Étude de la thermostabilité du vaccin antiamaril sur des échantillons de huit lots provenant de divers pays

Bull. Org. mond. Sante 1971, 44, 729-737 Bull. Wld Hlth Org. Etude de la thermostabilite du vaccin antiamaril sur des dchantillons de huit lots provenant de divers pays Y. ROBIN,1 A. C. SAENZ,2 A. S. OUTSCHOORN 3 & B. GRAB' Les epid6mies de fievre jaune, qui se sont multipliges en Afrique depuis une decennie, ont rendu ne&cessaire l'execution de campagnes de vaccination de masse avec le vaccin 17 D dans des regions de la zone tropicale ou' les communications sont parfois tres lentes et l'equipement en appareils frigorifiques insuffisant. II est alors difficile pour les equipes de vaccination en deplacement de conserver le vaccin dans des conditions normales, c'est-a-dire de le maintenir a une tempe'rature infe'rieure Q +4°C - niveau qui ne peut e'tre depasse qu'exceptionnellement - pendant un delai n'excedant pas trois mois. II etait donc tre's important de preciser la stabilite du vaccin 17 D a differentes tempe- ratures pendant des periodes de une semaine & six mois. Les auteurs rapportent ici les resultats de l'e'tude qu'ils ont effectuee sur des lots de vaccins prepare6s par sept laboratoires producteurs. La stabilite du vaccin antiamaril retient l'attention de l'OMS depuis quelque temps. I1 s'agit d'une pro- priete dont depend la quantit6 de virus effectivement administree a l'homme dans les diff6rentes pr6para- tions vaccinales utilisees, selon leur mode de fabrica- tion et leur stockage. Sa prise en consideration est importante tant dans les problemes de transport du vaccin sous les climats particulierement chauds qu'en rapport avec la disponibilite de mat6riel suffisamment stable pour servir de preparation internationale de ref6rence de vaccin antiamaril. La Vingt-troisieme Assemblee mondiale de la Sante a examine les . Problemes actuels poses par la fievre jaune en Afrique *. Elle a note que 4 les vaccins contre la fievre jaune pr6pards avec la souche 17 D sont tres efficaces * et conferent une protection de longue duree, mais elle a reconnu que * des recherches suppl6mentaires sur la thermostabilitd du vaccin sont encore n6cessaires #.5 1 Sous-Directeur de l'Institut Pasteur de Dakar, Dakar, S6n6gal. 'Anciennement: service des Maladies a virus, Organisa- tion mondiale de la Sant6, Geneve, Suisse. 'Chef du service de la Standardisation biologique, Organisation mondiale de la Sant6, Geneve. ' Service de la M6thodologie des statistiques sanitaires, Organisation mondiale de la Sante, Geneve. & R6solution WHA23.34. Un groupe d'6tude des normes relatives au vaccin antiamaril (1959) a pr6cis6 les conditions d'une epreuve applicable A I'estimation du contenu du vaccin en virus actif, fondee sur la determination de la teneur en doses de virus letales pour la souris dans la dose de vaccin recommand&e pour l'homme. Ce groupe a, de plus, stipule que o le fabricant doit recommander des conditions de stockage et d'expe- dition permettant au vaccin pret A l'emploi de rester conforme aux normes concernant l'activit6 jusqu'A la date-limite d'utilisation indiqu6e sur l'etiquette #. La possibilit6 de disposer d'une preparation de virus antiamaril stable, utilisable comme mat6riel de ref6- rence, permettrait la mise au point, pour le controle des vaccins antiamarils, de meilleures m6thodes (par exemple lorsqu'il s'agit de d6terminer la teneur en virus actif) conduisant A des resultats mieux com- parables entre vaccins, et 1'execution d'etudes conve- nables concernant la teneur en virus du vaccin reconstitue sur le terrain. On pourrait alors etablir des normes satisfaisantes en rapport avec les periodes de conservation du vaccin avant son utilisation, par exemple au moyen d'epreuves basees sur la demi-vie du virus vaccinal. Dans le cadre des programmes OMS de standar- disation biologique et de lutte contre les maladies virales, a ete organisee une etude de la thermostabilit6 2685 -729- Y. ROBIN ET COLLABORATEURS de certains vaccins antiamarils de preparation cou- rante. Ceux-ci ont pu etre compares directement, toutes les estimations de teneur en virus actif etant effectuees dans un seul et meme laboratoire. L'Ins- titut Pasteur de Dakar (Senegal) a bien voulu se charger de cette partie des travaux. Six laboratoires, choisis au hasard dans differentes regions et produc- teurs de vaccin antiamaril agree par l'OMS pour les primovaccinations et les vaccinations de rappel exi- gees aux fins des voyages intemationaux, ont ete invites a fournir chacun 75 ampoules au moins d'un meme lot. Le laboratoire charge de l'expertise a fourni lui-meme un materiel analogue provenant de deux lots. Les laboratoires ont egalement commu- nique leurs protocoles de fabrication et d'epreuve de chacun des vaccins fournis. Ces laboratoires sont enumeres dans l'annexe, mais dans un ordre inde- pendant du numerotage des vaccins dans le present rapport. Tout le materiel necessaire a cette etude a ete fourni a titre gracieux. Que les genereux dona- teurs trouvent ici l'expression d'une vive gratitude. MATERIEL ET METHODES Origine des vaccins A leur arrivee a Dakar, les colis contenant les ampoules de vaccin ont ete pris en charge par une personne etrangere au titrage qui a note la date d'arrivee, la nature du refrigerant et la temperature au niveau des ampoules mesuree a l'aide d'une sonde thermique. Chaque ampoule a e conservee a -70°C jusqu'au jour de l'epreuve. Dans notre expose, nous designerons les preparations de vaccins par le numero qu'ils ont requ lors de leur prise en charge. Il y a eu en tout 8 preparations de vaccin, numerotees de 1 a 8, l'Institut Pasteur de Dakar ayant foumi deux preparations. Epreiuve thermique Le comportement des vaccins a ete etudie apres 1 semaine, 2 semaines, 4 semaines, 6 semaines, 3 mois et 6 mois de sejour a quatre temperatures differentes: -20°C, + 5°C, +22°C et + 37°C. -20°C: cette temperature est realisee dans une sorbe- tiere (deep freeze). Le contr6le de la temperature est effectue a l'aide d'une sonde thermique avec cadran exterieur a l'appareil. +5 C: on a utilise un refrigerateur menager muni d'une sonde thermique avec cadran mural. +22°C: on a utilise l'etuve reglee a 22°C (±1 Q qui sert A l'inactivation du vaccin antirabique. +37°C: les ampoules ont et immerg&es dans un bain- marie 6quip, d'un microthermostat electrique Rotax assurant une temperature constante de 37°C aI1/10 de degre pres. Pour eliminer les risques d'inactivation des vaccins par rayonnement ultraviolet, les ampoules ont ete enveloppees dans du papier d'aluminium. Epreuves de laboratoire Souris. Les souris utilisees pour le titrage appar- tiennent a un elevage de souris blanches provenant de reproducteurs fournis par le Yellow Fever Research Institute de Yaba (Nigeria), il y a 20 ans. L'elevage, qui appartient a l'Institut, est situe a 15 km de Dakar. Les souris de quatre semaines sont commandees le vendredi et utilisees le mardi ou le mercredi suivant. Elles sont gardees dans des cages rectangulaires, chaque cage pouvant contenir 100 souris. L'affectation aleatoire des souris a ete faite par tirage au sort en deux etapes, la premiere aboutissant a la repartition en boite, chaque boite correspondant a un titrage (32 boites de 36 souris), la seconde consistant a repartir les souris de chaque boite en quatre bocaux, chaque bocal correspondant a une dilution du vaccin a eprouver, soit 9 souris par bocal. Les souris inoculees ont ete gardees en observation pendant une duree de 21 jours. Titrage a) Diluant: solution tampon phosphatee, pH 7,4, contenant 0,75 % d'albumine bovine (fraction V Armour). b) Rehydratation: les ampoules ont ete rehydra- tees dans le volume de diluant indique par le four- nisseur sauf en ce qui conceme le lot No 4 qui contenait 1 ml de jus embryonnaire pur par ampoule et qui a ete rehydrate a raison de 10 ml de diluant par ampoule (au lieu de 100). Le volume de diluant correspondant a la rehydra- tation de trois ampoules par lot est mesure a la pipette et depose dans un tube de verre d'un volume suffisant. Avec une seringue de 5 ml munie d'une aiguille de 80 x 12/10 mm, on preleve une partie du diluant pour rehydrater une ampoule. On effectue seize aspirations-refoulements successifs en evitant de faire mousser; l'ampoule est rincee une fois. On effectue la meme operation sur les seconde et troisieme ampoules et le vaccin reconstitue est laisse 25 minutes a la temperature du laboratoire 730 731THERMOSTABILXT.E DE DIVERS LOTS DE VACCIN ANTIAMARIL Tableau 1. R6sultats des titrages Titre obtenu (log DLsoIO,03 ml intrac6r6brale; souris de 4-6 semaines) Temperature D6lai Vaccin Vaccin Vaccin Vaccin Vaccin Vaccin Vaccin Vaccin No°1 N°2 No03 N04 No5 N°6 No7 | N°8 1 semaine 2,90 2,80 3,50 3,83 3,44 4,29 3,25 3,43 2 semaines 3,0 2,89 4,12 3,67 3,28 4,28 3,24 2,80 4 semaines 2,45 3,0 3,47 3,71 2,90 3,80 2,80 2,68 -20'C 6 semaines 3,09 2,32 3,64 3,23 2,50 3,64 2,74 3,0 3 mois 2,27 2,00 3,70 3,53 3,0 4,20 2,89 3,16 6 mois 2,68 2,73 3,56 3,20 3,0 3,49 3,0 2,78 1 semaine 3,38 2,80 3,39 4,10 3,50 4,0 3,10 3,5 2 semaines 2,82 2,67 3,57 3,44 3,34 3,68 2,71 3,27 4 semaines 3,0 2,38 3,42 3,10 3,24 3,70 2,89 2,60+5.C 6 semaines 2,85 1,88 3,43 2,90 2,56 3,64 2,50 3,0 3 mois 2,32 2,37 2,89 3,15 3,10 3,74 2,41 2,89 6 mois 3,0 2,81 3,0 3,32 2,64 3,45 2,18 2,63 1 semaine 1,83 2,30 3,58 3,19 3,25 3,44 3,0 3,33 2 semaines 1,56 2,62 3,34 3,10 2,80 3,87 2,71 2,87 4 semaines 1,31 1,61 2,80 2,50 2,37 3,57 2,42 2,70 +22'C 6 semaines 2,13 1,50 2,50 2,70 2,33 2,73 1,81 1,67 a 3 mois 1,75 1,43 2,43 2,19 1,40 2,65 2,0 2,50 6 mois 2,22 b 2,16 1,67 b 2,42 1,20 2,34 1 semaine 1,55 1,89 2,50 2,56 2,33 2,70 2,20 2,0 2 semaines 2,0 1,62 2,50 2,64 1,57 2,50 1,20 2,20 4 semaines 1,38 1,20 2,16 1,41 1,0 2,12 1 2,11 +37'C 6 semaines 1,28 1 1,43 1,35 0,5 1,34 1 1,24 3 mois b - - - - - -- 6 moisb1 - - - - - a Une ampoule d6fectueuse sur les trois utilis6es. b Titrage non pratique. 2 Y. ROBIN ET COLLABORATEURS (+28,50C). Le vaccin reconstitue est considere comme non dilue. c) Dilutions: dilutions en s6rie de 10 en 10 jusqu'a 10-5 en transferant 0,03 ml de dilution de virus (mesur6 entre deux traits d'une pipette) dans 2,7 ml de diluant reparti en tubes A hemolyse. On change de pipette a chaque dilution pour effectuer le melange par seize aspirations-refoule- ments en evitant de faire mousser. Les quatre tubes correspondant aux dilutions a inoculer aux souris sont places dans un bain glace (eau et glace). d) Inoculations: on utilise des seringues de 0,25 ml munies d'une aiguille de 10-5/10 mm 'a biseau court, la meme seringue servant pour les quatre dilutions en commen9ant par la dilution la plus elevee. La seringue est rincee cinq fois dans chaque dilution dont on inocule 0,03 ml par voie intracdrebrale a chaque souris, 9 souris etant utilisees pour chaque dilution. Les souris ne sont pas anesthesi6es. Apres inoculation, les souris sont remises dans leur bocal, et observees pendant 21 jours. On n'a pas tenu compte, pour le calcul du titre, des souris mortes avant le 8e jour et de toutes les souris mortes par la suite sans avoir presente de paralysies. Les souris paralys6es mais non mortes le 21 e jour ont e considerees comme survivantes. Les titres ont ete calcules par la methode de Reed & Muench (1938) et exprimes en logarithme DL50/0,03 ml. Au cours d'une meme manipulation, on a eprouve tous les vaccins a une meme temperature. On a pu etudier ainsi une temperature le matin et une l'apres-midi, deux jours de suite. L'emploi du temps a ete minute de fagon que la duree de la manipula- tion soit identique pour chaque vaccin: rehydratation: 10 minutes, diffusion : 25 minutes, dilution : 5 minutes, inoculation : 10 minutes. En general, on n'a pas poursuivi l'etude d'un vaccin dont le titre s'etait montre inferieur au mini- mum exige par le groupe d'etude des normes relatives au vaccin antiamaril (1959) de 1000 DL50 souris par dose vaccinale, soit 1,78 pour le log DL50/0,03 ml. 0 +04l) 4-0 (a, C.0 0 C4 Om U) 4- 0 0 (o 4- 0 10 0 C 0 0 E 10 -0 ~0 a 0 a.) C 0 0 0 .0 10 R#ISULTATS Les resultats des titrages sont representes dans les tableaux 1, 2 et 3 et sur les figures 1, 2 et 3. co00 z ._ z .' IL ,1 CDco z .C. IL) co LO z C. co z .C. CY) z .CL._ N z C .C. > -5 z C 0° .-0 0a, 2 .C C ID C 03Cocm,, 0)0_ N- N- Nl- 14 It 0 1 lq *o0 0 cO cOi N4 ci c aO C4 CO oo oo N CD ci eq 4 C4 N4 C -6s, -t r- co *, CC 0 CO 0 R 0.. 0 0 0) oo Co aD C o 0. 0 _J:1_ a 0 CO - N- t N-CD C Co X 'ats, 0 it Le) () C V -.2 0' -o r > .°-I0> _ ~ a,0 ._0_ O a co 0=.. C 0 C M In 00a N- 'r- N- N s 0 0O Ci Ci Ci C4 to C O Co CO CO0 r N- lo 0 co N Ci i Ci Ci ci 6 s _ v0 CD 0 CD -r- U0=- 0 o 0 0 C 0a DO 00~ a, o 0 0 0 w Nr N c c i 65 l5 oO U-0 oo 00)0o ) b aw a o o 0 o00 N- N- ,12 N- o N * bR o N CD N X) O.°- >Z v 0C CC.) C 0~ .° D' _ a, DC O. _t w O 0 c Co Co CO C4 a,0a a, C C C C .F E E E E' 5 a5 a D CD(A n am m E E _- N IR CD m ( .2 CaC 0 0 a, -o CL n a, 0 0a, 0 E a.10 CL CL m 732 THERMOSTABLI DE DIVERS LOTS DE VACCIN ANTIAMARIL Tableau 3. Titres en fonction de la temp6rature et de la dur6e de conservation (valeurs moyennes pour les vaccins Nos 1 A 8) Temperature Dur6e de conservation de conservation 1 semaine 2 semaines 4 semaines 6 semaines 3 mois 6 mois -20'C 3,43 3,41 3,10 3,02 3,09 3,05 + 5°C 3,47 3,18 3,04 2,84 2,86 2,88 +22*C 2,86 2,86 2,41 2,28 2,04 - +37'C 2,16 2,02 1,48 - - Resistance a -200C et a +50C D'une fagon generale, on voit que les courbes de stabilite a -20°C et a + 50C sont tres proches l'une de l'autre. La perte du titre est continue jusqu'a la 6e semaine apres quoi s'amorce un plateau qui se prolonge au moins jusqu'au 6e mois, la perte totale entre 1 semaine et 6 mois n'atteignant pas le demi-logarithme decimal a -20°C et avoisinant 0,6 logarithme decimal a + 5°C. Re'sistance a +22°C Si l'on considere, pour chaque preparation, comme titre de depart la moyenne des titres obtenus apres une semaine a - 20°C et + 5°C, on constate, des la Ire semaine, une chute importante du titre pour la totalite des vaccins sauf un (No 3). Cette baisse va de 0,14 a 1,3 logarithme decimal. La moyenne de perte du titre pour 1'ensemble des vaccins est de 0,59 logarithme, soit pres de 75%. La baisse est insensible entre la lre et la 2e semaine apres quoi s'amorce une nouvelle chute avec perte de 90% du titre initial en fin de la 4e semaine. Au bout de 3 mois, cinq preparations ont encore un titre superieur au minimum exige, les baisses de titre allant de 0,97 a 1,78 logarithme selon les preparations vaccinales. Resistance a +37°C Si l'on se refere de nouveau, comme titre de depart, a la moyenne des titres obtenus apres une semaine a -20°C et a +50C, la deterioration du vaccin est tres rapide a +37°C puisque, apres une semaine, la perte moyenne du titre pour toutes les preparations vaccinales atteint 1,29 logarithme. Trois pr6parations seulement ont un titre superieur au minimum apres la 4e semaine, les baisses de titre allant de 1,29 a 2,03 logarithmes. DISCUSSION On peut discuter la methode employee et les resultats obtenus. En ce qui concerne la methode, il est evident qu'il s'agissait la d'une etude preliminaire tendant a degager quelques notions concemant la stabilite de differentes preparations de vaccin antiamaril 17 D, notions pouvant servir de base a une etude pzus poussee d'une ou deux preparations vaccinales. Etant donne le nombre de preparations etudiees, nous n'avons pratique pour chaque intervalHe de temps et chaque temperature qu'un seul titrage sur trois ampoules de chaque preparation. Il aurait et& statistiquement preferable de pouvoir multiplier les. essais pour chaque titrage. D'autre part, ces essais auraient d(k etre faits dans. diff6rents laboratoires simultanement. Quant aux resultats, on peut dire qu'il n'existe pas encore une preparation de vaccin antiamaril 17 D suffisamment stable pour pouvoir servir de vaccin de reference. L'examen des courbes etablies pour chaque vaccin amene quelques remarques: le titre final (i 6 mois) est tres proche du titre initial (a une semaine) pour les vaccins Nos 1, 2 et 3 et c'est pour ces memes preparations que les valeurs sont les plus faibles a 6 semaines et a 3 mois. On peut noter qu'il existe un certain parallelisme entre les epreuves dans la variation de plusieurs facteurs communs. I1 semble qu'il faille incriminer la sensibilite des souris. En effet, ces accidents ont coincide avec des difficult6s dans notre elevage de souris au moment des grandes chaleurs de l'hivernage (ao(t-septembre). Cependant, les resultats, quoique tres imparfaits, montrent que pratiquement toutes les preparations vaccinales supportent tres bien une temperature de 733 Y. ROBIN ET COLLABORATEURS VACCIN No 2 *. . I4 .. N 1 2 4 6 semaine semaines semaines semaines VACCIN No 4 4%~~~~~~1 t11 %~~~~4 S- %41~~~~. 3 6 1 2 4 6 3 mois mois semaine semaines semaines semaines mois Duree de conservation (echelle logarithmique) 6 mois *w0o i0469 Fig. 1. Effet de la duree et de la temp6rature de conservation du vaccin sur le titre (vaccins Nos 1 A 4). -20'C + 5C +22 C +37tC 734 VACCIN No 1 7\ 4 3 cm 2 -2 0 -J 1 II 4 3 -g 0 -jnJ0 oo Ji 2 VACCIN No 3 - -- ,s I . THERMOSTABILITI DE DIVERS LOTS DE VACCIN ANTIAMARIL VACCIN No 5 .4 -*. .444 4 4' S% 4 1 2 4 6 semaine semaines semaines semaines VACCIN No 6 N -~~~~~~~~~~~~~~~0 W.44.44% 1.4 VACCIN No 8 - _' 0 \\ ,/ '/J % *J 3 6 1 2 4 6 3 mois mois semaine semaines semaines semaines mois Duree de conservation (echelle logarithmique) Fig. 2. Effet de la dur6e et de la temp6rature de conservation du vaccin sur le titre (vaccins Nos 5 A 8). -20'C + 5C +22 C +37 C 735 4 3 -iE - 0 0 4 3 -g J CD 2 L -J-= C10 VACCIN No 7 _ _ % S lb 6 mois 1)470 uj- Y. ROBIN ET COLLABORATEURS 1%_1 N.. -200C ---_ - 5°C N , *. -370C Minimum OMS 1 semaine 2 semaines 4 semaines 6 semaines 3 mois 6 mois Duree de conservation (echelle logarithmoque) *_r _,68 Fig. 3. Effet de la dur6e et de la temp6rature de conservation du vaccin sur le titre (moyenne des huit pr6parations). + 50C pendant 4 semaines et la plupart pendant 6 mois. Meme a +22°C, la plupart n'accusent qu'une legere baisse du titre apres 2 semaines. Si l'on etablit, pour chaque temperature, une courbe moyenne des huit preparations vaccinales, on obtient des courbes qui donnent une idee generale de la thermostabilite du vaccin 17 D. On voit qu'avec un titre au depart d'environ 3,5 logarithmes DL5,/0,03 ml le vaccin peut etre conserve a +5°C pendant au moins 6 mois, qu'il est utilisable apres 3 mois a +22°C et apres 2 semaines a +37°C (fig. 3). Ceci est tres encourageant pour l'utilisation dans les campagnes de vaccination en pays tropi- caux. 11 suffit de maintenir le vaccin lyophilise dans des recipients isothermes contenant de la glace. Comme nous l'avons signale, il ne s'agit Ia que d'une etude preliminaire. D'autres etudes sont necessaires pour l'obtention de vaccins de plus en plus stables, par modification des methodes de lyophilisation ou par adjonction de substances pro- tectrices. On a souvent dit que plus un produit biologique a une humidite residuelle basse (moins de 1 %), plus il resistera a des temp6ratures 6lev6es. Dans 1'etude que nous avons entreprise, nous n'avons pu relier la thermostabilite a l'humidite residuelle, le taux de celle-ci etant inconnu pour la plupart des vaccins etudies. Mais il est concevable que l'amelioration des techniques de lyophilisation puisse entrainer une amelioration de la resistance du vaccin 17 D A des temperatures elev&es. L'adjonction de substances protectrices est utilisee depuis longtemps (Polge et al., 1949) pour proteger les produits biologiques lors de la congelation. Nous basant sur des travaux anterieurs (Chatelain, 1963), nous avons essaye le glutamate de sodium a une concentration de 0,2% dans le vaccin pret a 1'em- ploi, soit 20 lors de la lyophilisation. Nous n'avons pas obtenu de resultats significativement superieurs. Il est possible que d'autres concentrations de gluta- mate de sodium ou que d'autres substances soient plus efficaces. Parallelement aux essais d'amelioration des condi- tions de lyophilisation du vaccin 17 D, il nous semble important d'etudier plus en detail la degra- dation du vaccin antiamaril 17 D en fonction de temperatures elevees. Cette etude pourrait se faire sur une ou deux preparations vaccinales soumises a une temperature intermediaire entre +22°C et +370C (+300C a +32°C), avec titrage tous les jours, ce qui permettrait d'estimer le temps necessaire a la perte d'un logarithme de titre par rapport a des ampoules conservees constamment a -200C. CONCLUSION Des etudes preliminaires sur la conservation de huit preparations de vaccin antiamaril 17 D soumises a differentes temperatures ont permis de degager certains faits: le vaccin lyophilise se conserve tres bien a l'etat sec a + 5°C pendant au moins 6 mois mais se degrade tres rapidement a + 37°C. L'ad- jonction de glutamate de sodium n'a pas apporte d'amelioration notable a la thermostabilite. Paral- lelement aux tentatives d'amelioration des condi- tions de lyophilisation, il convient d'etudier main- tenant, d'une fa$on plus precise, la degradation du vaccin antiamaril 17 D soumis a une temp6rature elevee. 736 4 3 _E In 1=. CD _j m.4 CD _j 2 . I .. I + 22o C...,_ 1 nu, THERMOSTABILUE DE DIVERS LOTS DE VACCIN ANTIAMARIL 737 SUMMARY A STUDY OF THE HEAT STABILITY OF EIGHT SAMPLES OF YELLOW-FEVER VACCINE COMING FROM VARIOUS COUNTRIES The precautions that must be taken to preserve anti- yellow-fever vaccine are sometimes difficult for vaccination teams working in certain tropical areas to apply when communications are very slow and refrigeration facilities are inadequate. The present standards for yellow- fever vaccine provide for the storage of vaccine at a temperature below 4°C for 3 months or longer, or under exceptional circumstances, at a higher temperature for a short time. It was therefore considered important to study the stability of these vaccines at different tempera- tures, and 8 samples prepared in seven production laboratories in seven different countries were tested. The vaccine samples were divided into lots and kept at the following temperatures: -20°C, 5°C, 22°C, 37°C. The lots were titrated in 4-week-old Swiss albino mice after periods of 1, 2, 4, and 6 weeks, then 3 and 6 months. The strain ofmice was known to be sensitive to arboviruses and the mice were inoculated intracerebrally without anaesthesia; 9 mice were used for each vaccine dilution. After being inoculated, the mice were distributed to cages at random. The inoculation manipulations were carefully timed so that each vaccine lot was dealt with in the same time, all dilutions and inoculations being made by the same person who was very experienced in this work. The diluent employed was a phosphate buffer, pH 7.4, containing 0.75% of bovine albumin. The mice were observed for 21 days, all deaths after the eighth day being noted; mice found to be paralysed on the 21st day were considered as survivors. The vaccines were given code numbers and their origin was unknown to the experi- menter. The mean titre remained above or equal to 3 log LD50/0.03 ml (i.e., 16 596 LD50 per dose) for 6 months at storage temperatures of -20°C and 5°C. For three vaccines (No. 3, 4, 6), the titres were higher than 3.5 log LD50/0.03 ml (i.e., 52 481 LD50 per dose at the end of 6 months. Three other vaccines (No. 5, 7, 8) closely followed the mean value. At a temperature of 22°C all the vaccines retained a mean value above 1 659 LD50 per dose for 3 months but the individual variations noted in the ampoules could lead to the occurrence of titres below the mean. However, storage at this temperature for only 2 weeks should offer an adequate safety factor. The minimum activity required by the WHO specifications is 1 000 LD50 per dose. The three best vaccines (No. 3, 4, 6) withstood storage for a week, and even two weeks, at a temperature of 37°C. The titres of the five other vaccines fell very rapidly after the first week. A vaccine lot prepared with the addition of sodium glutamate (0.2% in the diluted vaccine) did not produce significantly better results than the rest but it is possible that different concentrations of sodium glutamate, or the addition of other substances, might be more effective. R1fFtJRENCES BIBLIOGRAPHIQUES Chatelain, R. (1963) Ann. Inst. Pasteur, 105, 111. Groupe d'etude des normes relatives au vaccin antiamaril et des normes relatives au vaccin anticholerique (1959) Rapport (Org. mond. Sante Sir. Rapp. techn., NO 179) Polge, C., Smith, A. U. & Parkes, A. S. (1949) Nature (Lond.), 164, 666 Reed, L. J. & Muench, J. (1938) Amer. J. Hyg., 27, 493 Annexe LABORATOIRES PRODUCTEURS DES VACCINS Commonwealth Serum Laboratories, Parkville, Victoria, Australie Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Bresil Institut Pasteur de Paris, Paris, France Institut Pasteur de Dakar, Dakar, Senegal Instituut voor Tropische Hygiene, Amsterdam, Pays-Bas The National Drug Company, Philadelphia, Pa., Etats- Unis d'Amerique The Wellcome Research Laboratory, Beckenham, Kent, Angleterre