas de vidro viradas para baixo sobre varetas de aço verticais Fonte: foto por cortesia do Institut de Recherche pour le Développement, Montpellier, França 12. Agradecimentos A OMS agradece as contribuições do Dr. Vincent Corbel, Mr Stephane Duchon e Ms Laura Andreo, do Instituto de Pesquisa para o Desenvolvimento, de Montpellier, França, e da Dr.ª Rosemary Lees, da Escola de Medicina Tropical de Liverpool, Reino Unido da Grã Bretanha e Irlanda do Norte pela preparação da primeira versão deste POP e sua finalização após a revisão por pares. A revisão e harmonização deste POP foram efetuadas por Ms Lucia Fernandez Montoya, do Programa Global de Malária da OMS, Genebra, Suíça. O OMS também gostaria de agradecer à Dr.ª Cynara Rodovalho e Mr Diogo Bellinato, do Laboratório de Fisiologia e Controle de Artrópodes Vetores da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz) no Brasil, e à Sra. Sónia Casimiro Trigo, do Escritório da OMS em Moçambique, por sua contribuição para a versão em português deste documento. O desenvolvimento deste POP foi coordenado pelo Dr. Rajpal S. Yadav, do Departamento de Controle das Doenças Tropicais Negligenciadas, da OMS, Genebra, Suíça. 13. Referências 1. Determinar concentrações discriminatórias de inseticidas para a monitorização da resistência em mosquitos: relatório de um estudo laboratorial multicêntrico com recomendações de consultas da OMS. Genebra, Organização Mundial da Saúde, 2022.(https://apps.who.int/iris/handle/10665/352616, acedido a 27 de maio de 2022). 2. Relatório da décima quinta reunião do grupo de trabalho do WHOPES. Sede da OMS, Genebra, 18 a 22 Junho de 2012, Genebra, Organização Mundial da Saúde, 2012 (https://apps.who.int/iris/handle/10665/75304, acedido a 3 de Janeiro de 2022). Para mais informações, por favor contate: : vectorsurveillance@who.int POP para testar a suscetibilidade dos mosquitos adultos aos inseticidas em bioensaios com garrafas da OMS 16 Anexo 1. Cálculos para preparo de soluções para os ensaios com garrafas da OMS A. Cálculos para a quantidade de ingrediente ativo (IA), solvente e surfactante para preparo da nsolução estoque inicial e subsequentes diluições para concentrações seriadas para impregnação das garrafas A planilha de cálculos Excel está disponível online em: https://cdn.who.int/media/docs/default-source/ntds/vector-ecology-mangement/calculation-tables-paper-impregnation-garrafas-17jan2022-locked.xlsx Na planilha Excel, ao introduzir os valores nas células verdes, os valores das células brancas serão calculados automaticamente. Cálculo do peso do IA em g ajustado para a pureza do IAI Cálculo do peso do IA em mg ajustado para a pureza do IA Grupo da classe do inseticida Surfactante Inseticida Concentração pretendida do IA nas garrafas (µg /garrafa) N.º de garrafas para impregnar Quantidade de surfactante por garrafa* (ppm ou µg) Peso total de surfactante necessário (mg) Densidade do surfactante Volume do surfactante (mL) Volume da acetona (mL) Volume total da solução de impregnação (mL) Quantidade de IA a ser pesado para impregnar as garrafas (g) Pureza do IA do inseticida (%) Quantidade ajustada de IA a ser pesado (g)* Peso exato do IA (g)** Volume total ajustado da solução de impregnação (mL)*** Quantidade de IA a ser pesado ** Peso exato do IA (mg)*** Volume total ajustado da solução de impregnação (mL)*** a b c d = (b × c)/1000 e f = (d/e) / 1000 g = (b × 1) - f h= f + g i = (a x b) / 106 j k = i x (100 / j) l m = (l × h) / k n = k x 1000 o p = (o × h ) / n ex. MEROa 1 800 0,8 0,900 0,001 1,00 1 0,000000 99,2 0,000000 #DIV/0 0,00 1 #DIV/0 Controle 1 800 0,8 0,900 0,001 1,00 1 Nenhumb 1 1,00 1 0,000000 99,8 0,000000 #DIV/0 0,00 1 #DIV/0 Controle 1 1,00 1 IA, ingrediente ativo MERO, 81% éster metílico do óleo de colza * Considerando a pureza do IA do inseticida ** Peso exato do IA apresentado na balança electrônica *** Este é o volume ajustado para o peso exato do IA; use 1 mL da solução para impregnar uma garrafa de 250 ml a Por exemplo, clotianidina b Só com a acetona como solvente; por exemplo, clorfenapir e piriproxifen 17 POP para testar a suscetibilidade dos mosquitos adultos aos inseticidas em bioensaios com garrafas da OMS B. Diluições da solução estoque com acetona ou acetona + surfactante para preparar concentrações seriadas de inseticidas para impregnação das garrafas A planilha de cálculos Excel está disponível online em: https://cdn.who.int/media/docs/default-source/ntds/vector- ecology-mangement/calculation-tables-paper-impregnation-garrafas-17jan2022-locked.xlsx Na planilha Excel, ao introduzir os valores nas células verdes, os valores das células brancas serão calculados automaticamente. a. Somente com acetona (i.e., sem surfactante; exemplos– clorfenapir e piriproxifeno) Concentração final do IA(µg/ garrafa)** Volume final de acetona (mL)* Concentração do IA na solução estoque inicial (µg/garrafa)** Volume pipetado da solução estoque inicial (mL) Volume de acetona a ser adicionado (mL) a b c d = (a x b)/c e = b - d Solução estoque* 100 Diluição em série n.º 1 50 5 100 2.50 2.50 Diluição em série n.º 2 30 5 100 1.50 3.50 Diluição em série n.º 3 20 5 100 1.00 4.00 Diluição em série n.º 4 10 5 100 0.50 4.50 Diluição em série n.º 5 5 5 100 0.25 4.75 b. Com acetona e um surfactante (por ex., MERO) – exemplo de clotianidina Concentração final do IA (µg/garrafa) Volume final de acetona + surfactante (mL)** Concentração do IA na solução estoque inicial (µg/garrafa) Volume pipetado da solução estoque inicial (mL) Volume da solução de acetona + surfactante a ser adicionado (mL) a b c d = (a x b)/c e = b - d Solução estoque* 100 Diluição em série n.º 1 50 5 100 2.50 2.50 Diluição em série n.º 2 30 5 100 1.50 3.50 Diluição em série n.º 3 20 5 100 1.00 4.00 Diluição em série n.º 4 10 5 100 0.50 4.50 Diluição em série n.º 5 5 5 100 0.25 4.75 IA, ingrediente ativo MERO, 81 % éster metílico do óleo de colza * A solução estoque inicial é preparada pesando uma quantidade adequada do IA e ajustando o volume necessário de solvente com ou sem surfactante ** Prepare o volume final de acordo com o número de garrafas a impregnar (por ex., são necessários 5 ml para impregnar 4 garrafas, de modo a compensar uma eventual perda de solução durante o procedimento) POP para testar a suscetibilidade dos mosquitos adultos aos inseticidas em bioensaios com garrafas da OMS 18 19 POP para testar a suscetibilidade dos mosquitos adultos aos inseticidas em bioensaios com garrafas da OMS Anexo 2. Formulário de registro de dados para os bioensaios com garrafas da OMS Formulário de registro de dados – bioensaio com garrafas da OMS para testar a suscetibilidade de mosquitos adultos aos inseticidas Para ser preenchido somente com tinta preta ou azul. Não use lápis ou líquido corretivo. Data do bioensaio (dd/mm/aa): Nome do técnico: País/local da captura dos mosquitos: Coordenadas Latitude: Longitude: Period of mosquito collection: Data de início: Data de fim: Método de captura: Inseticida testado e concentração: Data da impregnação das garrafas (dd/mm/aa): Número de vezes que as garrafas impregnadas/ controle foram usadas anteriormente: Temperatura de armazenamento das garrafa Máx: Mín: Espécie do mosquito: Linhagem do mosquito: Idade das fêmeas (dias): Estado nutricional: (não alimentadas; alimentadas com açúcar e e deixadas em jejum; outro, especificar) Hora do início da exposição (hh/mm): Hora do fim da exposição (hh/mm): Temperatura durante a exposição + período de repouso (°C): Máx: Mín: Umidade relativa durante a exposição + período de repouso (%): Máx: Mín:  POP para testar a suscetibilidade dos mosquitos adultos aos inseticidas em bioensaios com garrafas da OMS 20 Results per garrafa Fases do teste Garrafas N.º de mosquitos caídos após 1 h de exposição N.º de mortos 24 h após 1 h de exposição No. dead 24 h after 1 h exposure Mortalidade 24 h após 1 h de exposição [Para o clorfenapir] N.º de mortos 48 h após 1 h de exposição [Para o clorfenapir] N.º de mortos 72 h após 1 h de exposição [Para o clorfenapir] N.º de mortos 72 h após 1 h de exposição Mosquitos silvestres expostos à CDa do inseticida Garrafa w1 Garrafa w2 Garrafa w3 Garrafa w4 Mosquitos silvestres controle Garrafa controle w1 Garrafa controle w2 [Para o clorfenapir] Mosquitos suscetíveis expostos à CDa do inseticida Garrafa s1 Garrafa s2 Garrafa s3 Garrafa s4 [Para o clorfenapir] Mosquitos suscetíveis controle (expostos à acetona) Garrafa controle s1 Garrafa controle s2 a DC, concentração discriminatória  21 POP para testar a suscetibilidade dos mosquitos adultos aos inseticidas em bioensaios com garrafas da OMS Results per garrafa Fases do teste Garrafas N.º de mosquitos caídos após 1 h de exposição N.º de mortos 24 h após 1 h de exposição No. dead 24 h after 1 h exposure Mortalidade 24 h após 1 h de exposição [Para o clorfenapir] N.º de mortos 48 h após 1 h de exposição [Para o clorfenapir] N.º de mortos 72 h após 1 h de exposição [Para o clorfenapir] N.º de mortos 72 h após 1 h de exposição Mosquitos silvestres expostos à CDa do inseticida Garrafa w1 Garrafa w2 Garrafa w3 Garrafa w4 Mosquitos silvestres controle Garrafa controle w1 Garrafa controle w2 [Para o clorfenapir] Mosquitos suscetíveis expostos à CDa do inseticida Garrafa s1 Garrafa s2 Garrafa s3 Garrafa s4 [Para o clorfenapir] Mosquitos suscetíveis controle (expostos à acetona) Garrafa controle s1 Garrafa controle s2 a DC, concentração discriminatória Resultados finais (todas as garrafas) Caídos % Mortalidade % Mortalidade % corrigida por Abbott Ao fim de 1 h de exposição 24 h 72 h (para o clorfenapir) 24 h 72 h (para o clorfenapir) Mosquitos silvestres expostos à CD do inseticida Mosquitos silvestres controle Resultado do teste A população de vetores é (suscetível/resistente/possivelmente resistente) ao inseticida Observações, se houver: Verificado pelo Supervisor: Data:  POP para testar a suscetibilidade dos mosquitos adultos aos inseticidas em bioensaios com garrafas da OMS 22 Procedimento operacional padrão para testar a suscetibilidade dos mosquitos adultos aos inseticidas em bioensaios com garrafas da OMS [Standard operating procedure for testing insecticide suscep- tibility of adult mosquitoes in WHO bottle bioassays] ISBN 978-92-4-007909-0 (versão electrónica) ISBN 978-92-4-007910-6 (versão impressa) © Organização Mundial da Saúde 2023. Alguns direitos reservados. Este trabalho é disponibilizado sob licença CC BY-NC-SA 3.0 IGO. A menção de determinadas companhias ou do nome comercial de certos produtos não implica que a Organização Mundial da Saúde os aprove ou recomende, dando-lhes preferência a outros análogos não mencionados. Salvo erros ou omissões, uma letra maiúscula inicial indica que se trata dum produto de marca registado.