Procedimento operacional padrão para avaliar as propriedades esterilizantes do piriproxifeno em mosquitos fêmea adultos em bioensaios com garrafas da OMS Versão: PPXN-Bioassay/01/14 January 2022
1POP para avaliar as propriedades esterilizantes do piriproxifeno em mosquitos fêmea adultos em bioensaios com garrafas da OMS 1. Introdução, âmbito e finalidade Os análogos do hormônio juvenil, como o piriproxifeno, podem, potencialmente, ser usados em produtos para controlo de vetores com o objetivo de inibir/reduzir a fertilidade e a fecundidade de mosquitos fêmea adultos; por sua vez, isso pode levar a uma redução da densidade da geração seguinte de vetores (prole). A finalidade deste procedimento operacional padrão (POP) é descrever o processo para avaliar as propriedades esterilizantes do piriproxifeno nas populações/linhagens de mosquitos fêmea adultos. Este bioensaio de suscetibilidade é um teste de resposta à exposição, medindo a redução da taxa de oviposição em mosquitos fêmea adultos pré-expostos a uma concentração padrão conhecida (por ex., concentração discriminatória) ou a concentrações em série de piriproxifeno por um período fixo de uma hora. Este POP descreve o processo de exposição dos mosquitos ao piriproxifeno em garrafas de vidro, colocação em câmaras para oviposição após exposição, registro e interpretação dos resultados do teste. O POP complementa o POP da Organização Mundial da Saúde (OMS) para testar a suscetibilidade de mosquitos adultos aos inseticidas em bioensaios com garrafas da OMS (POP WHO Bottle-bioassay/01/14 January 2022). 2. Insumos Garrafas Wheaton® de 250 mL com tampas de rosca (16 garrafas). Se forem reutilizados, assegure que foram devidamente limpas seguindo o procedimento de lavagem de garrafas descrito mais adiante. Espátula de pesagem Microbalança Misturador vortex Lente de aumento ou lupa binocular 2 garrafas de vidro âmbar (volumes 50–100 mL). Alternativamente, qualquer garrafa de vidro limpa envolta em folha de alumínio pode ser usada. Um conjunto de micropipetas calibradas (ex., 100 µl, 200 µl e 1000 µl) Temporizador (cronômetro) Um recipiente plástico de 20 L ou um lavatório de 20 L POP para avaliar as propriedades esterilizantes do piriproxifeno em mosquitos fêmea adultos em bioensaios com garrafas da OMS 2 Aspiradores para coleta de mosquitos (aparelhos alimentados por bateriasdevem ser usados para evitar qualquer exposição a insecticidas) Gaiolas para mosquitos (dimensões mínimas 20 cm x 20 cm) Suportes Equipamento de proteção individual adequado 3. Materiais Inseticida grau técnico ou solução estoque Acetona (reagente para análise) Copos de papel para manter os mosquitos adultos (440 mL; altura 10 cm x largura 9,5 cm) (i.e., uma câmara de armazenamento para um lote de 25 mosquitos de teste) Copos de papel para manter mosquitos individuais (capacidade 100 mL; altura 6 cm x largura 6 cm) (i.e., câmara de armazenamento para 1 mosquito de teste) Redes de malha estreita em quantidade suficiente para cobrir os copos de papel e elásticos para prender os pedaços de rede aos copos Seringas graduadas (10–30 mL) Ponteiras de plástico descartáveis para as micropipetas (ex., 100 µL, 200 µL e 1000 µL) Pipetas Pasteur em vidro de vários volumes para contar e retirar as larvas dos copos de papel Água deionizada Algodão hidrófilo de grau médico Contadores 3POP para avaliar as propriedades esterilizantes do piriproxifeno em mosquitos fêmea adultos em bioensaios com garrafas da OMS Esponjas de laboratório e protetores de bancada Solução de açúcar a 10% (glicose dissolvida em água a 10% p/v) Folha de alumínio Fita adesiva Marcadores de tinta permanente para rotular as garrafas, tampas e pipetas Ficha de registro de dados (Anexo 2), canetas e lápis para registrar os dados Luvas descartáveis Produto de limpeza antibacteriano, como álcool isopropílico ou etanol a 70% TFD4 ou Decon 90 (para limpar equipamentos em contato com compostos químicos) 4. Saúde, segurança e proteção ambiental Antes de utilizar qualquer composto químico, a equipe do laboratório deve ler e compreender a avaliação de riscos, as fichas de informação de segurança do material e o controle de substâncias perigosas para a avaliação de saúde para cada químico utilizado. Equipamento de proteção individual adequado deve ser usado sempre que se manuseiam inseticidas, incluindo, jalecos, luvas, óculos de proteção e máscara facial ao pesar produtos químicos. Assegurar que todas as áreas de trabalho estão livres de outros materiais e limpas antes da realização do teste Todo a equipe que trabalha no laboratório deve ter recebido treinamento inicial e o treinamento deve estar registrado na pasta individual de treinamentos. Todo a equipe que utiliza este procedimento deve estar treinada na operação segura das câmaras de exaustão química. POP para avaliar as propriedades esterilizantes do piriproxifeno em mosquitos fêmea adultos em bioensaios com garrafas da OMS 4 Eliminar adequadamente todos os resíduos, seguindo as orientações de segurança nacionais/institucionais. Ao trabalhar com mosquitos, minimizar a fuga, mantendo todas as portas e janelas fechadas. Se alguns mosquitos escaparem, use imediatamente uma raquete elétrica para os eletrocutar. 5. Criação e preparação dos mosquitos Tanto os mosquitos fêmea coletados em campo, como os mosquitos de uma linhagem laboratorial suscetível são necessários para conduzir estes bioensaios (pelo menos 200 de cada) O principal resultado deste teste é a quantificação da inibição da oviposição das fêmeas, que é medida 7 dias após a exposição ao piriproxifeno em garrafas de vidro. Por esta razão e diferentemente do teste de tubo da OMS ou do bioensaio de garrafa da OMS para outros insecticidas, é essencial que os mosquitos fêmea sejam inseminados (ou acasalados) e alimentados com sangue, antes de serem expostos ao piriproxifeno e que os mosquitos de teste sobrevivam aos 7 dias após o período de exposição e manipulações. Para maximizar a inseminação e produzir mosquitos aptos e capazes de sobreviver a todo o período do teste, é essencial: • Durante as fases larvar e adulta, os mosquitos de teste devem estar bem nutridos e sem alta densidade para reduzir a mortalidade no grupo controle durante o teste; • Misturar os mosquitos fêmea adultos dos testes com muitos machos vigorosos nos dias que precedem a alimentação com sangue e os testes com insecticidas; e • Usar fêmeas alimentadas com sangue que tenham 5–7 dias de idade para evitar a mortalidade dos controles durante os testes e aumentar o êxito da oviposição após os bioensaios. 6. Preparação de soluções estoque com concentrações discriminatórias Em 2022, a OMS adotou uma concentração discriminatória de 100 µg de piriproxifeno (ingrediente ativo) por garrafa para Anopheles gambiae s.s., An. funestus s.s. e An. stephensi (1). As concentrações discriminatórias para outras espécies de vetores ainda precisam ser estabelecidas. Os cálculos para a quantidade de insecticida (ingrediente ativo) e solvente (acetona) para preparar a solução estoque são apresentados no Anexo 1 deste POP. 5POP para avaliar as propriedades esterilizantes do piriproxifeno em mosquitos fêmea adultos em bioensaios com garrafas da OMS 24h 48h 72h 96h 1 Faça a impregnação das garrafas e tampas, seque as garrafas por 2 h 2h 1h 24h 48h 72h 2 Alimente os mosquitos com sangue 1 h antes do início do teste 3 Exponha os mosquitos ao piriproxifeno em garrafas de vidro por 1 h e transfira-os para copos de papel para repouso 4 Transfira individualmente cada fêmea sobrevivente para uma câmara de oviposição 5 Registre a presença de ovos em cada copo para calcular a taxa de oviposição Preparação Manter os mosquitos em repouso em copos de papel por 72 h (25 fêmeas por copo) Manter os mosquitos em câmaras individuais por 4 dias (1 fêmea por copo) 6.1. Prepare a balança electrônica: Coloque um pedaço de papel limpo para pesar na balança e tare para zero. 6.2. Prepare a garrafa para armazenar a solução estoque: Use uma garrafa de vidro limpa e à prova de luz (de cor âmbar ou envolta em folha de alumínio, se for transparente), com tamanho apropriado e rotule com a concentração e a data da solução estoque. 6.3. Prepare a solução estoque: : Para preparar uma concentração de teste de 100 µg de IA para uma garrafa de bioensaio de 250 mL (com um grau de pureza hipotético de 100%), usando uma espátula limpa, pese 10 mg de IA e dissolva completamente em 100 mL de acetona. Alternativamente, para preparar um volume menor de solução estoque (ex., 10 mL), adicione 1 mg de IA a 10 mL de acetona. Esta solução estoque conterá 100 µg de IA por mL da solução. 6.4. Armazene a solução estoque: As soluções devem ser armazenadas em refrigerador a 4–8o C por no máximo 2 meses. 7. Procedimento do teste Um diagrama representando as diversas fases deste procedimento é apresentado na Fig. 1. Este procedimento deve ser conduzido em paralelo com mosquitos capturados em campo e outros provenientes de uma linhagem de mosquitos suscetíveis. Na Tabela 1 é apresentado um resumo das condições do teste. Fig. 1. Fases do ensaio de garrafa da OMS para testar a suscetibilidade dos mosquitos adultos ao piriproxifeno, um regulador do crescimento de insetos POP para avaliar as propriedades esterilizantes do piriproxifeno em mosquitos fêmea adultos em bioensaios com garrafas da OMS 6 Tabela 1. Condições do teste e número de mosquitos necessários para testar a suscetibilidade de mosquitos silvestres a uma concentração discriminatória de piriproxifeno usando bioensaios com garrafas da OMS Condições do teste para bioensaios com garrafa de vidro Fases do teste Tempo de secagem das garrafas após impregnação Tempo de exposição N.º de garrafas por concentração ou controlea N.º de mosquitos por garrafa N.º total de mosquitos fêmea expostos Mosquitos silvestres expostos à CDb (100 µg IA/garrafa) 2 h 1 h 4 25 100 Mosquitos silvestres de controle (expostos apenas a acetona) 2 h 1 h 4 25 100 Linhagem suscetível exposta a CDb (100 µg IA/garrafa) 2 h 1 h 4 25 100 Mosquitos controle suscetíveis (expostos apenas a acetona) 2 h 1 h 4 25 100 a O número de garrafas controle precisa ser igual ao número de garrafas tratadas (i.e., 4), ao contrário de outros bioensaios de suscetibilidade que apenas exigem 2 garrafas controle. b CD, concentração discriminatória Passo 1: Impregnação das garrafas 7.1. Prepare garrafas limpas e secas: Pegue 16 garrafas de vidro de 250 mL limpas e vazias, com tampas de rosca e seque-as num forno durante 20 minutos ou abertas por 1 a 2 horas, dependendo do nível de umidade no ambiente. 7.2. Se a solução estoque e o solvente (acetona) tiverem sido guardados em um refrigerador, coloque-os em temperatura ambiente: Retire-os do refrigerador e deixe-os em temperatura ambiente repousando durante 1 hora sem abrir a tampa do recipiente. 7.3. Identifique tanto as garrafas como as tampas com o nome, a concentração de inseticida (µg/garrafa) e data do teste. 7POP para avaliar as propriedades esterilizantes do piriproxifeno em mosquitos fêmea adultos em bioensaios com garrafas da OMS 7.4. Impregne o interior e as tampas das garrafas controle e de exposição: Faça a impregnação das garrafas controle primeiro e, depois, das garrafas com piriproxifeno. Faça a impregnação das garrafas uma por uma, seguindo este procedimento. Imagens ilustrando o processo são apresentadas na Fig. 2. 7.4.1. Segure a garrafa em um ângulo de aproximadamente 45o, com o gargalo apontado para cima. Adicione 1 mL de acetona (para as garrafas controle) e 1 mL de solução estoque de piriproxifeno (para as garrafas de exposição). Coloque a tampa e gire a garrafa pelo menos 5 vezes para impregnar a base (Fig. 2, passo 1). 7.4.2. Incline a garrafa ligeiramente em um ângulo com a tampa virada para baixo e gire pelo menos 5 vezes para impregnar a parte superior da garrafa e a tampa (Fig. 2, passo 2). 7.4.3. Incline a garrafa em um ângulo de aproximadamente 45o com a tampa virada para baixo e gire pelo menos 5 vezes para impregnar a tampa e o gargalo da garrafa (Fig. 2, passo 3). Repita os passos 7.4.1 a 7.4.3 pelo menos uma vez. 7.4.4. Coloque a garrafa de lado sobre uma superfície plana. Role a garrafa para a frente e para trás pelo menos 10 vezes antes de agitar uma vez e role outras 10 vezes ou mais, para garantir que todos os lados foram impregnados (Fig. 2, passo 4). 7.4.5. Repita os passos 7.4.1 a 7.4.4 pelo menos 3 vezes. Coloque a garrafa em uma câmara de exaustão e ligue a corrente para iniciar o exaustor. 7.4.6. Retire a tampa da garrafa para que a acetona evapore. Coloque a tampa virada para cima dentro da câmara de exaustão com a parte interior exposta ao ar. Nota: a evaporação da acetona pode causar alguma pressão na garrafa. Essa é uma situação normal, por isso, seja cuidadoso ao retirar a tampa da garrafa. 7.4.7. Segure a garrafa em um ângulo de aproximadamente 45o com o gargalo virado para cima. Gire pelo menos 5 vezes para impregnar a base da garrafa (Fig. 2, passo 5). 7.4.8. Incline ligeiramente a garrafa em um ângulo com o gargalo virado para baixo, tendo o cuidado de não deixar verter qualquer líquido restante e rode pelo menos 5 vezes para impregnar a parte superior da garrafa (Fig. 2, passo 6). Repita os passos 7.4.7 e 7.4.8 pelo menos duas vezes. 7.4.9. Coloque a garrafa de lado na câmara de exaustão. Role a garrafa para a frente a para trás pelo menos 10 vezes antes de agitar uma vez e role outras 10 vezes ou mais, para garantir que todos os lados foram impregnados (Fig. 2, passo 7). 7.4.10. Repita os passos 7.4.7 a 7.4.9 pelo menos 3 vezes até que o solvente tenha evaporado e deixe de ser visível. Verifique o solvente, segurando a garrafa em um ângulo de aproximadamente 45o, com o gargalo virado para cima e espere para ver se resta algum solvente no fundo da garrafa. POP para avaliar as propriedades esterilizantes do piriproxifeno em mosquitos fêmea adultos em bioensaios com garrafas da OMS 8 Fig. 2. Procedimento para impregnação uniformemente das garrafas com acetona Fonte: redesenhado a partir de um diagrama por cortesia da Escola de Medicina Tropical de Liverpool, Reino Unido da Grã- Bretanha e Irlanda do Norte 7.5. Deixe as garrafas e as tampas secarem durante 2 horas: Envolva as garrafas em folha de alumínio, para proteger o conteúdo da luz. Deixe as garrafas abertas e as tampas em uma câmara de exaustão sem uso (ou sala separada com ventilação) por 2 horas. Passadas as 2 horas, verifique se o interior das garrafas secou completamente. Nota: as garrafas e as tampas devem secar durante 2 horas, por isso, o intervalo de tempo entre a impregnação da garrafa e o bioensaio é de 2 horas (e não 24 horas, como recomendado para outros insecticidas). Enquanto as garrafas e as tampas secam, a câmara de exaustão deve ser mantida ligada e não deve ser limpa nem usada por outros operadores. Equipamentos, ex. as pipetas, podem ser limpas e retiradas da câmara de exaustão, mas essa limpeza não deve interferir com a secagem das garrafas e tampas na câmara de exaustão. 7.6. Armazene as garrafas: Coloque as tampas nas garrafas impregnadas e guarde-as em um lugar escuro, fresco e seco, até que sejam usadas. Nota: O procedimento para impregnar as garrafas uniformemente pode ser praticado inicialmente impregnando uma ou mais garrafas com uma mistura de acetona e um agente colorante (ex., um corante ou tinta). Passo 2: Alimentação sanguínea dos mosquitos 7.7. Providencie mosquitos de teste (tanto capturados no campo como provenientes de uma linhagem suscetível) com acesso a alimentação sanguínea 1 hora antes do inicio da exposição ao piriproxifeno. 1 x3 x5 x5 x1 x10 x5 2 3 4 x2 5 6 7 x2 x5 x5 x1 x10 Coloque as garrafas na câmara de exaustão x3 9POP para avaliar as propriedades esterilizantes do piriproxifeno em mosquitos fêmea adultos em bioensaios com garrafas da OMS Passo 3: Exposição dos mosquitos ao piriproxifeno em garrafas e repouso por 72 horas após a exposição Fig. 3. Diagrama mostrando o processo de exposição dos mosquitos ao piriproxifeno em garrafas de vidro 7.8. Prepare as garrafas para a introdução dos mosquitos: Alinhe as garrafas com as suas tampas rosqueadas frouxamente para que seja fácil introduzir os mosquitos. Coloque um pedaço de rede sobre o gargalo de cada garrafa e prenda com um elástico. Aspire e introduza mosquitos nas garrafas: Introduza primeiro os mosquitos em todas as garrafas controle e depois nas garrafas impregnadas com piriproxifeno. Use aspiradores separados para as garrafas controle e para as garrafas tratadas. Nota: Os mosquitos fêmea adultos com 5–7 dias de idade devem ser alimentados com sangue uma hora antes de serem introduzidos nas garrafas. Para introduzir os mosquitos em cada garrafa: 7.8.1. Usando de preferência um aspirador mecânico, colete 25 mosquitos alimentados com sangue para serem introduzidos em cada garrafa. 7.8.2. Introduza o aspirador com os 25 mosquitos na garrafa através do orifício na rede que cobre o gargalo da garrafa. Posicione a abertura do aspirador na parte central da garrafa e bata suavemente, liberando os mosquitos dentro da garrafa. 7.8.3. Coloque rapidamente a tampa na garrafa, para impedir que os mosquitos fujam. 7.8.4. Coloque a garrafa em posição vertical e ligue o cronômetro para registrar o tempo de exposição. Período de exposição (1h): Introduza 25 mosquitos em cada garrafa de tratamento e controle Mosquitos silvestres Linhagem suscetível (somente para testes com clorfenapir) Tratamento TratamentoControle Controle Período de repouso (72h): Transfira os mosquitos para os copos de repouso de papel. Forneça acesso à solução de água com açúcar. Deixe em repouso por 72 h. Faça leitura de mortalidade 24 h, 48 h e 72 h após exposição = 25x POP para avaliar as propriedades esterilizantes do piriproxifeno em mosquitos fêmea adultos em bioensaios com garrafas da OMS 10 7.9. Deixe os mosquitos na garrafa durante uma hora de exposição. 7.10. Durante o tempo de exposição, prepare os copos de repouso de papel: Coloque um pedaço de rede sobre a abertura de cada copo de papel de 440 mL e prenda com um elástico. 7.11. Transfira os mosquitos para os copos de repouso de papel e mantenha por 72 horas após 1 hora de exposição: Aspire suavemente os mosquitos para fora de cada garrafa, de preferência usando um aspirador mecânico e libere-os dentro de um copo de repouso para adultos coberto com a rede. Coloque um chumaço de algodão embebido em solução de açúcar a 10% sobre a rede de cobertura e mantenha os copos a 27 °C ± 2 °C e 75% ± 10% de umidade relativa durante 72 horas. 7.12. Registre os mosquitos caídos: Logo após transferir os mosquitos para os copos, registre o número de mosquitos que estavam caídos, conforme a definição da Tabela 3. 7.13. Registre a mortalidade a cada 24 horas: Conte e registre o número de mosquitos encontrados mortos e vivos (conforme as definições apresentadas na Tabela 3) 24 horas, 48 horas e 72 horas após uma hora de exposição tanto em copos tratados como em copos controle. Introduza os dados na ficha de registro (Anexo 2) ou no sistema electrônico de coleta de dados. Tabela 2. Definições da OMS para queda e mortalidade de mosquitos após o teste Mosquitos considerados vivos após 1 hora de exposição ou 24 h, 48 h ou 72 h após a exposição Mosquitos considerados caídos após 1 hora de exposição ou mortos 24 h, 48 h ou 72 h após a exposição • Consegue manter-se de pé e voar de forma coordenada • Sem sinal de vida; imóvel; não se mantém de pé • Qualquer mosquito que não consegue manter-se de pé (ex., tem 1 ou 2 pernas) • Qualquer mosquito que não consegue voar de forma coordenada • Qualquer mosquito deitado de costas, mexendo as pernas e as asas mas que não consegue levantar voo • Qualquer mosquito que consegue pôr-se de pé e levantar voo por instantes mas cai imediatamente Fonte: adaptado da página 77 do relatório da décima quinta reunião do grupo de trabalho do WHOPES (2). 11 POP para avaliar as propriedades esterilizantes do piriproxifeno em mosquitos fêmea adultos em bioensaios com garrafas da OMS Passo 4: Colocando os mosquitos em câmaras para oviposição 7.14. Antes do fim do período de repouso, prepare as câmaras individuais de oviposição de mosquito: 7.14.1. Pegue 1 copo de papel (100 mL) para cada mosquito que permanecer vivo nos copos de repouso de tratamento e controle, corte pedaços redondos de rede e prepare uma seringa e água deionizada (Fig. 4, passo 1). 7.14.2. Identifique cada copo como “tratamento” ou “controle”. Numere- os e organize-os tendo em conta o número de mosquitos vivos e alimentados com sangue nos copos de repouso de tratamento e controle (ex., controle 1, controle 2, controle 3, controle 4, tratamento 1, tratamento 2, tratamento 3, etc.) (Fig. 4, passo 2). 7.14.3. Usando uma pipeta/seringa graduada, adicione 30 mL de água deionizada a cada copo de 100 mL, para propiciar um meio aquático para as fêmeas depositarem ovos (Fig. 4, passo 3). 7.14.4. Cubra cada copo com um pedaço de rede com um orifício redondo e prenda usando um elástico (Fig. 4, passo 4). 7.15. Transfira os mosquitos controle para as câmaras de oviposição (i.e., copos de papel de 100 mL) (Fig. 4, passo 5): Usando um aspirador, transfira um por um cada mosquito vivo alimentado com sangue dos copos de repouso controle para um copo de papel rotulado “controle” (por ex., controle 1, controle 2, controle 3, etc.), introduzindo o mosquito através da abertura na rede. Apenas 1 mosquito deve ser colocado em cada copo de papel. Coloque um chumaço de algodão embebido em solução de glicose a 10% em cima do orifício da rede; substitua o algodão com solução de açúcar recém preparada todas as manhãs, durante os 4 dias seguintes. 7.16. Transfira os mosquitos tratados para as câmaras de oviposição (i.e., copos de papel): Use um aspirador separado e, do mesmo modo, transfira os mosquitos um a um dos copos de repouso com as fêmeas tratadas para as câmaras rotuladas “tratamento”. Coloque um chumaço de algodão embebido em solução de glicose a 10% em cima do orifício da rede; substitua o algodão com solução de açúcar recém preparada todas as manhãs, durante os 4 dias seguintes. 7.17. Deixe os mosquitos realizarem a oviposição: Mantenha as fêmeas adultas nos copos de papel a 27 °C ± 2 °C e 75% ± 10% de umidade relativa durante 4 dias. Todos os dias, registre o número total de mosquitos mortos na ficha de registro de dados (Anexo 2) ou no sistema electrônico de coleta de dados. POP para avaliar as propriedades esterilizantes do piriproxifeno em mosquitos fêmea adultos em bioensaios com garrafas da OMS 12 Passo 5: Registro da taxa de oviposição 7.18. Ao final do período de 7 dias (i.e., 3 dias de repouso e 4 dias de câmara), inspecione os copos controle e de tratamento (câmaras) para a presença de ovos: Registre o número de câmaras positivas (com ovos) e negativas (sem ovos) na ficha de registro (Anexo 2) ou no sistema electrônico de coleta de dados. Fig. 4. Preparação das câmaras de mosquitos e liberação dos mosquitos Fonte: foto por cortesia do Institut de Recherche pour le Développement, Montpellier, França Passo 1. Materiais necessários para o teste Passo 3. Adicionando 30 mL de água no copo de 100 mL Passo 4. Rede com orifício cobrindo o copo (câmara) Passo 5. Transferindo 1 fêmea alimentada com sangue para o copo (câmara) Passo 2. Identificação no copo individual de repouso para adultos (câmara) 13 POP para avaliar as propriedades esterilizantes do piriproxifeno em mosquitos fêmea adultos em bioensaios com garrafas da OMS 8. Critérios para a rejeição do teste O teste deve ser descartado, caso se verifique uma das seguintes condições: • A mortalidade dos mosquitos controle da linhagem laboratorial suscetível ou da amostra coletada em campo for >20% 72 horas após a exposição. • A taxa de oviposição dos mosquitos controle da linhagem laboratorial suscetível ou da amostra coletada em campo for ≤30% no final do dia 7 após 1 hora de exposição ao piriproxifeno. • A inibição da oviposição da linhagem laboratorial suscetível no final do dia 7 após 1 hora de exposição ao piriproxifeno for <98%. 9. Registro de dados e estimativa do final Durante o teste, os dados devem ser inseridos em formulários de registro de dados em papel ou digitais. O Anexo 2 deste POP fornece um modelo em papel. Formulários digitais baseados em DHIS2 estão disponíveis na página eletrônica do Programa Global de Malária da OMS1. O final do teste é a inibição da oviposição entre os mosquitos silvestres 7 dias após a exposição ao regulador de crescimento de insetos, isto é, 3 dias de repouso inicial mais 4 dias de permanência dos mosquitos em câmaras individuais. Para estimar a inibição da oviposição, primeiro é necessário estimar as taxas de oviposição no controle e tratamento, tanto para a linhagem suscetível como para os mosquitos silvestres. • A taxa de oviposição é a proporção de fêmeas que põem ovos em um total de fêmeas colocadas em câmaras, após o período de repouso de 72 horas: Oviposição (%) = Número de fêmeas que puseram ovos Número total de fêmeas inicialmente em câmaras x 100 • A redução da taxa de oviposição (inibição da oviposição) é calculada dividindo o percentual de redução da taxa de oviposição nas fêmeas tratadas pelo percentual de redução da taxa de oviposição nas fêmeas controle:: Inibição da oviposição (%) = [1 – % de oviposição no tratamento % de oviposição no controle x 100 Mortalidade do controle 72 horas após a exposição, que é necessária para validar o teste, é calculada somando o número de mosquitos controle mortos em todas as réplicas de controle e expressando-o como percentagem do número total de mosquitos controle, seguindo esta fórmula: Mortalidade do controle = (%) Número de mosquitos fêmea controle mortos Número total de mosquitos fêmea controle x 100 1 https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/prevention/vector-control/dhis-data-collection-and-collation-tools POP para avaliar as propriedades esterilizantes do piriproxifeno em mosquitos fêmea adultos em bioensaios com garrafas da OMS 14 10. Interpretação dos resultados do teste • Resistência confirmada: Uma população de vetores silvestres é considerada resistente ao piriproxifeno se a inibição da oviposição for <90% ao final do dia 7 após 1 hora de exposição à concentração discriminatória do regulador de crescimento de insetos e a inibição da oviposição na linhagem de mosquitos suscetíveis (testada em paralelo) for ≥98%. • Resistência possível: Se a inibição da oviposição for ≥90% mas <98% ao final do dia 7 após 1 hora de exposição à concentração discriminatória do regulador de crescimento de insetos e a inibição da oviposição na linhagem de mosquitos suscetíveis (testada em paralelo) for >98%, a presença de resistência na população de vetores silvestres é possível mas não confirmada. Os resultados do teste devem ser confirmados repetindo o teste com uma nova amostra da mesma população de mosquitos silvestres. (Nota: evite usar F1 dos mosquitos testados.) Se 2 testes revelarem consistentemente que a inibição da oviposição é <98% na amostra silvestre coletada enquanto a inibição da oviposição é ≥98% na linhagem laboratorial suscetível (testada em paralelo), então a resistência está confirmada. • Suscetibilidade: Uma população de vetores silvestres é considerada suscetível ao piriproxifeno se a inibição da oviposição após 1 hora de exposição à concentração discriminatória for ≥98% ao final do dia 7 e a inibição da oviposição na linhagem laboratorial de mosquitos suscetíveis (testada em paralelo) for ≥98%. 11. Procedimento de lavagem das garrafas Apresentamos, abaixo, duas opções diferentes para lavagem das garrafas, conforme a disponibilidade de agentes de lavagem. Método de lavagem genérica usando Decon ou TFD4 1. Remova quaisquer rótulos adesivos das garrafas antes da lavagem. 2. Adicione aproximadamente 10 mL de acetona em cada garrafa a ser lavada e feche com uma tampa. 3. Agite vigorosamente as garrafas, uma a uma. 4. Descarte a acetona. 5. Prepare uma solução de Decon a 2–5% (ou produto equivalente, por exemplo, detergente alcalino TFD4 a 10%) em água quente em um recipiente aberto de 20 L ou pia. 6. Mergulhe as garrafas e as tampas rinsadas com acetona na solução de Decon e deixe durante a noite. 7. No dia seguinte, retire as garrafas e as tampas da solução, esfregue bem todas as garrafas e tampas com a solução de Decon usando uma escova limpa e enxague bem por 3 vezes com água da torneira. 8. Mergulhe as garrafas e as tampas em água limpa da torneira, em um recipiente ou pia durante 24 horas. 9. Retire as garrafas, enxague com água limpa da torneira e seque-as durante 6–8 horas num suporte viradas para baixo (como mostrado na Fig. 5) ou seque as garrafas e as tampas em estufa a 50 oC por 20–30 minutos. Aumente o tempo de secagem se umidade ainda for visível nas garrafas. 15 POP para avaliar as propriedades esterilizantes do piriproxifeno em mosquitos fêmea adultos em bioensaios com garrafas da OMS Procedimento para lavagem em locais onde o Decon ou TFD4 não estão disponíveis 1. Remova quaisquer rótulos adesivos das garrafas antes da lavagem. 2. Rinse as garrafas com acetona, se disponível, conforme descrito acima. 3. Prepare uma solução de sabão a 10 % em água quente em um recipiente aberto de 20 L ou pia. 4. Mergulhe as garrafas e as tampas na água com sabão durante 24 horas. 5. Retire-as da água com sabão e i) esfregue bem todas as garrafas e tampas com a solução de sabão, usando uma escova limpa e enxague bem por 3 vezes com água da torneira, ou ii) lave-as em uma máquina de lavar louça com água quente. 6. Mergulhe as garrafas e as tampas em água limpa da torneira em um recipiente ou pia durante 24 horas. 7. Retire as garrafas, enxague com água limpa da torneira e seque num suporte durante 6–8 horas viradas para baixo (como mostrado na Fig. 5), ou seque as garrafas e as tampas em estufa a 50 °C por 20–30 minutos. Aumente o tempo de secagem, se umidade ou gotículas de água ainda forem visíveis nas garrafas. Para ter a certeza de que não restam resíduos de inseticida nas garrafas lavadas, é recomendável verificar a qualidade da lavagem selecionando ao acaso algumas garrafas secas e expondo 5 mosquitos em cada uma delas, registrando os que caem ao fim de uma hora de exposição e a mortalidade 24 horas de repouso após a exposição. Fig. 5. Método de secagem das garrafas de vidro viradas para baixo sobre varetas de aço verticais Fonte: foto por cortesia do Institut de Recherche pour le Développement, Montpellier, França POP para avaliar as propriedades esterilizantes do piriproxifeno em mosquitos fêmea adultos em bioensaios com garrafas da OMS 16 12. Agradecimentos A OMS agradece os contributos do Dr. Vincent Corbel, Mr Stephane Duchon e Ms Laura Andreo, do Instituto de Pesquisa para o Desenvolvimento, Montpellier, França; Dr.ª Rosemary Lees, da Escola de Medicina Tropical de Liverpool, Reino Unido; e Dr.ª Corine Ngufor, da Escola de Higiene e Medicina Tropical de Londres/Centro de Pesquisas Entomológicas de Cotonou, Benim, na preparação da primeira versão deste POP e na ajuda ao Secretariado da OMS para a sua finalização. A revisão e a harmonização deste POP foram efetuadas por Ms Lucia Fernandez Montoya, do Programa Global de Malária da OMS, Genebra, Suíça. O OMS também gostaria de agradecer à Dr.ª Cynara Rodovalho e Mr Diogo Bellinato, do Laboratório de Fisiologia e Controle de Artrópodes Vetores da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz) no Brasil, e à Sra. Sónia Casimiro Trigo, do Escritório da OMS em Moçambique, por sua contribuição para a versão em português deste documento. O desenvolvimento deste POP foi coordenado pelo Dr. Rajpal S. Yadav, do Departamento de Controle das Doenças Tropicais Negligenciadas, da OMS, Genebra, Suíça. 13. Referências 1. Determinar concentrações discriminatórias de inseticidas para a monitorização da resistência em mosquitos: relatório de um estudo laboratorial multicêntrico com recomendações de consultas da OMS. Genebra, Organização Mundial da Saúde, 2022 https://apps.who.int/iris/handle/10665/352616, acedido a 27 de maio de 2022). 2. Relatório da décima quinta reunião do grupo de trabalho do WHOPES. Sede da OMS, Genebra, 18 a 22 Junho de 2012, Genebra, Organização Mundial da Saúde, 2012 (https://apps.who.int/iris/handle/10665/75304, acedido a 3 de Janeiro de 2022). Para mais informações, por favor contate: vectorsurveillance@who.int POP para avaliar as propriedades esterilizantes do piriproxifeno em mosquitos fêmea adultos em bioensaios com garrafas da OMS 17 Anexo 1. Cálculos para preparo de soluções para os ensaios com garrafas da OMS A. Cálculos para a quantidade de ingrediente ativo (IA) e solvente (acetona) para preparar a solução estoque inicial e subsequentes diluições para concentrações seriadas para impregnação das garrafas A planilha de cálculos Excel está disponível online em: https://cdn.who.int/media/docs/default-source/ntds/vector-ecology-mangement/calculation-tables-paper-impregnation-garrafas-17jan2022-locked.xlsx Na planilha Excel, ao introduzir os valores nas células verdes, os valores das células brancas serão calculados automaticamente. Cálculo do peso do IA em g ajustado para a pureza do IA Cálculo do peso do IA em mg ajustado para a pureza do IA Grupo da classe do inseticida Surfactante Inseticida Concentração pretendida do IA nas garrafas (µg /garrafa) N.º de garrafas para impregnar Quantidade de surfactante por garrafa* (ppm ou µg) Peso total de surfactante necessário (mg) Densidade do surfactante Volume do surfactante (mL) Volume da acetona (mL) Volume total da solução de impregnação (mL) Quantidade de IA a ser pesado para impregnar as garrafas (g) Pureza do IA do inseticida (%) Quantidade ajustada de IA a ser pesado (g)* Peso exato do IA (g)** Volume total ajustado da solução de impregnação (mL)*** Quantidade de IA a ser pesado (mg)** Peso exato do IA (mg)*** Volume total ajustado da solução de impregnação (mL)*** a b c d = (b × c)/1000 e f = (d/e) / 1000 g = (b × 1) - f h= f + g i = (a x b) / 106 j k = i x (100 / j) l m = (l × h) / k n = k x 1000 o p = (o × h ) / n ex. MEROa 1 800 0,8 0,900 0,001 1,00 1 0,000000 99,2 0,000000 #DIV/0 0,00 1 #DIV/0 Controle 1 800 0,8 0,900 0,001 1,00 1 Nenhumb 1 1,00 1 0,000000 99,8 0,000000 #DIV/0 0,00 1 #DIV/0 Controle 1 1,00 1 IA, ingrediente ativo MERO, , 81% éster metílico do óleo de colza * Considerando a pureza do IA do inseticida ** Peso exato do IA apresentado na balança *** Este é o volume ajustado para o peso exato do IA; use 1 mL da solução para impregnar uma garrafa de 250 mL a* Por exemplo, clotianidina b* Só com a acetona como solvente; por exemplo, clorfenapir e piriproxifeno POP para avaliar as propriedades esterilizantes do piriproxifeno em mosquitos fêmea adultos em bioensaios com garrafas da OMS 18 B. Diluições da solução estoque com acetona para preparar concentrações seriadas de inseticidas para impregnação das garrafas A planilha de cálculos Excel está disponível online em: https://cdn.who.int/media/docs/default-source/ntds/vector-ecology- mangement/calculation-tables-paper-impregnation-garrafas-17jan2022-locked.xlsx Na planilha Excel, ao introduzir os valores nas células verdes, os valores das células brancas serão calculados automaticamente.. Concentração final do IA (µg/garrafa) Volume final da acetona (mL)** Concentração do IA na solução estoque inicial (µg/garrafa) Volume pipetado da solução estoque inicial (mL) Volume de acetona a ser adicionado (mL) a b c d = (a x b)/c e = b - d Solução estoque* 100 Diluição em série n.º 1 50 5 100 2,50 2,50 Diluição em série n.º 2 30 5 100 1,50 3,50 Diluição em série n.º 3 20 5 100 1,00 4,00 Diluição em série n.º 4 10 5 100 0,50 4,50 Diluição em série n.º 5 5 5 100 0,25 4,75 IA ingrediente ativo * A solução estoque inicial é preparada pesando uma quantidade adequada de IA e ajustando o volume necessário de solvente (acetona) ** Prepare o volume final de acordo com o número de garrafas a impregnar (por ex., é necessário um volume de 5 mL para impregnar 4 garrafas, de modo a compensar uma eventual perda de alguma solução durante o processo) 19 POP para avaliar as propriedades esterilizantes do piriproxifeno em mosquitos fêmea adultos em bioensaios com garrafas da OMS Anexo 2. Formulário de registro de dados para os bioensaios com garrafas da OMS com piriproxifeno Formulário de registro de dados – bioensaio com garrafas da OMS para avaliar as propriedades esterilizantes do piriproxifeno em mosquitos fêmea adultos Para ser preenchido somente com tinta preta ou azul. Não use lápis ou líquido corretivo Data do bioensaio (dd/mm/aa): Nome do técnico: Local da captura dos mosquitos: Coordenadas Latitude: Longitude: Período da captura dos mosquitos: Data de início: Data de fim: Método de captura: Inseticida testado e concentração: Data da impregnação das garrafas (dd/mm/aa): Número de vezes que as garrafas impregnadas/controle foram usadas anteriormente: Temperatura de armazenamento das garrafas Máx: Mín: Espécie do mosquito: Linhagem do mosquito: Idade das fêmeas (dias): Estado nutricional: (não alimentadas; alimentadas com açúcar e deixadas em jejum; outro, especificar) Hora do início da exposição: Hora do fim da exposição: Temperatura durante a exposição + período de repouso (°C): Máx: Mín: Relative humidity during exposure + holding period (%): Máx: Mín: POP para avaliar as propriedades esterilizantes do piriproxifeno em mosquitos fêmea adultos em bioensaios com garrafas da OMS 20 Mortalidade por garrafa durante o período de repouso de 72 horas após a exposição ao piriproxifeno Test arm Garrafas Concentração de inseticida Número de mosquitos caídos após 1 h de exposição 24 h (Dia 1) 48 h (Dia 2) 72 h (Dia 3) N.º de mortos 24 h após a exposição Mortalidade 24 h após a exposição % N.º de mortos 48 h após a exposição Mortalidade 48 h após a exposição % N.º de mortos 72 h após a exposição Mortalidade 24 h após a exposição % Mosquitos silvestres expostos à CD (100 µg IA/ garrafa) Garrafa w1 Garrafa w2 Garrafa w3 Garrafa w3 Mosquitos silvestres controle (expostos apenas à acetona) Garrafa controle w1 Garrafa controle w2 Garrafa controle w3 Garrafa controle w4 Mosquitos suscetíveis expostos à CD (100 µg IA/ garrafa) Garrafa s1 Garrafa s2 Garrafa s3 Garrafa s4 Mosquitos suscetíveis controle (expostos apenas à acetona) Garrafa controle s1 Garrafa controle s2 Garrafa controle s3 Garrafa controle s4 Total de caídos e taxas de mortalidade durante o período de repouso de 72 horas após a exposição ao piriproxifeno (todas as garrafas) Caídos % Mortalidade % Ao fim de 1 h de exposição 24 h (dia 1) 48 h (dia 2) 72 h (dia 3) Mosquitos silvestres expostos à CD (100 µg IA/garrafa) Mosquitos silvestres controle (expostos apenas à acetona) Mosquitos suscetíveis expostos à CD (100 µg IA/garrafa) Mosquitos suscetíveis controle (Expostos apenas à acetona) Taxa de mortalidade e de oviposição durante o período de oviposição de 4 dias após o fim do período de repouso de 72 horas Fases do teste 120 h (Dia 4) 144 h (Dia 5) 168 h (Dia 6) 192 h (Dia 7) Mosquitos silvestres expostos à CD (100 µg IA/garrafa) N.º total em câmaras no dia 4 N.º de mortos Mortalidade % N.º dos que puseram ovos Taxa de oviposição % Mosquitos controle silvestres (expostos apenas à acetona) N.º total em câmaras no dia 4 N.º de mortos Mortalidade % N.º dos que puseram ovos Taxa de oviposição % Mosquitos suscetíveis expostos à CD (100 µg IA/garrafa) N.º total em câmaras no dia 4 N.º de mortos Mortalidade % N.º dos que puseram ovos Taxa de oviposição % Mosquitos controle suscetíveis (expostos apenas à acetona) N.º total em câmaras no dia 4 N.º de mortos Mortalidade % N.º dos que puseram ovos Taxa de oviposição % POP para avaliar as propriedades esterilizantes do piriproxifeno em mosquitos fêmea adultos em bioensaios com garrafas da OMS 22 Resultados finais do teste Fases do teste Inibição da oviposição % Mosquitos controle silvestres (expostos apenas à acetona) Mosquitos suscetíveis expostos à CD (100 µg IA/garrafa) Os mosquitos do teste são (suscetíveis/resistentes) ao piriproxifeno Observações, se houver: Verificado pelo Diretor de Estudo: Data:
POP para avaliar as propriedades esterilizantes do piriproxifeno em mosquitos fêmea adultos em bioensaios com garrafas da OMS 24 Procedimento operacional padrão para avaliar as propriedades esterilizantes do piriproxifeno em mosquitos fêmea adultos em bioensaios com garrafas da OMS [Standard operating procedure for evaluating the sterilizing properties of pyriproxyfen in adult female mosquitoes in WHO bottle bioassays] ISBN 978-92-4-007913-7 (versão electrónica) ISBN 978-92-4-007914-4 (versão impressa) © Organização Mundial da Saúde 2023. SAlguns direitos reservados. Este trabalho é disponibilizado sob licença CC BY-NC-SA 3.0 IGO. A menção de determinadas companhias ou do nome comercial de certos produtos não implica que a Organização Mundial da Saúde os aprove ou recomende, dando-lhes preferência a outros análogos não mencionados. Salvo erros ou omissões, uma letra maiúscula inicial indica que se trata dum produto de marca registado.