Preparación de la solución de trabajo de colorante de Giemsa

VERSIÓN 1 – FECHA DE ENTRADA EN VIGOR: 1 DE ENERO DE 2016 PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE TRABAJO DE COLORANTE DE GIEMSA DIAGNÓSTICO MICROSCÓPICO DEL PALUDISMO PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR – DMP-POE-04 1. OBJETIVO Y ALCANCE Describir el procedimiento de preparación de una solución de trabajo de colorante de Giemsa a partir de la solución madre para la tinción sistemática de extensiones de sangre en el diagnóstico microscópico del paludismo. Este procedimiento solo podrá modificarse con la aprobación del coordinador nacional del aseguramiento de la calidad del diagnóstico microscópico del paludismo. Todos los procedimientos especificados en el presente documento son de obligado cumplimiento para todos los microscopistas responsables del diagnóstico microscópico del paludismo en los laboratorios nacionales de referencia, los laboratorios hospitalarios y los laboratorios básicos de los establecimientos de salud que llevan a cabo esta prueba. 2. INFORMACIÓN GENERAL Para lograr una tinción óptima de las extensiones de sangre en el diagnóstico microscópico del paludismo se recomienda utilizar una solución de trabajo de colorante de Giemsa recién preparada a partir de una solución madre correctamente elaborada y diluida con una solución amortiguadora de pH 7,2. La solución madre de colorante de Giemsa adquirida para los programas nacionales está normalizada para reducir al mínimo las modificaciones frecuentes de los POE relativos a las tinciones. La tinción con colorante de Giemsa se puede llevar a cabo por un método rápido (con una solución de trabajo al 10%) o lento (con una solución de trabajo al 3%). El método rápido se utiliza en las consultas ambulatorias y los laboratorios con mucha carga de trabajo en los que es fundamental un diagnóstico rápido para atender a los pacientes. El método lento se utiliza para teñir un gran número de muestras, como las recolectadas en encuestas transversales o epidemiológicas y en la investigación sobre el terreno. Algunos laboratorios prefieren teñir los portaobjetos uno por uno, aun cuando se trate de lotes relativamente grandes, ya que de este modo se gasta menos cantidad de colorante de Giemsa. Es preciso determinar con exactitud el volumen de solución de trabajo del colorante de Giemsa que se necesita, en particular para la tinción de portaobjetos uno por uno, para no preparar un gran volumen que quizá se utilice durante largo tiempo y posiblemente se desperdicie. 3. SUMINISTROS, MATERIALES Y EQUIPOS Para la solución de trabajo de colorante de Giemsa al 10%: • Colorante de Giemsa, transferido y filtrado a partir de la solución madre a un frasco de 25 o 50 ml; • solución amortiguadora de pH 7,2; • un vaso de precipitados o un tubo de en- sayo limpio, de 5-10 ml; • una pipeta de Pasteur, y • papel de filtro Whatman de grado 1. Para la solución de trabajo de colorante de Giemsa al 3%: • Colorante de Giemsa, transferido y filtrado a partir de la solución madre a un frasco de 25 o 50 ml; • solución amortiguadora de pH 7,2; • una probeta graduada limpia, de 100-500 ml; • una pipeta de Pasteur, y • papel de filtro Whatman de grado 1. 2DMP-POE-04: PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE TRABAJO DE COLORANTE DE GIEMSA 4. PRECAUCIONES DE SEGURIDAD • El metanol (alcohol metílico) es inflamable y muy tóxico si se inhala o se ingiere; por vía oral, aun cantidades muy pequeñas pueden causar ceguera e incluso la muerte. Evite entrar en contacto con esta sustancia o inhalarla. Cuando no se esté utilizando, el metanol deberá permanecer guar- dado en un armario cerrado con llave. • Es indispensable observar las precauciones universales, que comprenden el uso del equipo de pro- tección individual pertinente, como guantes, gafas protectoras y bata de laboratorio. 5. PROCEDIMIENTO DIAGRAMA DE FLUJO DESCRIPCIÓN DE LA ACTIVIDAD A. Preparación de 10 ml de solución de trabajo de colorante de Giemsa al 10% 1. Vierta 9 ml de solución amortiguadora en un vaso de precipitados o un tubo de ensayo. 2. Filtre la solución madre de colorante de Giemsa con papel de filtro Whatman de grado 1 y transfiérala a un recipiente de 25-50 ml. 3. Añada 1 ml de solución madre de colorante de Giemsa. 4. Utilice el colorante en los 15 minutos posteriores a haberlo preparado y deseche el sobrante. A. Preparación de una solución de trabajo de colorante de Giemsa al 10% a partir de la solución madre para la tinción rápida de un pequeño número de portaobjetos. Para cada portaobjetos con una extensión de sangre se necesitan unos 3 ml de colorante. 1. Vierta 9 ml de la solución amortiguadora de pH 7,2 en un vaso de precipitados o un tubo de ensayo limpio. 2. Filtre la solución madre de colorante de Giemsa a través de un papel de filtro Whatman de grado 1 y transfiérala a un recipiente de entre 25 y 50 ml de capacidad. 3. Mediante una pipeta limpia y seca, añada 1 ml de solución madre de colorante de Giemsa. No tome la alícuota directamente del frasco grande que contiene la solución madre de colorante de Giemsa para evitar que esta se contamine. 4. Prepare la solución de trabajo de colorante de Giemsa en el momento en que vaya a teñir la extensión o extensiones de sangre, y utilícela como máximo en los 15 minutos posteriores a su preparación. Deseche todo el colorante que no haya utilizado. 3DMP-POE-04: PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE TRABAJO DE COLORANTE DE GIEMSA DIAGRAMA DE FLUJO DESCRIPCIÓN DE LA ACTIVIDAD B. Preparación de 100 ml de solución de trabajo de colorante de Giemsa al 3% 1. Vierta 97 ml de solución amortiguadora en una probeta graduada. 2. Filtre la solución madre de colorante de Giemsa con un papel de filtro Whatman de grado 1 y transfiérala a un recipiente de 25-50 ml. 3. Añada 3 ml de solución madre de colorante de Giemsa. 4. Utilice el colorante en los 15 minutos posteriores a haberlo preparado y deseche el sobrante. B. Preparación de una solución de trabajo de colorante de Giemsa al 3% a partir de solución madre para la tinción lenta de un lote de entre 20 y 100 portaobjetos 1. Vierta 97 ml de la solución amortiguadora de pH 7,2 en una probeta graduada limpia. 2. Filtre la solución madre de colorante de Giemsa a través de un papel de filtro Whatman de grado 1 y transfiérala a un recipiente de entre 25 y 50 ml. 3. Mediante una probeta graduada o una pipeta, mida 3 ml de solución madre de colorante de Giemsa. No tome la alícuota directamente del frasco grande que contiene la solución madre de colorante de Giemsa para evitar que esta se contamine. 4. Prepare la solución de trabajo de colorante de Giemsa en el momento en que vaya a teñir la extensión o extensiones de sangre, y utilícela como máximo en los 15 minutos posteriores a su preparación. Deseche todo el colorante sobrante. 6. NOTAS SOBRE EL PROCEDIMIENTO • Las probetas graduadas, las pipetas, los recipientes y los tubos de ensayo deben estar limpios y secos antes de su uso. • No prepare un único lote de colorante de Giemsa para utilizarlo o reutilizarlo a lo largo del día o durante más tiempo. El colorante de Giemsa absorbe con rapidez el vapor de agua contenido en el aire, y cuando se diluye con agua desionizada, destilada o de cualquier otro tipo, pierde rápid- amente sus propiedades tintóreas, por lo que al cabo de muy poco tiempo la tinción de las exten- siones es deficiente. La película irisada que se forma en la superficie del colorante de Giemsa prepa- rado se adhiere fácilmente a la extensión de sangre y dificulta la identificación de las estructuras. 7. CÁLCULO DEL VOLUMEN DE SOLUCIÓN MADRE DE COLORANTE DE GIEMSA Y DE SOLU- CIÓN AMORTIGUADORA NECESARIO PARA LA TINCIÓN DE PORTAOBJETOS UNO POR UNO Para cada portaobjetos se necesitan 3 ml de solución de trabajo de colorante de Giemsa. En consecuencia, la fórmula que se ofrece a continuación permite calcular el volumen de solución madre de colorante de Giemsa necesario para teñir los portaobjetos uno por uno: Volumen de solución madre de colorante de Giemsa necesario para cada portaobjetos = concentración de colorante de Giemsa necesaria x 3 ml La cantidad de solución amortiguadora (pH 7,2) necesaria para teñir un solo portaobjetos se puede calcular como se indica a continuación: volumen de solución amortiguadora para cada portaobjetos = 3 ml − volumen de solución madre de colorante de Giemsa necesario para cada portaobjetos Los 3 ml de solución de trabajo de colorante de Giemsa se preparan añadiendo el volumen de solución madre de colorante de Giemsa necesario para cada portaobjetos más el volumen calculado de solución amortiguadora a pH 7,2 necesario para cada portaobjetos. 4DMP-POE-04: PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE TRABAJO DE COLORANTE DE GIEMSA Ejemplo 1: Tinción de 15 portaobjetos con solución de colorante de Giemsa al 10% Según lo anterior, el volumen de solución madre de colorante de Giemsa necesario para teñir 15 portaobjetos uno por uno con solución de colorante de Giemsa al 10% se puede calcular como se describe a continuación: (10/100) x 3 ml x 15 portaobjetos = volumen de solución madre de colorante de Giemsa necesario para teñir 15 portaobjetos (0,1 x 3 ml) x 15 portaobjetos = 4,5 ml Del mismo modo, el volumen de solución amortiguadora de pH 7,2 necesario para teñir 15 portaobjetos uno por uno con solución de colorante de Giemsa al 10% se puede calcular como se describe a continuación: [3 ml − (0,1 x 3 ml)] x 15 portaobjetos = volumen de solución amortiguadora necesario para teñir 15 portaobjetos [3 ml − 0,3 ml] x 15 portaobjetos = 40,5 ml Por consiguiente, se deben mezclar 4,5 ml de solución madre de colorante de Giemsa con 40,5 ml de solución amortiguadora para preparar la cantidad de solución de trabajo de colorante de Giemsa al 10% necesaria para teñir uno por uno 15 portaobjetos. 8. POE RELACIONADOS DMP-POE-02: Preparación de la solución madre de colorante de Giemsa DMP-POE-03a: Preparación de la solución amortiguadora de pH 7,2 DMP-POE-03b: Preparación de la solución amortiguadora de pH 7,2 con pastillas de amortiguador DMP-POE-03c: Control de la calidad de la solución madre de colorante de Giemsa y de la solución amortiguadora DMP-POE-07a: Tinción de Giemsa de extensiones de sangre para el diagnóstico microscópico del paludismo. 9. REFERENCIAS Organización Mundial de la Salud. Bases del diagnóstico microscópico del paludismo. Parte I. Guía del alumno. Segunda edición. Ginebra: 2014. Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades. Laboratory diagnosis of malaria. Staining for malaria parasites. Atlanta, Georgia; 2013 (http://www.cdc.gov/dpdx/resources/pdf/benchAids/malaria/ malaria_staining_benchaid.pdf, consultado el 14 de diciembre de 2015). 10. HISTORIAL DEL DOCUMENTO Fecha (mmm/aaaa) Versión Observaciones Persona responsable (Nombre y apellido) Ene de 2016 1 Examinado y redactado en su versión definitiva por expertos, editado y formateado Glenda Gonzales, Funcionaria técnica, WPRO WHO/HTM/GMP/MM/SOP/2016.04 © Organización Mundial de la Salud 2016. Se reservan todos los derechos.