Avantages de l'utilisation des cellules d'Aedes aegypti en culture pour la détection du virus de la fièvre jaune

Bulletin de l'Organisation mondiale de la Sante, 61 (4): 719 - 723 (1983) © Organisation mondiale de la Sante 1983 Avantages de l'utilisation des cellules d'Aedes aegypti en culture pour la detection du virus de la fievre jaune* V. DEUBEL,1 M. CORNET,2 C. ADAM,3 M. Diop,3 G. HEME,4 & J. P. DIGOUTTE5 Dans le cadre d'une recherche du virus amaril lors d'une poussd5e dpiddmique au Segnegal, il nous a ete possible de comparer les differentes methodes utilisetes a l'heure actuelle pour ddtecter et caractkriser certains arbovirus a' partir de sangs humains ou de moustiques. Des souriceaux, des moustiques Toxorhynchites et des cellules en culture d'Aedes aegypti ou Vero ont ete inocules a partir des prelvements. L'immuno- fluorescence indirecte sur les cellules d'A. aegypti est au moins aussi sensible que les autres methodes d'isolement et presente l'avantage de permettre une reponse rapide au bout de trois jours.. L'examen direct de la tete des moustiques capture's s'est revele negatif en immunofluorescence pour deux moustiques trouves positifs par d'autres methodes. L'inoculation de cellules Vero n'a permis l'isolement que d'une seule souche humaine parmi les quatre isoldes par les autres methodes. La detection et la caract6risation d'arbovirus par inoculation intracerebrale au souriceau A partir de materiel recolt6 dans la nature, c'est-A-dire de souches non adaptees, ont ete avantageusement completees ces dernieres annees par d'autres tech- niques: cultures de cellules de mammiferes (1-4) ou d'insectes (1-3, 5-7) et inoculation intrathoracique au moustique (8, 9). La presence du virus est alors revelee par immunofluorescence indirecte (4, 7), par l'effet cytopathogene sur les cellules (1-6), ou par fixation du complement (3, 7). A l'occasion de manifestations du virus amaril au Se'ngal au cours du deuxieme semestre 1981 (10), nous avons voulu comparer differentes methodes d'isolement et d'identification du virus afin de deter- miner la plus apte A fournir un diagnostic rapide. Cinq techniques ont ete utilisees: 1) la reaction d'immunofluorescence sur des tetes de moustiques recoltes dans la nature et ecrasees (methode des «squashes»)); 2) l'inoculation intracerebrale au souriceau; 3) l'inoculation intrathoracique au moustique Toxorhynchites; * Ce travail a et realise conjointement par l'Institut Pasteur de Dakar et le Centre d'Entomologie medicale de Dakar de l'Office de la Recherche scientifique et technique outre-mer (ORSTOM). ' Charge de recherche, Chef du laboratoire des virus, Institut Pasteur de Dakar, 36 avenue Pasteur, B.P. 220, Dakar, Senegal. 2 Entomologiste medical, ORSTOM. 3Technicien de laboratoire, Institut Pasteur de Dakar. 4Assistante de laboratoire, Institut Pasteur de Dakar. sDirecteur de l'Institut Pasteur de Dakar. 4) l'inoculation en culture de cellules d'Aedes aegypti, clone C17; 5) l'inoculation en culture de cellules de mammi- fere, type Vero. Les antigenes viraux ont ete caracterises, soit par une reaction d'immunofluorescence indirecte sur les cellules ensemencees ou sur les <<squashes>) de tetes de moustiques, soit par une reaction de fixation du complement A partir des cerveaux de souriceaux. MATtRIEL ET MtTHODES Au total 158 prelevements ont ete faits au S6n6gal fin 1981, alors que sevissait une petite epidemie de fievre jaune dans la region de Mekhe, a environ 150 km au nord-est de Dakar (10): - 75 prelevements sanguins chez des sujets febriles ou/et icteriques dans la region de Mekhe; - 18 prelevements sanguins chez des adultes hospitalises a Dakar avec suspicion de fievre jaune; - 65 moustiques captures dans les villages de la region de Mekhe: 24 Aedes aegypti (179 9 -7 o'o), 29 9 Aedes metallicus, 349 9 Aedes furcifer et 5 9Q Aedes taylori. Les sangs et les moustiques ont ete conserves congeles A - 70 °C en attendant leur examen. Examen direct des tetes de moustiques capture's. La tete des moustiques etait sectionnee puis ecrasee 4333 -719- V. DEUBEL ET AL. sur une lame (11); cette tete ecrasee («squash») etait testee par une reaction d'immunofluorescence indi- recte. Les corps des moustiques etaient places dans des tubes numerotes de facon a garder la corres- pondance entre tete et corps. Inoculation au souriceau. Les prelevements sanguins etaient dilues au 1/5 dans une solution de tampon phosphate additionnee de 0,75% d'albu- mine bovine (TPAB). Les corps de moustiques etaient broyes indivi- duellement dans un micromortier avec 1 ml de TPAB. Apres centrifugation A 3000 g pendant 15 minutes, le surnageant etait recueilli et constituait l'inoculum pur. Sept souriceaux Swiss de 24 heures etaient inocules par voie intracerebrale avec 0,02 ml du materiel ainsi prepare et observes pendant 21 jours. Le cerveau des souriceaux qui presentaient des symptomes neurolo- giques etait preleve pour la preparation d'un anti- gene utilise pour l'identification du virus. Chaque cerveau etait broye dans 2 ml de tampon borate 0,05 mol/l pH 9 et le surnageant utilise dans un test de fixation du complement selon la methode LBCF en microtechnique (12). Le cerveau des souriceaux douteux etait broye et reinocule a une nouvelle portee de souriceaux (deuxieme passage). Inoculation au Toxorhynchites. Les prelvements sanguins etaient dilues au 1/100 dans le TPAB. Les broyats de moustiques utilises etaient les memes que pour l'inoculation au souriceau. Ces prelvements etaient inocules par voie intra- thoracique A 7 Toxorhynchites brevipalpis d'elevage A la dose de 1 Al par moustique. Les Toxorhynchites etaient maintenus pendant 14 jours dans une piece a 30 °C et 80 a 95% d'humidite relative; ils etaient nourris avec une solution sucree a 10%. Au quator- zieme jour, les tetes de trois d'entre eux etaient ecrasees sur lame et testees par une reaction d'im- munofluorescence indirecte. Cultures de cellules. Les prelvements sanguins etaient dilues au 1/100 dans le TPAB. Les broyats de moustiques prepares precedem- ment etaient dilues au 1/10. Les cellules d'Aedes aegypti, clone C17 (13), etaient mises en culture dans des boites Linbro A 24 cupules A 28 'C. Les cellules Vero etaient preparees dans les memes conditions A 37 'C. Lorsque les cellules etaient confluentes, 1,2 ml de chaque ino- culum etait reparti dans 6 cupules. Apres 90 minutes A 37 'C, les cellules etaient lavees trois fois avec du liquide de Hanks, puis 1 ml de milieu de culture etait ajoute et les cellules remises a incuber a leur tempera- ture respective. A des laps de temps differents, allant de 2 A 7 jours, le milieu de culture etait recueilli dans deux cupules; les cellules etaient lavees dans du tampon phosphate (PBS), remises en suspension dans 100 Al de PBS, et deux depots de 10 Al etaient effectues sur une lame A fluorescence. Les lames etaient sechees et fixees dans l'acetone A -20 'C (4, 7). Une cupule de plaque Linbro de chaque type cellu- laire etait inoculee avec 0,2 ml de chaque surnageant du meme type cellulaire recueilli au septieme jour (deuxieme passage). Les cellules etaient examinees en immunofluorescence au septieme jour. Immunofluorescence indirecte. La technique uti- lisee a ete precedemment decrite (4, 7). Les ascites de souris hyperimmunisees contre le virus de la fievre jaune preparees dans une precedente etude (13), et conservees A -70 'C, etaient diluees dans un tampon phosphate de facon a obtenir pour chaque test une specificite etroite vis-a-vis de la fivre jaune. Pour cela, une dilution etait choisie, donnant une fluorescence optimale dans les cellules ou les mous- tiques infectes avec le virus de la fievre jaune, et une fluorescence nulle ou tres faible vis-a-vis de cellules ou de moustiques infectes avec d'autres flavivirus. Ces dilutions etaient respectivement de 1/40 pour les cellules et de 1/200 pour les moustiques (l'ascite utilisee pour les cellules etait differente de celle utilisee pour les moustiques). RESULTATS Le tableau 1 compare les isolements de virus amaril obtenus par chaque methode, la quantite du materiel initial inocule et le temps necessaire au diagnostic. L'examen direct de la tete des moustiques cap- tures, methode a priori la plus rapide, s'est revele negatif, meme pour les deux moustiques trouves positifs par d'autres methodes. L'inoculation au souriceau a permis l'isolement de 6 souches de virus; pour 5 d'entre elles, les souri- ceaux ont presente des signes de paralysie au neuvieme jour et sont tous morts au plus tard le douzieme jour; pour la 6' souche, cinq souriceaux sur huit sont morts entre le onzieme et le dix- huitieme jour; au deuxieme passage, tous les souri- ceaux mouraient entre le cinquieme et le sixieme jour. L'inoculation au Toxorhynchites a permis l'identi- fication des 6 memes souches; les trois moustiques testes pour chaque souche se sont tous reveles positifs. Ces 6 souches ont et isolees sur des cellules d'Aedes aegypti en culture, A partir du deuxieme jour pour 5 d'entre elles, du troisieme jour pour la derniere (tableau 2). Le nombre des cellules posse- dant alors un cytoplasme fluorescent etait faible, de 720 DETECTION DU VIRUS DE LA FI1VRE JAUNE l'ordre de 1lo a 307o, mais le diagnostic etait aise et sans ambiguite. Au septieme jour, le pourcentage d'infection des cellules etait superieur a 30%7o. Aucun effet cytopathogene n'a ete observe sur ces cellules, meme apres un deuxieme passage des souches trouvees positives. Seuls les sangs humains ont ete inocules sur cellules Wro, et une seule souche a pu etre isolee sur les 4 isolees par d'autres methodes (tableaux 1 et 2). Un deuxieme passage a l'aveugle n'a pas permis l'isolement d'autres souches (tableau 2). DISCUSSION Seules trois des cinq techniques utilisees ont permis l'isolement des 6 souches de virus: l'inocu- lation intracerebrale au souriceau, l'inoculation intrathoracique au Toxorhynchites, et l'inoculation aux cellules d'Aedes aegypti. L'examen direct des tetes de moustiques captures s'est revele negatif, probablement parce que l'in- fection de ces moustiques etait recente et que le virus Tableau 1. Comparaison de diff6rentes techniques d'isolement du virus amaril A partir du sang de malades ou de moustiques captur6s dans la nature Sangs Moustiques Temps requis inoculum hbpitaux r6gion inoculum r6gion Tests pour le pur inject6 de Dakar de M6khd pur inject6 de MAkhA diagnostic par testa,b Nbre d'isole- Nbre d'isole- par testa,b Nbre d'isole- (jours) (,ul) ments positifs ments positifs {41) ments positifs(testes 18) (test6s 75) (test6s 65) Squashes directs 1 0 Souriceau 12-18 28 (7) 1 3 140 (7) 2 Toxorhynchites 14 0,03 (3) 1 3 3 (3) 2 Cellules C17 2-3 4 (2) 1 3 40 (2) 2 Cellules VWro 7 4 (2) 0 1 40 (2) NT ° L'inoculum pur correspond au sang pur ou au surnageant d'un moustique broy6 dans 1 ml. b Les chiffres entre parenthbses correspondent au nombre d'animaux, insectes ou cupules de cellules test6s. NT = non test6 Tableau 2. Pourcentage d'infection des cellules d'Aedes aegyptiet VWro par quatre prAl6vements sanguins contenant du virus amaril, d6termin6 par immunofluorescence indirecte A des laps de temps diff6rents aprbs l'inoculation Pr6l6vements 1 (4,1 3)a 2 (3,96) 3 (4,03) 4 (3,66) Nombre de jours 1 2 3 5 7 1 2 3 5 7 1 2 3 5 7 1 2 3 5 7 C17 1 er passage 0 3 10 30 60 0 1 2 20 40 0 1 2 20 50 0 0 1 10 30 2' passage 100 90 100 40 V6ro 1er passage 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2' passage 10 0 0 0 0 Titre de la vir6mie en logio TCID50/ml d6termin6 sur cellules Cl 7. 721 V. DEUBEL ET AL. n'etait pas encore parvenu aux ganglions cere- broides; l'infection de ces ganglions n'est nette qu'apres 8 jours d'incubation A 30 IC chez Aedes aegypti (M. Cornet, observations non publiees, 1981), probablement un peu plus dans la nature ou les temperatures moyennes sont plus moderees. Dans une etude recente, le developpement, sur cellules de rein de singe en lignee continue, de souches de virus amaril adaptees au souriceau permettait un diagnostic par immunofluorescence indirecte au troisieme ou quatrieme jour avec pre- sence d'un effet cytopathogene du quatrieme au sixieme jour (4). Nos resultats, obtenus avec les cellules Vero, montrent que leur utilisation n'est pas adequate pour l'isolement du virus amaril en milieu naturel, une seule souche sur les 4 testees ayant pu etre isolee. Le manque de sensibilite de ce type de cellules par rapport aux cellules d'insectes pour l'isolement des virus de la dengue avait dejA et remarque (1-3). Le meme phenomene, peut-etre caracteristique des cellules de mammiferes, a et observe avec des cellules de rein de porc PS qui se sont revelees egalement peu sensibles lors de l'isole- ment du virus amaril (14). Pour les trois methodes ayant permis l'isolement des 6 souches de virus, il n'est pas possible de conclure A la plus ou moins grande sensibilite de chacune d'elles A partir de cette etude, en raison du volume different inocule. Ces 6 prelevements devaient contenir une quantite importante de virus, ce qui a et verifie pour les prelvements sanguins (tableau 2). Par contre, il est indeniable que les cultures de cellules d'Aedes aegypti, clone C17, constituent actuellement le moyen le plus rapide de faire le diag- nostic de fievre jaune sur des pr&levements recoltes dans la nature. L'immunofluorescence indirecte pre- sente l'avantage de ne pas attendre l'effet cyto- pathogene utilise par d'autres auteurs (1-6), d'au- tant plus que les cellules C17 utilisees avaient entre 20 et 25 passages et qu'au-delA de 15 passages ce clone n'a plus presente l'effet cytopathogene observe precedemment avec le virus amaril (13). Il est possible d'accelerer le diagnostic avec les Toxorhynchites: l'infection des ganglions cere- broides, qui permet le diagnostic sur «squashes>>, n'apparait qu'au dixieme jour A 30 °C chez Toxo- rhynchites brevipalpis, et est maximale au douzieme jour, mais si l'on peut diminuer ce dMlai d'incubation de deux jours en maintenant les moustiques infectes a 32 °C, on ne pourra en aucun cas atteindre les deux ou trois jours qui suffisent pour le diagnostic sur cellules d'Aedes aegypti. En conclusion, l'utilisation des cultures de cellules d'Aedes aegypti en cas de suspicion de fievre jaune est le moyen qui permet le diagnostic de certitude le plus rapide, autorisant une intervention immediate des services de sante publique dans la zone infectee. REMERCIEMENTS Nous remercions le Dr M. Germain et le Dr p. Martin-Saxton ainsi que MM. L. Ferrara et M. Gueye qui se sont charges des prelevements sur le terrain. SUMMARY ADVANTAGES IN THE USE OF CELLS OF AEDES AEGYPTI IN CULTURE FOR THE IDENTIFICATION OF YELLOW FEVER VIRUS The technique of isolating and identifying yellow fever virus on cells of Aedes aegypti, clone C17, is more rapid than the methods of intracerebral inoculation in the baby mouse or intrathoracic inoculation in the Toxorhynchites mosquito; the diagnosis can be made in 3 days, whereas with the other techniques it takes about a fortnight. These three techniques were used to isolate 6 strains of yellow fever virus: 4 from human blood and 2 from Aedesfurcifer. The results of direct examination of the heads of these two mosquitos by indirect immunofluorescence were negative. These non-adapted virus strains develop poorly in cultures of mammalian cells of the Vero type, and this contra- indicates their use for obtaining a rapid diagnosis of yellow fever. 722 DETECTION DU VIRUS DE LA FIEVRE JAUNE 723 BIBLIOGRAPHIE 1. SINGH, K. R. P. & PAUL, S. D. Isolation of dengue viruses in Aedes albopictus cell cultures. Bulletin de l'Organisation mondiale de la Sante, 40, 982-983 (1969). 2. CHAPPEL, W. A. ET AL. Comparison of three methods used to isolate dengue virus type 2. Applied Micro- biology, 22: 1100-1103 (1971). 3. RACE, M. W. ET AL. Dengue in the Caribbean: virus isolation in a mosquito (Aedes pseudoscutellaris) cell line. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 73: 18-22 (1979). 4. EL MEKKI, A. A. & VAN DER GROEN, G. A comparison of indirect immunofluorescence and electron micro- scopy for the diagnosis of some haemorrhagic viruses in cell cultures. Journal of virological methods, 3: 61-69 (1981). 5. VARMA, M. G. R. ET AL. Isolations in a mosquito (Aedes pseudoscutellaris) cell line (Mos. 61) of yellow fever virus strains from original field material. Inter- virology, 6: 50-56 (1975/76). 6. PUDNEY, M. ET AL. Replication of arboviruses in arthropod in vitro systems. In: Kurstak, E., ed., Proceedings of the Second International Symposium on Arctic Arboviruses, Mont Gabriel, May 1977, New York, Academic Press, 1979, pp. 245-262. 7. TESH, R. B. A method for the isolation and identifi- cation of dengue viruses, using mosquito cell cultures. American journal of tropical medicine and hygiene, 28: 1053-1059 (1979). 8. ROSEN, L. & GUBLER, D. The use of mosquitoes to detect and propagate dengue viruses. American journal of tropical medicine and hygiene, 23: 1153-1160 (1974). 9. Coz, J. ET AL. Utilisation du moustique pour la multi- plication des arbovirus, Cahiers ORSTOM, serie Ento- mologie medicale et parasitologie, XV: 205-212 (1977). 10. DIGOUTTE, J. P. ET AL. A propos de deux foyers recents de fievre jaune detectes au Senegal: application d'une nouvelle methode de diagnostic a la prevention. In: Compte rendu de la quatorizieme confe'rence technique de I'OCEAC, Yaounde', 19-24 avril 1982. 11. KUBERSKI, T. T. & ROSEN, L. A simple technique for the detection of dengue antigen in mosquitoes by immunofluorescence. American journal of tropical medicine and hygiene, 26: 533-537 (1977). 12. CASEY, H. L. Standardized diagnostic complement fixation method and adaptation to microtest. In: Public Health Monograph, Washington, US Govern- ment Printing Office, 1965, N° 74. 13. DEUBEL, V. & DIGOUTTE, J. P. Morphogenesis of yellow fever virus in Aedes aegypti cultured cells. I. Isolation of different cellular clones and the study of their susceptibility to infection with the virus. American journal of tropical medicine and hygiene, 30: 1060-1070 (1981). 14. DEUBEL, V. ET AL. Donnees recentes sur la biochimie du virus amaril en relation avec son comportement biolo- gique. In: Deuxieme colloque international de micro- biologie tropicale, Abidjan, 22-25 mars 1982. Resume dans: Annales de microbiologie (Institut Pasteur), 133A: 9-10 (1982).