A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy 2017 update A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update ISBN: 978 92 9022 619 2 © World Health Organization 2017 Some rights reserved. This work is available under the Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 3.0 IGO licence (CC BY-NC-SA 3.0 IGO; https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/igo). Under the terms of this licence, you may copy, redistribute and adapt the work for non-commercial purposes, provided the work is appropriately cited, as indicated below. In any use of this work, there should be no suggestion that WHO endorses any specific organization, products or services. The use of the WHO logo is not permitted. If you adapt the work, then you must license your work under the same or equivalent Creative Commons licence. 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Cover photos: Mr Masanori Matsuoka A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update iii Contents List of contributors ......................................................................................................... iv Abbreviations and acronyms ........................................................................................... v Executive summary ....................................................................................................... vii 1. Objectives of the guide and its target population ....................................................1 2. Background ...........................................................................................................2 3. Rationale for developing the guide .........................................................................3 4. Global Leprosy Strategy 2016–2020 at a glance .....................................................4 5. Overview of the surveillance system on antimicrobial resistance in leprosy .............5 5.1 Objectives ....................................................................................................5 5.2 Definitions ....................................................................................................5 5.3 Resistance among new cases .........................................................................6 5.4 Resistance among retreatment cases ..............................................................7 5.5 Scheme for surveillance of AMR in leprosy ....................................................8 6. Setting up or expanding a surveillance system at the national level .........................9 6.1 Selection of the testing laboratories involved ................................................9 6.2 Selection of laboratories for quality control purposes ..................................10 6.3 Identification of sample collection health facilities ......................................11 6.4 Calculation of sample size ..........................................................................12 6.5 Systematic collection of samples..................................................................12 6.6 Laboratory tests ...........................................................................................14 6.7 Systematic recording of information ...........................................................19 6.8 Monitoring antimicrobial resistance .............................................................19 Bibliography .................................................................................................................21 Annexes 1. International reference laboratories ......................................................................24 2. National leprosy drug resistance register ................................................................................................25 3. Form 1. Clinical report form for MB leprosy cases to be tested for drug resistance 26 4. Form 2. Report of the testing laboratory ..............................................................28 5. Reporting form for treatment outcomes of resistant cases .....................................31 6. Laboratory protocols ............................................................................................32 7. Sentinel surveillance protocol ...............................................................................41 8. Clinical management of resistant cases detected...................................................44 A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 updateiv This Guide was prepared by Professor Emmanuelle Cambau, Université Paris Diderot, France; Dr Laura Gillini (Global Leprosy Programme); and Mr Masanori Matsuoka, National Leprosy Museum of Jukanbo, Japan. Other contributors were: Dr Bertrand Cauchoix, Fondation Raoul Follereau, Paris, France Professor Stewart Cole, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, Switzerland Dr Erwin Cooreman, Global Leprosy Programme, WHO Regional Office for South-East Asia, New Delhi, India Dr Anil Kumar, National Leprosy Eradication Programme (NLEP), New Delhi, India Dr V R R Pemmaraju, Global Leprosy Programme, WHO Regional Office for South-East Asia, New Delhi, India Dr Rupali Roy, National Leprosy Eradication Programme (NLEP), New Delhi, India Dr Paul Saunderson, American Leprosy Missions, Norway Dr David Scollard, National Hansen Disease Program, Baton Rouge, USA Dr Sirenda Vong, Health Emergency Information and Risk Assessment Department, WHO Regional Office for South-East Asia, New Delhi, India Professor Aditama Tjandra Yoga, Special Adviser to the Regional Director, WHO Regional Office for South-East Asia, New Delhi, India Mr Rakesh Mani Rastogi, Health Systems Development, WHO Regional Office for South- East Asia, New Delhi, India The final draft of the document was reviewed after a workshop held in Hyderabad, India from 10 to 11 August 2017 to discuss a model of antimicrobial resistance in leprosy in India. This workshop was attended by NLEP staff, including state and district leprosy coordinators, WHO staff, experts from the Jalma Institute of Leprosy & Other Mycobacterial Diseases (Agra), the Foundation for Medical Research (Mumbai), staff from dermatology departments of tertiary-level hospitals and representatives of NGOs (The Leprosy Mission, Netherlands Leprosy Relief, Lepra UK, American Leprosy Missions), and took into account challenges and approaches discussed with the country representatives. List of contributors A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update v AMR antimicrobial resistance BI bacillary index DRDR dapsone resistance-determining region GLASS Global Antimicrobial Resistance Surveillance System GLP Global Leprosy Programme IATA International Air Transport Association ILEP International Federation of Anti-Leprosy Associations MB multibacillary MDT multidrug therapy MoU memorandum of understanding NGO nongovernmental organization PB paucibacillary PBS phosphate buffered saline PCR polymerase chain reaction QRDR quinolone resistance-determining region RLEP M. leprae-specific repetitive element RRDR rifampicin resistance-determining region TB tuberculosis WHO World Health Organization Abbreviations and acronyms
A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update vii The emergence of drug resistance is a concern and a threat for many infectious disease intervention programmes, especially those that have secondary prevention (chemotherapy) as the main component of their control strategy. The fight against leprosy has been a great success, largely due to the development of multidrug therapy (MDT) in 1981. The roll-out of MDT in the late 1980s has been a major factor in bringing down dramatically the burden of leprosy until the year 2005, after which a plateau was observed in the number of cases on treatment, and a much slower reduction in notification. As rifampicin is the backbone of the MDT regimen, it is important to monitor the emergence of rifampicin-resistant strains, as recent reports and publications have indicated the existence of rifampicin resistance in several endemic areas. Prior to the introduction of MDT, patients were treated with dapsone monotherapy for several years. Resistance to dapsone has been reported since the early 1960s. In case of resistance to rifampicin, fluoroquinolones become the preferred category of second-line drugs. Unfortunately, quinolone-resistant strains of Mycobacterium leprae have also been reported in several countries, probably due to the extensive use of quinolones for treating several types of infections. Clofazimine resistance is still rare but this antimicrobial cannot be given alone. To meet the challenge of containing the disease and being able to respond to an increase in circulation of drug-resistant strains, it is essential to assess drug-sensitivity patterns globally, as well as to monitor resistance among both new and retreatment cases. Executive summary
A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update 1 This document aims to guide countries on how to test for drug resistance in leprosy. It highlights the clinical, field and laboratory support systems that need to be put in place to undertake this activity. Antimicrobial resistance (AMR) is one of the key areas of intervention of the Global Leprosy Strategy 2016–2020, under its Pillar II “Stop leprosy and its complications”. Under this Strategy, all countries that detect leprosy are expected to set up a system to allow testing for AMR either in a national laboratory or in a laboratory located abroad. This guide aims to promote the use of a twofold standardized approach: (1) to detect primary and secondary drug resistance to antileprosy drugs, namely, rifampicin, dapsone and ofloxacin; (2) to standardize reports related to the results of testing done and on patients’ outcomes of treatment. The availability of data on drug resistance in leprosy will allow global, national and subnational monitoring of drug resistance trends over time among new and retreatment cases of leprosy (see definitions in Section 5.2). It would also help to identify risk factors for drug resistance (age, sex, area of residence, patient’s category/type). The target audience for the updated guide consists of managers of national leprosy programmes, clinicians and personnel at referral facilities and sentinel sites, laboratory coordinators and technicians working in leprosy, as well as consultants working in the field of leprosy and of neglected tropical diseases (NTDs). Objectives of the guide and its target population 1 A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update2 The current network for drug-resistance surveillance was implemented jointly by the World Health Organization (WHO) and The Nippon Foundation, followed in later years by funding support from the International Federation of Anti-Leprosy Associations (ILEP) between 2008 and 2016. The countries that participated in the sentinel surveillance network were: Benin, Brazil, Burkina Faso, China, Colombia, Ethiopia, Guinea, India, Indonesia, Madagascar, Mali, Mozambique, Myanmar, Nepal, Niger, Pakistan, Philippines, Viet Nam and Yemen. In 2016 Sri Lanka started testing samples. The countries that are part of the network either test samples in national laboratories, as is the case for Brazil (two testing laboratories), China, Colombia, India (four testing laboratories), Indonesia and Nepal, or send samples to the following four laboratories: National Hansen’s Disease Programs Laboratory Research Branch, Baton Rouge, Louisiana, United States of America (USA); Global Health Institute, École Polytechnique Fédérale de Lausanne, Switzerland; National Reference Centre on Mycobacteria and Resistance to Anti-tuberculosis Drugs, Hôpital Lariboisière, Paris, France; and Leprosy Research Center, National Institute of Infectious Diseases, Tokyo, Japan. These laboratories are considered as international reference laboratories for AMR in leprosy. The reference laboratories that are part of the network in 2017 are listed in Annex 1. Some of the national laboratories are located within government hospitals and/or institutions, while others are located in hospitals managed by nongovernmental organizations (NGOs). WHO/ILEP support to laboratories consists of providing funding to some of the international laboratories (Lausanne and Paris), and funding a biannual meeting organized by WHO to discuss results and laboratory methods. The cost for testing at the national level is borne by national governments or international NGOs. The network became functional in 2008 following identification of mutations associated with drug resistance in specific genomic loci of Mycobacterium leprae, conferring resistance to dapsone, rifampicin and ofloxacin. Initially, testing was recommended only for relapse cases to assess the level of secondary resistance and the corresponding results were published in the Weekly epidemiological record (most recent publication was in June 2011: Wkly Epidemiol Rec. 2011;23 (86):233 4). The first guidelines on drug resistance surveillance in leprosy were published in 2009 (Guidelines for global surveillance of drug resistance in leprosy. New Delhi: WHO Regional Office for South-East Asia; 2009). Background2 A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update 3 This guide has been prepared by WHO’s Global Leprosy Programme (GLP) in coordination with the main leprosy stakeholders. Since 2011, some countries had already started testing new cases for drug resistance in addition to relapse cases to be able to assess the level of primary drug resistance. In addition, the difficulty of meeting the definition of relapse was a barrier to testing for secondary resistance. This may change in light of the new case definitions for leprosy included in the Global Leprosy Strategy 2016–2020: Monitoring and Evaluation Guide (see also Section 5.2). Laboratories participating in the network were assessed for the quality of genomic amplification by the international reference laboratory in Japan in 2009 and 2011 with good concordance. Each of the involved laboratories uses its own techniques, such as polymerase chain reaction (PCR) products direct sequencing, DNA strip assay, high-resolution melting analysis or whole-genome sequencing. The detection of AMR in leprosy has not been standardized so far. Specimens collected consisted of slit-skin smears (as per the 2009 guidelines); in later years, skin biopsies have also been collected and analysed. All data collected globally from 2010 to 2015 was synthesized during the global Consultation on Antimicrobial Resistance Surveillance in October 2016. Formal reports were received on a total of 1086 relapse cases and 776 new cases tested globally before the end of 2015, among which resistance to rifampicin was identified in 57 relapse cases (5.2% secondary resistance) and 16 new cases (2.1% primary resistance). These results pointed out the need for expanding the surveillance network not only in terms of laboratories and countries involved, but also in terms of scope, increasing the number of samples tested out of the total cases detected, and implementing a continuous surveillance model for secondary resistance. This is also in line with the space that AMR in leprosy has been given as one of the key areas of intervention under the Global Leprosy Strategy 2016–2020. The World Health Assembly issued a resolution on AMR in 2015 (WHA 68.20) together with a global action plan; therefore, this importance given under the Global Leprosy Strategy fits within a general global attention to drug resistance. For these reasons, GLP in collaboration with its main partners and stakeholders, has prepared this guide as an update to the surveillance guidance of 2009. 3 Rationale for developing the guide A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update4 Zero disease Zero transmission of leprosy infection Zero disability due to leprosy Zero stigma and discrimination VISION A L E P R O S Y -F R E E W O R L D 2016-2020 GLOBAL LEPROSY STRATEGY Further reduce the global and local leprosy burden GOAL TARG ETS INDICATORS 2020 target Number of children diagnosed with leprosy and visible deformities 0 Rate of newly diagnosed leprosy patients with visible deformities <1 per million Number of countries with legislation allowing discrimination on basis of leprosy 0 PILLARS AND COMPONENTS 1. Strengthen government ownership, coordination and partnership • Ensuring political commitment and adequate resources for leprosy programmes. • Contributing to universal health coverage with a special focus on children, women and underserved populations including migrants and displaced people. • Promoting partnerships with state and non-state actors and promote intersectoral collaboration and partnerships at the international level and within countries. • Facilitating and conducting basic and operational research in all aspects of leprosy and maximize the evidence base to inform policies, strategies and activities. • Strengthening surveillance and health information systems for programme monitoring and evaluation (including geographical information systems) 2. Stop leprosy and its complications • Strengthening patient and community awareness on leprosy. • Promoting early case detection through active case-finding (e.g. campaigns) in areas of higher endemicity and contact management. • Ensuring prompt start and adherence to treatment, including working towards improved treatment regimens. • Improving prevention and management of disabilities. • Strengthening surveillance for antimicrobial resistance including laboratory network. • Promoting innovative approaches for training, referrals and sustaining expertise in leprosy such as eHealth. • Promoting interventions for the prevention of infection and disease. 3. Stop discrimination and promote inclusion • Promoting societal inclusion through addressing all forms of discrimination and stigma. • Empowering persons affected by leprosy and strengthen their capacity to participate actively in leprosy services. • Involving communities in actions for improvement of leprosy services. • Promoting coalition-building among persons affected by leprosy and encourage the integration of these coalitions and or their members with other community-based organizations. • Promoting access to social and financial support services, e.g. to facilitate income generation, for persons affected by leprosy and their families. • Supporting community-based rehabilitation for people with leprosy-related disabilities. • Working towards abolishing discriminatory laws and promote policies facilitating inclusion of persons affected by leprosy. 4 Global Leprosy Strategy 2016–2020 at a glance A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update 5 5.1 Objectives The objective of the surveillance system is to determine primarily resistance to rifampicin among leprosy cases, either alone or combined with resistance to dapsone and/or ofloxacin among new cases (a proxy for primary resistance) and among retreatment cases (a proxy for secondary resistance), and to monitor resistance rates over time. It would also provide disaggregated information so that a possible association between resistance and specific sex and age groups, and/or geographical location of leprosy cases can be identified. 5.2 Definitions New case (of leprosy): a patient diagnosed with leprosy who has never been treated for the disease. Retreatment case (of leprosy): a patient diagnosed with leprosy who has already received treatment for the disease in the past. Retreatment cases are further classified into the following groups: • Retreatment after loss to follow up: a patient diagnosed with leprosy who has abandoned treatment before its completion and returns to the health-care facility to complete treatment. • Relapse: a patient who has completed a full course of treatment for leprosy in the past and who returns with signs and symptoms of the disease that are not deemed to be due to a reaction according to the clinician. • Transferred in: a patient who has started treatment in one facility and reports to another facility to continue treatment. • Other retreatment: any leprosy case that does not fit in any of the above categories and requires treatment. Both new and retreatment cases can be further classified as follows: PB case: a case of leprosy with 1–5 skin lesions and without demonstrated presence of bacilli in a skin smear. MB case: a case of leprosy with >5 skin lesions; or with any nerve involvement (including pure neuritis or any number of skin lesions and neuritis); or with demonstrated presence of bacilli in a slit-skin smear, irrespective of the number of skin lesions. 5 Overview of the surveillance system on antimicrobial resistance in leprosy A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update6 5.3 Resistance among new cases Samples to be tested. Slit-skin smears or skin biopsies Antimicrobial agents to be investigated. Samples are tested for mutations known to be associated with resistance to rifampicin, dapsone and ofloxacin. Inclusion criteria. To detect primary resistance, a certain number out of the total number of new leprosy cases detected per year have to be tested. In order to have a positive PCR and successful testing for AMR, only smear-positive MB cases with a bacillary index (BI) ≥2+ will be tested, as these have a higher chance of a positive PCR. Define the design of the system. Surveillance for primary AMR in leprosy can be carried out based on either: • a continuous surveillance system that tests all new MB cases (recommended for countries with high laboratory capacity, adequate resources and a small number of cases ONLY); • a cross-sectional survey (recommended for countries with no representative baseline data and with sufficient financial resources); • a sentinel surveillance system with the aim of monitoring the trends in rifampicin resistance among new leprosy cases over a period of time in various regions/states (recommended for countries with nationwide baseline data/after a national survey). A sentinel system after a nationwide survey could be a reasonable approach to generate constant data and be able to analyse trends • setting up an arbitrary sample size, calculating a target proportion of all new MB cases to be tested according to capacity/resources. This should NOT be below 10% of the total new MB cases notified in the previous year (recommended for countries with no nationwide baseline data and without the resources to carry out a nationwide survey). National or international laboratories will be identified for performing the testing. Skin samples would be collected from selected facilities (study sites during surveys or sentinel surveillance sites) after getting patient’s consent and transported to the corresponding assigned national or international testing laboratory. When samples are sent abroad by air, they should be shipped according to the regulations of the International Air Transport Association (IATA). Selection of sample collection health facilities. As slit-skin smears or skin biopsies are not routinely collected at the peripheral level, the patients to be tested will have to be identified among those reporting to intermediate-level facilities where slit-skin smears and/ A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update 7 or biopsies are routinely performed. In the selected facilities, all new patients with a BI ≥2+ would be tested for drug resistance. Information system. Records of the patients would be kept at the facility collecting the samples, at the laboratory and at the national level using a national AMR register (example in Annex 2). 5.4 Resistance among retreatment cases Samples to be tested. Skin-slit smears or skin biopsies Antimicrobial agents to be investigated. Samples are tested for mutations known to be associated with resistance to rifampicin, dapsone and ofloxacin. Inclusion criteria. To detect secondary resistance, all retreatment leprosy cases have to be tested with the exeption of transferred-in cases unless those cases are deemed to be at risk for AMR due to irregular treatment. In such cases, they shall be defined as “other retreatments” in the testing form. In order to have a positive PCR and successful testing for drug resistance, only MB cases confirmed to be smear positive with a BI ≥2+ would be tested, as these have a higher chance of a positive PCR. Design of the system. Surveillance for drug resistance among retreatment cases in leprosy would be carried out by a continuous surveillance method, as the testing covers all retreatment cases (with BI ≥2+) throughout the years. National and international laboratories would be identified for performing the testing. Skin samples (biopsies or skin smears) would be collected from intermediate-level facilities identified for sample collection to test for AMR and transported to the corresponding designated national or international testing laboratory. When samples are shipped by air, IATA regulations should be followed (these can be found at http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/254788/1/WHO-WHE-CPI-2017.8-eng.pdf?ua=1). To implement surveillance according to this methodology, all suspect retreatment cases would have to be referred to those specific intermediate-level facilities to confirm their diagnosis and collect samples for AMR surveillance purposes. This would have the indirect benefit of improving the quality of diagnosis for suspected retreatment leprosy cases and potentially also improving the management of reactions, since some of those patients might indeed be leprosy patients who have already completed treatment but still experience immune-based reactions that are extremely risky for developing disabilities and/or worsening an already existing impairment. A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update8 Information system. Records of the patients would be kept at the sample collecting facility, at the laboratory and at the national level using a national AMR register (an example is shown in Annex 5.) 5.5 Scheme for surveillance of AMR in leprosy Fig. 1. Scheme for surveillance of AMR in leprosy WHO Global Leprosy Programme Publish the annual leprosy report in WHO Weekly epidemiology record Ministry of Health Compile data into the National Antimicrobial Resistance Register Submit data to WHO through the annual data collection global leprosy report Reference laboratory/global reference laboratory Provide samples for quality control to countries and undergo quality control by the Global Reference Laboratory Capacity-building of national laboratories Storage of data, including of detected mutations Laboratory (either in-country or abroad) PCR+ Sequencing for folP1, rpoB and gyrA gene mutations Report results to sample collection site, to Ministry of Health and to reference laboratory (or to the global reference laboratory) Sample collection health facilities (sentinel sites / study sites ) For all MB new and retreatment cases collect samples (slit skin smear or biopsy). If found BI ≥2+ send samples to laboratory for drug resistance testing Global Health Institute, Lausanne, Switzerland Repository of detected mutations Source: Table developed by Professor E. Cambau, Dr M. Matsuoka and Dr L. Gillini A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update 9 Several activities are required to set up and/or expand the surveillance system for AMR in leprosy: (1) identifying the laboratory(ies) to carry out molecular tests for rifampicin, dapsone and ofloxacin resistance. Such laboratories could be located in the country or abroad (one of the four reference laboratories) and could be more than one per country, according to the needs; (2) identifying a laboratory external to the country, among one of the four international laboratories (for countries testing in national laboratories only). A proportion of the samples would need to be sent periodically to the external laboratory; (3) identifying the sample collection health facilities to test for drug resistance in new MB cases with a BI ≥2+; (4) calculating the sample (number of new MB cases to be tested) at each sample collection facility that will have to be tested; (5) setting up a transportation system for sending samples to the testing laboratory; (6) systematically collect information related to the patients tested and corresponding results, including treatment outcomes (which could be done by the National Programme, by a national public health/research institute or by one of the national testing laboratories if adequate information technology [IT]/human resources are available); (7) monitoring the trends in resistance over time and by geographical area, sex, age, category/type of patient and, if possible, by socioeconomic factors. 6.1 Selection of the testing laboratories involved Current laboratory capacity should be strengthened to conduct surveillance activities for leprosy. Surveillance for drug resistance among new cases would be an ongoing activity and participating centres – both national and international – would have to take into account the need to maintain the AMR work over a period of time, unless the model adopted is a point-in-time nationwide survey. However, even in the latter case, the work conducted to perform the survey would later on lead to the setting-up of a routine sentinel surveillance system to ensure the availability of data over time or be followed by a new survey after 3–5 years. One national or international laboratory is sufficient for testing in countries with a low burden of leprosy, while countries with a large number of cases annually should identify more 6 Setting up or expanding a surveillance system at the national level A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update10 than one laboratory to be able to ensure testing of all retreatment cases and a proportion of new MB cases. The laboratories could be run by the government or an NGO. In case an NGO or international laboratory is identified, the National Leprosy Programme should develop a memorandum of understanding (MoU) to ensure access to resistance data by the Programme. National and international testing laboratories should test samples throughout the year until the indicated number of samples to be tested is reached. While the practical performance of testing is the duty of the laboratory, ensuring the availability of a network for correct sample collection, transportation, storage of specimens and shipment, and collection and transmission of data to allow monitoring of resistance data are duties of the National Leprosy Programme. The possibility should be explored of establishing testing within either a tuberculosis (TB) laboratory or within the laboratory that acts as a reference for the national agency in charge of AMR when setting up the surveillance system. 6.2 Selection of laboratories for quality control purposes As part of capacity-building and to ensure the reliability of national data, each country that tests samples at the national level should identify a reference laboratory to perform quality control. National leprosy programmes should develop an MoU to ensure access to services related to quality control. While the practical performance of quality control is a duty of the international reference laboratory, ensuring the regular shipment of samples for quality control purposes, recording and reporting of related information, and storage and revision of the outcomes of quality control activities are duties of the National Leprosy Programme. Quality control of national laboratories would be conducted under the supervision by the international reference laboratory identified as a partner (Baton Rouge, USA; Tokyo, Japan; Paris, France and Lausanne, Switzerland; see Annex 1). To prepare standard material with the support of the international reference laboratory would send representative DNA and bacillary samples (no mutation, known mutation) once a year. In addition, country missions would be conducted by the reference laboratory once every 1–3 years to increase national laboratory capacity and as part of the quality control assessment. All positive and negative skin specimens from each case are to be archived for quality assurance and further testing. Specimens should be kept frozen in the laboratory for at least 10 years. If necessary, a depository can be organized in a reference laboratory, especially for strains that show new mutations. These should be shared with the reference laboratories. The international reference laboratories should also be subject to a quality control system once per year through monitoring coordinated by the laboratory of the Leprosy Research Center, National Institute of Infectious Disease, Tokyo, Japan. A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update 11 While the practical task of complying with the quality control protocols by both the national and international laboratories is their task, ensuring that resources and mechanisms are in place for quality control is a duty of national leprosy programmes. 6.3 Identification of sample collection health facilities Health facilities are identified for collecting samples of both new and retreatment MB cases to be tested for drug resistance. For convenience, it is suggested that the selected sites should be secondary- and tertiary-level centres where slit-skin smears/biopsies are routinely done to assess/classify patients. This would ensure that good-quality samples are collected and avoid referral of new patients seen at a peripheral centre to a higher level of care solely for antimicrobial surveillance purposes. All suspected retreatment cases should be referred in any case to confirm the diagnosis in a secondary-/tertiary-level facility. For big countries such as India and Brazil, at least one sample collection health facility per district should be identified among all the secondary-/tertiary-level facilities that provide leprosy services be it a government or NGO facility. If necessary, training should be provided for laboratory technicians at district hospitals. The facility at district level should be selected randomly if more than one secondary-/tertiary-level centre is available. For countries with fewer cases, sample collection health facilities should be selected only in big administrative jurisdiction (state/province/region). For such countries, the selection of sample collection health facilites per state/province/region should be done randomly among the secondary-/tertiary-level centres available in that state/province/region. At each sample collection health facility, the appropriate forms should be filled in to accompany the shipment of samples; patient information should be recorded to allow communication of results and prescription of adequate treatment in case resistance is detected. The sample collection facilities should ask for written consent from each patient (or the parents in the case of a minor) after a brief information session on drug resistance in leprosy. If one of the health facility selected is an NGO institution/hospital (whether as a sample collection health facility or as testing laboratory), the National Leprosy Programme should develop an MoU to ensure access to services and reporting of information related to AMR. While the practical task of sample collection and shipment is a duty of each sample collection health facility, ensuring the regular shipment of samples for testing, recording and reporting of related information, and supervision to ensure that standard protocols are followed by all the facilities involved are duties of national leprosy programmes. A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update12 6.4 Calculation of sample size For each sample collection health facilities (a study site in a survey or a sentinel site in a surveillance model), a sample size calculation should be performed as per the formula given in Annex 7. For countries with no local baseline data on resistance, the sample size for each sample collection health facilities should be determined with the aim of testing at least 10% of the total new MB cases detected in the previous year. For all suspected retreatment cases, a system should be in place to ensure their referral to secondary-/tertiary-level facilities where their samples would be collected if confirmed to be retreatment cases, excluding transferred- in cases with no suspicion of resistance. 6.5 Systematic collection of samples For all cases that meet the inclusion criteria, skin smear sampling would be done with the patient’s consent according to the clinical practice and laboratory processing: • either two slit skin smear samples of the lesion with a BI ≥2+ should be taken, with the earlobe being the preferred sampling site together with the most prominent skin lesion; or • one skin biopsy (e.g. 4 mm punch biopsy) should be taken from a prominent lesion with a BI ≥2+. For new cases, the systematic (routine) collection of samples should continue at each sample collection site until the number of samples to be collected is reached, as defined in the sample size calculation (section 6.4) or until reaching a number corresponding to at least 10% of the MB cases detected in that district-/state-level facility in the previous year. Necessary patient consent must be obtained as per the ethical guidelines of the country. For patients below 18 years of age, parents’ consent should be sought. 6.5.1 Slit skin smear samples Slit skin smear samples are collected in the same manner as skin smears for BI examination, using a disposable stainless steel blade. Caution should be taken to prevent cross- contamination. The stainless steel blade containing the tissue scrapings should be rinsed into a 1.8 mL centrifuge tube (with screw cap) pre-filled with 1 mL of 70% ethanol (molecular biology grade absolute ethanol at 70% v/v + sterile deionized water from MilliQ or human A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update 13 injection quality 30% v/v, the mix being prepared in the laboratory), making sure that the tissue scrapings are washed from the surface of the blade and are suspended in the solution. This will mean that from each case, two slit skin smear samples would be collected and labelled according to national practice (some countries use the leprosy registration number). Slit skin samples are also kept on a Whatman® FTA® card. Make as small a smear of the sample as possible on the card. Both materials can be stored at room temperature. 6.5.2 Skin biopsy A skin biopsy is collected preferably using a punch of 4 mm for new cases. For retreatment cases, a surgical biopsy of 6 mm is preferred, especially if the BI is close to 2+. The biopsy is then placed in a 1.8 mL centrifuge sterile tube (with screw cap), pre-filled with 1 mL of 70% ethanol (molecular biology grade absolute ethanol at 70% v/v + sterile deionized water from MilliQ or human injection quality 30% v/v, the mix being prepared in the laboratory) as described above. If this cannot be prepared at the health facility, biopsies can stay in an empty 1.8 mL sterile centrifuge tube (with screw cap) without any preservatives. Samples can be kept at room temperature until they are sent to the laboratory, possibly in batches, depending on the cost of transportation and on the number of samples per month. Bacilli are rapidly inactivated, which means that samples can be sent by routine transport without the need to control the temperature during transportation, or take additional precautions for biohazard control. For cases in which molecular detection is negative (negative PCR results because of inhibition or a small amount of DNA), it might be necessary to collect additional samples from another lesion. This should be done after discussing with the testing laboratory and on a case-by-case basis. Fig. 2. Skin smear examination and centrifuge tube with 1 mL of 70% ethanol for collection of tissue specimens A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update14 Fig. 3. Skin punch biopsy sampling and tube for transportation (photo courtesy: Dr Beatrice Flageul) Personnel at the referral facility and sentinel sites should be trained in the proper collection of samples and transportation. 6.6 Laboratory tests Once the testing laboratory, whether national or international, receives the samples, the following steps would have to be undertaken: Amplification of drug resistance-determining regions of rpoB, folP1 and gyrA genes Each laboratory applies its own approved method. Sequencing of the amplified PCR products or hybridization with specific probes (the hybridization method can be applied in laboratories without sequencers. Reference laboratories are often using sequencers.) Distinction between wild-type sequence and verify the presence of amino acid substitution (mutation) Reporting of results A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update 15 M. leprae DNA present in skin samples are amplified by PCR and mutations sought by sequencing or hybridization, according to the technique used by the laboratory. Several methods – all showing good performance – can be used. Three techniques are presented as examples in Annex 6: an in-house PCR + sequencing protocol, a commercially available PCR+ hybriditation kit and whole-genome sequencing. In case of negative PCRs for the folP1, rpoB or gyrA genes, it is recommended to perform a PCR targeting another DNA sequence, such as M. leprae-specific repetitive element (RLEP) for amplification. This permits assessment for the presence of M. leprae DNA in the sample. Whatever the techniques used by the laboratory, it is mandatory to be able to detect mutations known to confer resistance (see Fig. 4 and Table 1). Further research will be needed to identify additional mutations that confer resistance. For this reason, part of the scope of the surveillance network is to create a global “bank” of detcted mutations to be managed by the Global Health Institute, Lausanne. From 1993 onwards, gene sequencing has been done for M. leprae strains known to be resistant in mouse footpad experiments and isolated from cases with treatment failure. This clearly showed that some missense mutations (mutations conferring an amino acid change) confer resistance to dapsone (mutation in the folP1 gene), rifampicin (mutation in the rpoB gene) and the quinolones (mutation in the gyrA gene). As these mutations are clustered within each respective gene, regions determining drug resistance were described as dapsone resistance-determining region (DRDR), rifampicin resistance-determining region (RRDR) and quinolone resistance-determining region (QRDR) (see Bibliography). The sequencing of the M. leprae genome has recently led to modification of the numbering system used previously. A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update16 Fig. 4. Nucleotide and amino acid sequences of the drug resistance-determining regions. The codons known to be most frequently involved in resistance are highlighted in rectangles. Rifampicin binds the β-subunit (encoded by the rpoB gene) of the RNA polymerase and certain mutations in the rpoB gene lead to rifampicin resistance in M. leprae and M. tuberculosis. Missense mutations leading to the substitution of any one of the following amino acids (positions 438, 441, 451, 456 and 458) or insertion of nucleotides between position 439 and 440 confers rifampicin resistance on M. leprae (Table 1). Mutations observed at other positions (from 432 to 437) should be reported with caution and discussed with a microbiologist from one of the four international reference laboratories. A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update 17 Table 1. Mutations within antileprosy drug target genes that confer resistance to Mycobacterium leprae Gene Amino acid substitution due to gene mutation Nucleotide change (5’ –> 3’) rpoB Gln438Val cag gtg Asp441Tyr gat tat Asp441Asn gat aat His451Asp cac gac His451Tyr cac tac Ser456Leu tcg ttg Ser456Met tcg atg Ser456Phe tcg ttc Ser456Trp tcg tgg Leu458Val ctg gtg Leu458Pro ctg ccg folP1 Thr53Ala acc gcc Thr53Arg acc agc Thr53Ile acc atc Pro55Arg ccc cgc Pro55Leu ccc ctc Pro55Ser ccc tcc gyrA Gly89Cys ggc tgc Ala91Val gca gta Note. Mutant amino acids in bold are high-frequency mutations for M. leprae associated with drug resistance. The numbering system is that of the M. leprae genome TN strain (GenBank AL583923; [1]) Missense mutations in the sulphone resistance-determining region of the folP1 gene (coding dihydropteroate synthase) and resulting in substitutions of amino acids at positions 53 and 55 confer dapsone resistance to M. leprae at an intermediate and high level in the mouse footpad assay. Correlation between ofloxacin resistance and missense mutation in the gyrA gene has been confirmed at positions 91 (Ala91Val) and 89 (Gly89Cys). Mutations involving codons 92 and 95 may be regarded as possibly conferring ofloxacin resistance according to the results of M. tuberculosis, but should be reported with caution and discussed with a microbiologist from one of the four international reference laboratories. A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update18 After the laboratory tests have been performed, to report on the results, refer to the flowchart below: Is the specific PCR for drug-resistance genes positive? If PCR is negative; check if the sample contains enough M. leprae DNA (by RLEP PCR or another specific PCR); if the PCRs are all negative, ask for another BI+ sample If PCR is positive, determine the sequence or hybridize with wild-type and mutated oligonucleotides – if no mutation: report as susceptible – if presence of mutation: – Is it a silent mutation? (it does not change the amino acid encoded) if yes, do not report – Is it a missense mutation? (it confers a change/substitution of amino acid) If yes, report the amino acid substitution with the numbering system as shown in Table 1. – Is it one of the substitutions that confer drug resistance in leprosy as described in Table1? If yes, report the strain as resistant. If no, discuss how to report it with the international reference laboratory. Send the laboratory report form to the referral facility and to the National Leprosy Programme Manager. A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update 19 6.7 Systematic recording of information The results of the testing will be utilized by the sample collection/study/sentinel site facility for appropriate patient management and by the National Leprosy Programme for appropriate monitoring. Therefore, the results of testing from the laboratory need to reach both the facility that is managing the patient and the National Leprosy Programme, to be entered into the National Leprosy Drug Resistance Register (Annex 2). In order to achieve this, standard clinical information forms have been developed to record data that will be sent to the reference laboratories and back to the health centres (Annexes 3, 4 and 5). At the end of treatment of cases detected with resistance, a copy of the patient chart should be sent to the National Leprosy Programme to allow recording of the treatment outcomes (Annex 5). The National Leprosy Programme will have to report to WHO annually on the following: (1) number of new MB cases tested, and number and proportion of resistant cases (to one drug and to more than one drug); (2) number of retreatment MB cases tested, and number and proportion of resistant cases (mono- and multi-resistant). The global data submission results in a publication on leprosy in the WHO Weekly epidemiological record, which from 2017 onwards will include data on drug resistance, in line with the importance this aspect has been given in the Global Leprosy Strategy 2016–2020. Globally, some countries are implementing an online platform to report and monitor AMR, which is called the Global Antimicrobial Resistance Surveillance System (GLASS). At the moment, GLP is exploring the possibility of integrating the drug-resistance data for leprosy into the online GLASS platform. For countries that count on a national public health/research institute and/or with collaborating centres for leprosy with adequate IT/public health tools, including human resources, the data collection and analysis could be done by such a centre on behalf of the National Leprosy Programme. However, even under such an arrangement, the ownership of and responsibility for monitoring trends in drug resistance remains with the National Leprosy Programme. 6.8 Monitoring antimicrobial resistance National leprosy programmes will have to monitor the trends over time of resistance among new and retreatment cases, along with monitoring the proportion of patients tested. The results of retreatment should be analysed by type of retreatment, while trying to identify A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update20 risk factors for resistance such as loss to follow up. Of particular concern would be a rising proportion of cases resistant to rifampicin, especially if these are among new cases, and whether the total new leprosy cases remain stable in number over time. It is suggested to duly compile the drug resistance register to be able to analyse data among different categories and monitor treatment outcomes. This would help to identify risk groups for resistance by age, sex, place of residence and/or socioeconomic factors, and category of patient (for instance, retreatment after loss to follow up), as well as risk factors for treatment failure. For countries with a high burden of leprosy, it is suggested that a national computerized database be established and periodically shared with the reference laboratory to identify more frequent mutations and possible transmission patterns through studies, including whole-genome sequencing done by the laboratory at the École Polytechnique Fédérale de Lausanne. Countries could also use the database as a tool to periodically conduct operational and scientific research to identify additional potential risk factors such as delay in diagnosis, treatment sought in the private sector, comorbidities, etc. Factors associated with treatment outcomes with second-line drugs could also be identified. A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update 21 (1) Adams LB, Job CK, Krahenbuhl JL. Role of inducible nitric oxide synthase in resistance to Mycobacterium leprae in mice. Infect Immun. 2000; 68: 5462–5. (2) Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence sata. Bioinformatics. 2014; 30: 2114-20. (3) Cambau E, Perani E, Guillemin I, Jamet P, Ji B. Multidrug-resistance to dapsone, rifampicin, and ofloxacin in Mycobacterium leprae. Lancet. 1997; 349: 103–4. (4) Cambau E, Bonnafous P, Perani E, Sougakoff W, Ji B, Jarlier V. Molecular detection of rifampin and ofloxacin resistance for patients who experience relapse of multibacillary leprosy. Clin Infect Dis. 2002; 34: 39–45. (5) Cambau E, Carthagena L, Chauffour A, Ji B, Jarlier V. Dihydropteroate synthase mutations in the folP1 gene predict dapsone resistance in relapsed cases of leprosy. Clin Infect Dis. 2006; 42: 238–41. (6) Cambau E, Chauffour-Nevejans A, Tejmar-Kolar L, Matsuoka M, Jarlier V. Detection of antibiotic resistance in leprosy using GenoType LepraeDR, a novel ready-to-use molecular test. PLoS Negl Trop Dis. 2012; 6(7): e1739. (7) Cole S, Eiglmeier K, Parkhill J, James K, Thomson N, Wheeler P et al. Massive gene decay in the leprosy bacillus. Nature. 2001; 409: 1007–11. (8) Gillis TP, Williams DL. Dapsone resistance does not appear to be associated with a mutation in the dihydropteroate synthase-2 gene of Mycobacterium leprae. Indian J Lepr. 1999; 71: 11–18. (9) Gillis TP, Williams DL. Dapsone resistance in Mycobacterium leprae. Lepr Rev. 2000; 71 (Suppl): S91–S95. (10) Ginsberg AM, Spigelman M. Challenges in tuberculosis drug research and development. Nat Med. 2007; 13 (3): 290–4. (11) Hirawati, Katoch K, Chauhan DS, Singh HB, Sharma VD, Singh M et al. Detection of M. leprae by reverse transcription PCR in biopsy specimens from leprosy cases: a preliminary study. J Commun Dis. 2006; 38: 280–7. (12) Honore N, Cole ST. Molecular basis of rifampin resistance in Mycobacterium leprae. Antimicrob Agents Chemother. 1993; 37: 414–18. (13) Honore N, Perani E, Telenti A, Grosset J, Cole ST. A simple and rapid technique for the detection of rifampin resistance in Mycobacterium leprae. 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Dihydropteroate synthase of Mycobacterium leprae and dapsone resistance. Antimicrob Agents Chemother. 2000; 44: 1530–7. (33) Williams DL, Pittman TL, Gillis TP, Matsuoka M, Kashiwabara Y. Simultaneous detection of Mycobacterium leprae and its susceptibility to dapsone using DNA heteroduplex analysis. J Clin Microbiol. 2001; 39(6): 2083–8. (34) Williams DL, Gillis TP. Molecular detection of drug resistance in Mycobacterium leprae. Lepr Rev. 2004; 75: 118–30. (35) de Wit MY, Faber WR, Krieg SR, Douglas JT, Lucas SB, Montreewasuwat N et al. Application of a polymerase chain reaction for the detection of Mycobacterium leprae in skin tissues. J Clin Microbiol. 1991; 29: 906–10. (36) Woods SA, Cole ST. A rapid method for the detection of potentially viable Mycobacterium leprae in human biopsies: a novel application of PCR. FEMS Microbiol Lett. 1989; 53(3): 305–9. (37) You EY, Kang TJ, Kim SK, Lee SB, Chae GT. Mutations in genes related to drug resistance in Mycobacterium leprae isolates from leprosy patients in Korea. J Infect. 2005; 50: 6–11. (38) Zhang L, Namisato M, Matsuoka M. A mutation at codon 516 in the rpoB gene of Mycobacterium leprae confers resistance to rifampin. Int J Lepr Other Mycobact Dis. 2004; 72: 468–72. A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update 23 WHO documents (1) Global Leprosy Strategy 2016–2020. “Accelerating towards a leprosy-free world”. New Delhi: World Health Organization Regional Office for South-East Asia; 2016. (2) Global Leprosy Strategy 2016–2020. “Accelerating towards a leprosy-free world” – Operational Manual. New Delhi: World Health Organization Regional Office for South-East Asia; 2016. (3) Global Leprosy Strategy 2016–2020 “Accelerating towards a leprosy-free world” – Monitoring and Evaluation Guide. New Delhi: World Health Organization Regional Office for South-East Asia; 2017. (4) World Health Organization. Global leprosy update, 2016: accelerating reduction of disease burden. Wkly Epidemiol Rec. 2017;35:501–19. (5) Resolution WHA67.25. Antimicrobial resistance. In: Sixty-seventh World Health Assembly, Geneva, 19–24 May 2014. Resolutions and Decisions, annexes. Geneva: World Health Organization; 2014 (WHASS1/2014WHA67/2014/REC/25). (6) Surveillance of drug resistance in leprosy: 2009. Wkly Epidemiol Rec. 2010;85(29):281–4. (7) Guidelines for global surveillance of drug resistance in leprosy. New Delhi: WHO Regional Office for South-East Asia; 2009 (http://www.searo.who.int/entity/leprosy/documents/SEA_GLP_2009_2/en/, accessed 6 July 2017). (8) Global action plan on antimicrobial resistance. Geneva: World Health Organization; 2015 (http://www. who.int/antimicrobial-resistance/global-action-plan/en/, accessed 6 July 2017). Other publications (1) Executive summary: Global antimicrobial resistance alerts and implications. Clin Infect Dis. 2005;41 (Suppl 4): S221–S3. A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update24 Annex 1 International reference laboratories National Reference Centre on Mycobacteria and Resistance to Anti-tuberculosis Drugs, Assistance publique-Hôpitaux de Paris (APHP) In-charge: Professor Emmanuelle Cambau Hôpital Lariboisière 2 rue Ambroise Paré 75010 Paris France Phone: +33-1-49956554; Fax: +33-1-49958537 Email: emmanuelle.cambau@aphp.fr Global Health Institute In-charge: Professor Stewart Cole École Polytechnique Fédérale de Lausanne Station No. 15 CH-1015 Lausanne Switzerland Phone: +41-919-6817760; Fax: +41-919-6817748 Email: stewart.cole@epfl.ch Leprosy Research Center Dr Yuji Miyamoto National Institute of Infectious Diseases 4-2-1 Aoba-cho, Higashimurayama-shi Tokyo 189-0002 Japan Phone: +81-42-3918211; Fax: +81-42-3949092 Email: yujim@niid.go.jp National Hansen’s Disease Programs Laboratory Research Branch In-charge: Dr Rahul Sharma Department of Health and Human Services Health Resource Administration, Health System Bureau, SVM-LSU, RM 3517W, Skip Bertonma Dr. Baton Rouge, LA 70803 United States of America Phone: +1-225-5789839; Fax: +1-225-5789856 Email: Sharma, Rahul (HRSA) <RSharma1@hrsa.gov> Annexes A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update 25 Annex 2 National leprosy drug resistance register Name Surname Leprosy register number Type of patient (new/ retreatment) Type of retreatment Date of start of MDT treatment Name & location Treating Facility Date of sample collection Name & Location Facility collecting the sample Skin site of sample collection BI index slit skin smear in national lab Results of national lab Results PCR of national lab Results PCR reference lab Results seq Rifampicin national lab Results Seq Rifampicin reference lab Results seq Dapsone national lab Results Seq Dapsone reference lab Results Seq Ofloxacine national lab Results Seq Ofloxacine reference lab Results Seq Ofloxacine reference lab Treatment regimen (for drug- resistant cases) Start of treatment (for drug-resistant cases) End of treatment (for drug- resistant cases) Treatment Outcomes Remarks A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update26 Annex 3 Form 1. Clinical report form for MB leprosy cases to be tested for drug resistance I. Reporting details Leprosy register number: _________________________________ Name of country: _______________________________________ Type of facility reporting: PHC/other: name and address: _________________________________ Sentinel site: name and address: ________________________________ Date of report (DD/MM/YYYY): ____/____/_______ Date of specimen collection (DD/MM/YYYY): ____/____/_______ II. Demographics and medical history of the case Date of birth: _____________ Sex: M / F Patient citizenship or residence: ___________________ Country of origin: _______________________________ Patient consent to participate: Yes / No (If no, skip following steps) Chemoprophylaxis: Yes / No If yes, which drug was given: __________________________ Previous TB treatment: Yes / No Previous treatment with ofloxacin or other quinolones for longer than one month: Yes / No III. Case classification New Retreatment: Retreatment after loss to follow up Relapse Transferred in Other retreatment A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update 27 IV. Treatment history (for retreatment cases only) Treated with MDT, year: Treated with rifampicin, dapsone, clofazimine (not in MDT package), year: Treated with other medications: specify V. Clinical presentation at time of referral for testing for resistance Clinical features: ___________________________________________________ ___________________________________________________________________ Number of skin lesions: ___________ Skin smear results from specific sites (if any, along with the date of test): 1. Site: _____________ BI: ________ Date of smear: ___/___/______ 2. Site: _____________ BI: ________ Date of smear: ___/___/______ 3. Site: _____________ BI: ________ Date of smear: ___/___/______ Disease classification : A: (MB/PB) B: Ridley–Jopling – (BB/BT/TT/BL/LL) VI. Type of sample Biopsy, number of samples: ____________ Site of collection: ____________ Skin smear, number of samples: _________ Site of collection: ____________ A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update28 Annex 4 Form 2. Report of the testing laboratory Name of testing laboratory: ______________________________________________ _______________________________________________________________________ Address: _______________________________________________________________ _______________________________________________________________________ Telephone: Fax: Email: ___________________ Case identification Case leprosy register number: Case initials: Age: Sex: Name of institute sending specimen _______________________________________________________________________ Address: ________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ Telephone: __________________ Fax: ______________ Email: _____________________________________________ Type of case: New Retreatment Date of acceptance: _____/_____/________ (dd/mm/yy) A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update 29 Type of specimen received: slit-skin smear biopsy (Circle both if more than one type of sample is received) Sequencing results rpoB gene Negative PCR (other PCR tested: __________________) No mutation (do not report silent mutation) Presence of a mutation known to confer drug resistance nucleotide mutation (X to Y at nucleotide Z*) ____________________ amino acid substitution (A to B at position C*) : __________________ Presence of another mutation (A to B at position C*) folP1 gene Negative PCR (other PCR tested: __________________) No mutation (do not report silent mutation) Presence of a mutation known to confer drug resistance nucleotide mutation (X to Y at nucleotide Z*) ____________________ amino acid substitution (A to B at position C*) : __________________ Presence of another mutation (X to Y at position Z*) gyrA gene Negative PCR (other PCR tested: __________________) No mutation (do not report silent mutation) Presence of a mutation known to confer drug resistance nucleotide mutation (X to Y at nucleotide Z*) ____________________ amino acid substitution (A to B at position C*) : __________________ Presence of another mutation (X to Y at position Z*) *numbering system of M. leprae genome strain TN (NCBT accession number AL4550380.1) A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update30 Name of corresponding biologist (and signature) Signature Date of reporting: ___/___/________ (dd/mm/yy) Note: The presence or absence of mutations known to confer drug resistance should be reported as: • “no mutation known to confer resistance” if these mutations are not found and the sequence brings up wild-type codons; • “presence of mutations known to confer resistance” if at least one of these mutations is observed. The substitution (e.g. Ser456Leu) should be stated on the basis of the numbering system of the M. leprae genome from the TN strain (see Table 1 and Fig. 4); • “another missense mutation”: this could be a new mutation or a previously described mutation but not known to confer resistance. The mutation should be written with regard to the substitution (e.g. Lys411Asn), with the nucleotide change in brackets (e.g. aaa to aac) on the basis of the numbering system of the M. leprae genome from the TN strain (see Fig. 4). Corresponding DNA sequences and data concerning the description of new mutations will be also sent to a common database located at Ecole Polytechnique Federale de Lausanne; • do not report silent mutations, i.e. mutations that do not change the amino acid. A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update 31 Annex 5 Reporting form for treatment outcomes of resistant cases Reporting details • Leprosy register number: ______________ • Initials/ sex: M / F /age (in numbers) • Type of case: New Retreatment (type of retreatment) • Date of report:__ / __ / ____ (dd/mm/yy) • Date of treatment completion:__ / __ / ____ (dd/mm/yy) Type of resistance • Rifampicin alone • Dapsone alone • Ofloxacin alone • Rifampicin + dapsone • Rifampicin + dapsone + ofloxacin • Rifampicin + ofloxacin • Dapsone + ofloxacin Treatment prescribed by: Dr: ______________________________ Name of facility: ________________________ Treatment regimen prescribed • MB-MDT Option A: 400 mg of ofloxacin + 100 mg of minocycline + 50 mg of clofazimine, daily for 6 months followed by 400 mg of ofloxacin + 50 mg of clofazimine for 18 months daily or Option B: 400 mg of ofloxacin + 100 mg of minocycline + 50 mg of clofazimine, daily for 6 months followed by 100 mg of minocycline + 50 mg of clofazimine daily for 18 months • Other treatment (Specify): _____________________________________________ Treatment outcomes • Treatment completed • Died • Lost to follow up • Transferred out • Unsatisfactory response to treatment A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update32 Annex 6 Laboratory protocols 1. DNA extraction Protocol A for skin slit smear samples: lysis buffer method (adapted from de Wit 1991; J Clin Microbiol. 1991; 29: 906–10) • Centrifuge for 10–20 min at max speed (should be more than 15 000 x g). • Discard the supernatant. Resuspend the precipitate in phosphate buffered saline (PBS). Allow to stand for more than 30 min before suspending in PBS. • Centrifuge for 10–20 min at max speed. • Resuspend the sediment in 50 µL of lysis buffer*. Overlay mineral oil to prevent evaporation of the buffer. • Incubate overnight at 60 °C. • Heat for 10 min at 97 °C to inactivate proteinase K. • Transfer to a DNA low-binding tube such as Eppendorf product DNA LoBind. *Lysis buffer Stock solution I: proteinase K 1 mg/mL in 100 mM Tris-HCl, pH 8.5 Stock solution II: 0.5% Tween 20 Mix 1 volume of stock I and 1 volume of stock II Dilute 5 times with 100 mM Tris-HCl, pH. 8.5 or distilled water Usually 100 µL of stock solution I and II are mixed with 800 µL of 100 mM Tris- HCl, pH 8.5 or distilled water. Protocol B for biopsy sample: freeze–boiling method (adapted from Woods 1989) • If stored in 70% ethanol, place the tubes open under a safety hood for the ethanol to evaporate, until the biopsy is dry (24–48 h). • Mince the skin biopsy and grind it with glass beads to obtain a biopsy suspension in Hanks solution or another buffer/sterile water. A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update 33 • After inactivation at 95°C for 30 min, DNA is extracted as follows: 200 µL of the biopsy suspension is subjected to five series of heat–cold shocks, alternately boiling (1 min at 100°C) and freezing (1 min in dry ice) it. Then incubate at 95°C for 15 min followed by immersion in an ultrasonic bath (Branson) for 15 min if possible. Protocol C for FTA card sample • Remove one 3 mm sample disk from the centre of the smear using a biopsy punch. • Transfer into a 1.5 mL tube. • Add 500 µL of sterile H2O to the tube and immediately pulse vortex 3 times, for a total of 5 seconds. • Using a sterile technique, immediately transfer the disc to a 0.5 mL microfuge tube containing 30 µL of sterile H2O. Ensure that the disc is completely immersed in the H2O by briefly centrifuging the tube for 10 seconds. • Transfer the tube to a heating block at 95 °C for 15–30 min. • At the end of the incubation period, remove the sample from the block and pulse vortex, or gently tap the sample approximately 60 times. Protocol D for slit-skin sample by DNeasy blood and tissue (Qiagen) • Slit-skin samples suspended in 70% ethanol by centrifugation for 10–20 min at max speed (should be more than 15 000 x g). • Discard the supernatant. Resuspend the precipitate in 500 µL of PBS. Allow to stand for more than 30 min and replace ethanol with PBS. • Centrifuge for 10–20 min at max speed. • Suspend a sample pellet in 180 µL of enzymatic lysis buffer. • Incubate for at least 30 min at 37 °C. • Add 25 µL proteinase K and 200 µL of buffer AL (without ethanol). Mix by vortexing. Incubate at 56 °C for 30 min. • Add 200 µL of ethanol (96–100%) to the sample, and mix thoroughly by vortexing. • Pipette the mixture into the DNeasy minispin column placed in a 2 mL collection tube. Centrifuge at >6000 x g for 1 min. Discard the flow-through and collection tube. A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update34 • Place the DNeasy minispin column in a new 2 mL collection tube, add 500 µL buffer AW1, and centrifuge for 1 min at >6000 x g for 1 min. Discard the flow- through and collection tube. • Place the DNeasy minispin column in a new 2 mL collection tube, add 500 µL buffer AW2, and centrifuge for 3 min at 20 000 x g to dry the DNeasy membrane. Discard the flow-through and collection tube. • Place the DNeasy minispin column in a clean 1.5 mL or 2 mL microcentrifuge tube, and pipette 200 µL buffer AE directly onto the DNeasy membrane. Incubate at room temperature for 1 min, and then centrifuge for 1 min at >6000 x g to elute. 2. PCR sequencing (a) In-house protocol for PCR sequencing PCR mixture: 12.5 µL PCR master mix (2X) 0.5 µL Taq polymerase 1.25 µL forward primer at a final concentration 0.5 µM 1.25 µL reverse primer at a final concentration 0.5 µM 5.0–7.5 µL water to final volume 25 µL 2.5–5.0 µL template DNA Thermal cycle: Denature at 95 °C for 30 s Denature at 95 °C for 15 s Anneal at 57 °C for 15 s 40 cycles Extend at 72 °C for 60 s Final extension at 72 °C for 7 min A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update 35 Source: Guidelines for global surveillance of drug resistance in leprosy. New Delhi; WHO Regional Office for South-East Asia, 2009 (Drawn by Dr M. Matsuoka) A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update36 In-house sequencing reaction protocol Mix for PCR sequencing reaction 1–3 µL (1–3 ng of 100–200 bp) purified PCR products 20 µL distilled water add up to the total volume 4 µL Bigdye terminator Ver 1.1 2µL 5XSEQ buffer 1 µL 3.3 M primer (same primer used for PCR is diluted 6X) Thermal cycle reaction Cycle 1: 96 °C for 30 s Cycle 2: 96 °C for 10 s Cycle 3: 50 °C for 10 s Cycle 4: 60 °C for 3 min Repeat cycle 2–4 25 times Purification of sequencing reaction products (e.g. by Performa DTR gel filtration cartridge) Preparation of samples for sequencing. Add 25 µL of HI reagents (Applied Biosystems) to the sample tubes to resolve the dried sequencing products. Vortex thoroughly and spin down. Transfer sample to sample tubes for sequencing. Heat for 2 min at 95 °C then chill quickly in ice water; spin down. Ready to apply to sequencer after resuspension in loading buffer. b) Standardized commercial kit GenoType LepraeDR v1.0 for PCR sequencing (manufactured by Hain Lifesciences, http://www.hain- lifescience.de/en/) After DNA extraction (see protocols above), the procedure is a multiplex amplification of drug resistance-determining regions (DRDRs) in rpoB, folP1 and gyrA with biotinylated primers followed by a reverse hybridization (DNA strip test using PCR amplification (line probe assay). The kit contains all reagents for multiplex PCR and hybridization, including internal quality controls, but the thermostable HotstartTaq DNA polymerase needs to be provided separately. The primer nucleotide mix (PNM) contains biotinylated primers for the amplification of specific regions of the bacterial genome. The membrane strips are coated with specific probes complementary to the amplified nucleic acids. After chemical denaturation, the A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update 37 single-stranded amplicons bind to the probes (hybridization). Highly specific binding of complementary DNA strands is ensured by stringent conditions that result from the combination of buffer composition and a certain temperature. Thus, the probes reliably discriminate several sequence variations in the gene regions examined. The streptavidin- conjugated alkaline phosphatase binds to the amplicons’ biotin via the streptavidin moiety. Finally, the alkaline phosphatase transforms an added substrate into a dye, which becomes visible on the membrane strips as a coloured precipitate. A template ensures the easy and fast interpretation of the banding pattern obtained. Each DNA strip includes five control zones: • a conjugate control zone (CC) to check the binding of the conjugate on the strip and a correct chromogenic reaction • a universal control zone (UC) that detects, as far as is known, all mycobacteria and members of the group of Gram-positive bacteria with a high G+C content • three locus control zones (rpoB, gyrA and folP1) that check the optimal sensitivity of the reaction for each of the tested gene loci. Fig. 5. DNA strip of the kit GenoType LepraeDR. (A) Scheme of the strip. (B) Examples of DNA strips (A) Scheme of the strip and details of probes A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update38 A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update 39 (B) Examples of DNA strips c) Whole-genome sequencing to find drug-resistance mutations For sequencing purposes, DNA can be extracted from human skin biopsies of known BI using the following customized protocol that removes most of the host DNA, followed by lysis of the bacteria and purification of M. leprae DNA on silica columns. Punch biopsies (6 mm) in 70% ethanol are first rehydrated in 500 µL of Hank’s balanced solution and then minced finely with scissors or disrupted by bead beating using 2.8 mm zirconium beads (Bertin Technology, France). Each extraction run could include a batch of 5–9 samples and one blank control. To digest human skin and tissue, the sample is incubated with a mixture of 0.5 U of collagenase and dispase (Roche, Switzerland) for 30 min at 37 °C; released cells are collected in a separate tube and the remaining tissue is digested by incubation with trypsin in PBS (10 mg/mL) at 56 °C until complete digestion. Released cells are pooled and centrifuged for 10 min at 10 000 g prior to resuspension in 1 mL of PBS. Cells are lysed with 500 µL of AHL buffer (QIAmp microbiome kit, Qiagen) for 30 min at room temperature with end-over-end rotation. The mixture is then centrifuged for 10 min at 10 000 g and resuspended in 190 µL of RDD buffer. Then 2.5 µL of benzonase is added to remove the host DNA (QIAmp microbiome kit, Qiagen) by incubating at 37 °C for 30 min. Next, the mixture is treated with proteinase K (20 mg/mL) at 56 °C for 30 min to inactivate the DNAase. Bacterial cells are then lysed mechanically by bead beating and enzymatically using proteinase K treatment (20 mg/mL) according to the manufacturer’s recommendations prior to DNA purification on silica-based columns (QIAmp microbiome kit, Qiagen). A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update40 Next, DNA samples are sonicated to obtain 400 bp fragments using an S220 Covaris instrument. Illumina libraries are prepared using the Kapa Hyper Prep kit (Kapa Biosystem, MA, USA) and PentAdpters (Pentabases, Denmark) or Illumina indexed adapters. Fragments are selected before amplification using AMPUre beads with a ratio of 0.5X for the first and 0.2X for the second selection. The concentration of indexed adapters and the number of amplification cycles are adapted with respect to the initial DNA concentration according to the manufacturer’s instructions (Kapa Biosystem, MA, USA). After quality control (library concentration and size are determined using a fragment analyser), libraries may be multiplexed and sequenced as 100 base single-end reads on an Illumina HiSeq 2500 instrument (https://www.illumina.com). Raw reads are then adapter- and quality-trimmed using Trimmomatic v0.33 (Bolger et al. 2014) and mapped onto the M. leprae TN reference genome (NCBI accession number AL450380.1) with Bowtie2 (version 2.2.5; Langmead and Salzberg 2012) followed by variant calling using VarScan v2,3,9 (Koboldt et al. 2012) or other mapping programs. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) can be called after applying quality checks, i.e. a minimum overall coverage of five non-duplicated reads, a minimum of three non-duplicated reads supporting the SNP, a mapping quality score >8, a base quality score >15 and an SNP frequency over 80%. These cut-offs are chosen to avoid false positive results. A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update 41 Annex 7 Sentinel surveillance protocol Sample size calculation. The sample size (n) will be calculated on the basis of the expected level of resistance as per the formula and related explanations below: n where: N = annual average number of new MB leprosy cases registered at the sentinel site in the past five years Z = z-value (from the standard normal distribution) that corresponds to the desired confidence level (narrowing the confidence interval from 95% to 90% will result in some reductions in sample size; if confidence interval is 95%, then z=1.96 and at 90%, z=1.65); d = absolute precision (as a decimal 0.01 or 0.02, meaning an error within 1% or 2% of the true proportion); g = previous estimate of the proportion of new cases with rifampicin resistance x (1 + anticipated change in previous estimate). The anticipated change can be considered as the change that the sentinel system should be able to detect. This change is expressed as a decimal, with a negative prefix (–) if a decrease is anticipated and a positive prefix (+) if an increase is anticipated. For example, a 4% increase from the previous estimate would be expressed as an anticipated change of +0.04; thus g = earlier estimate x (1 + 0.04) = earlier estimate x 1.04. Similarly, if a reduction of 10% is anticipated from the previous resistance level in the current year, then g = earlier estimate x (1–0.04) or g = earlier estimate x (0.96). It is suggested to double the sample size calculated with the formula. This is done to neutralize the design effect and increase the precision of the sampling scheme (a sample size big enough to detect anticipated changes on a larger scale, considering the uncertainty of the baseline level of resistance and the lack of known trend in the majority of countries). For countries in which the baseline level of resistance is not known at all, 10% of the total new MB leprosy cases detected per year will be tested either in a national or international laboratory. A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update42 Sample selection. After fixing the sample size, the next issue is how to select the sample from the new MB cases. The first step to be taken is to identify the number of endemic districts the sentinel sites serve, and then allocate the number of samples to be selected from each of those districts according to the average number of new MB cases registered in the past five years. After calculating the number of samples to be drawn from each endemic district, samples should be selected by the systematic scheme. A step-by-step guide is given below: • Suppose the above-mentioned formula returned a sample size of 20; then, after increasing the sample size say by 50%, i.e. 50% of 20 = 10, the total sample size will be 20 + 10 = 30. • Further, suppose the sentinel site covers two districts only, A and B, with an average number of new MB cases of 150 and 250 (37.5% and 62.5% of total MB cases), respectively. Now, a total of 30 samples need to be distributed among these two districts proportional to their average number of new MB cases. This implies that from district A, 11 samples need to be tested whereas from district B, 19 samples need to be tested. • To draw a circular systematic sample from district A, we have to find out the nearest integer k, which can be obtained as below: k = 150 = -------- 11 = 13.66 = 14 (approximately) • Now, select a random number between 1 and 14. Say it is 12; then select every twelfth patient from the list of registered new MB patients in the current year and this will be your first sample from district A; now, select the second sample by adding k (14) to it, i.e. 12 +14 =26, patient serial number 26 will be the second and patient serial number 40 will be the third sample. Similarly, patient serial number 124 will be the ninth and serial number 138 will be the tenth sample. However, now 138 + 14= 152, and there are only 150 patients. Then the eleventh sample will be 152 – 150 =2, i.e. the patient with serial number 2 in the beginning will be the eleventh sample. In the same way, a sample for district B can be drawn. Another pictorial example of a circular systematic sampling scheme is given with N = 14 and n = 5. Then k = nearest integer. Let the first number selected at random from 1 to A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update 43 14 be 7. Then, the circular systematic sample consists of units with serial numbers 7, 10, 13, 16 – 14 = 2, 19 – 14 = 5. Please note that the conclusion drawn about resistance relates only to the areas the sentinel site is covering. A guide for surveillance of antimicrobial resistance in leprosy: 2017 update44 Annex 8 Clinical management of resistant cases detected All cases included in the surveillance should immediately be put on treatment with standard multidrug therapy (MDT) right after sample collection without waiting for the results from the reference laboratory on the status of drug resistance. While GLP is in the process of preparing the guidelines on leprosy treatment, including for resistant cases, to date, the only guidance on treatment of resistant cases can be found in the report of the Eighth meeting of the Expert Committee for Leprosy held in Geneva in 2010. As per the report, the following is a guidance on the possible clinical management of resistant cases. • If the results show a sensitive strain, MB-MDT treatment is to be continued. • For patients who are reported to be resistant to dapsone only, standard MB-MDT can be continued, but the patient should be followed at the end of treatment and regularly examined for possible relapse. • For patients with resistance only to quinolones, MDT should be continued. • In case the reference laboratory reports rifampicin-resistant M. leprae, one of the following treatment regimens should be prescribed: 400 mg ofloxacin + 100 mg minocycline + 50 mg clofazimine, daily for 6 months; followed by 400 mg ofloxacin OR 100 mg minocycline + 50 mg clofazimine daily for an additional 18 months. The above-mentioned treatment regimen is mandatory for patients harbouring both rifampicin- and dapsone-resistant M. leprae. For cases resistant to rifampicin but susceptible to dapsone, the above treatment regimen is also suggested. Alternatively, a treatment regimen that includes dapsone might be discussed with the national referral centre. It is compulsory to report treatment outcomes of leprosy patients detected with drug-resistant through the form in Annex 5 (either as in hard copy or electronically) and to send it to the National Leprosy Programme so that the information can be entered in the drug resistance register.
Um guia para vigilância de resistência antimicrobiana na hanseníase Atualização 2017 Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 2017 ISBN: 978 92 9022 644 4 © Organização Mundial da Saúde 2017 Alguns direitos reservados. Este trabalho está disponível sob os termos da Creative Commons Atribuição-Não Comercial- Compartilha Igual 3.0 IGO licença (CC BY-NC-SA 3.0 IGO; https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/igo). Sob os termos desta licença, você pode copiar, redistribuir e adaptar o trabalho para fins não comerciais, desde que o trabalho seja adequadamente citado, conforme indicado abaixo. Em qualquer uso deste trabalho, não deve haver sugestão de que a OMS endossa qualquer organização, produtos ou serviços específicos. O uso do logotipo da OMS não é permitido. No caso de adaptação do trabalho, ele deverá ser licenciado sob a mesma licença ou equivalente à Creative Commons. 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A menção de empresas específicas ou de determinados produtos de fabricantes não implica que sejam endossados ou recomendados pela OMS em detrimento de outros de natureza similar que não são mencionados. Com exceção de erros e omissões, os nomes de produtos proprietários são diferenciados por letras maiúsculas iniciais. Todas as precauções razoáveis foram tomadas pela OMS para verificar as informações contidas nesta publicação. No entanto, o material publicado está sendo distribuído sem garantia de qualquer tipo, expressa ou implícita. A responsabilidade pela interpretação e uso do material é do leitor. Em nenhum caso, a OMS será responsável por danos decorrentes de seu uso. Fotos de capa: Masanori Matsuoka Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 2017 iii Índice Lista de colaboradores ................................................................................................... iv Abreviaturas .................................................................................................................... v Sumário executivo ......................................................................................................... vi 1. Objetivos e público alvo ........................................................................................1 2. Histórico ................................................................................................................2 3. Fundamentos para o desenvolvimento do guia .......................................................3 4. Panorama da Estratégia Global para Hanseníase 2016–2020 ..................................4 5. Visâo geral do sistema de vigilância sobre resistência antimicrobiana na hanseníase ................................................................................5 5.1 Objetivos ......................................................................................................5 5.2 Definições ....................................................................................................5 5.3 Resistência nos casos novos ...........................................................................6 5.4 Resistência entre casos de retratamento ........................................................7 5.5 Esquema para vigilância de RAM na hanseníase ............................................8 6. Estabelecer elou expander um sistema de vigilância a nivel nacional ......................9 6.1 Seleção dos laboratórios................................................................................9 6.2 Seleção de laboratórios para fins de controle de qualidade .........................10 6.3 Identificação dos estabelecimentos para coleta de amostras ........................11 6.4 Cálculo do tamanho da amostra ..................................................................12 6.5 Coleta sistemática de amostras ....................................................................12 6.6 Testes laboratoriais ......................................................................................15 6.7 Registro sistemático de informações ............................................................19 6.8 Monitoramento de resistência antimicrobiana .............................................20 Bibliografia ...................................................................................................................21 Anexos 1. Laboratórios de referência internacional...............................................................24 2. Registro nacional de resistência às drogas de hanseníase ......................................25 3. Formulário1. Formulário de relatório clínico para casos de hanseníase MB a serem testados para resistência às drogas ....................................................26 4. Formulário 2. Relatório do laboratório de testes ..................................................28 5. Formulário de relatório para resultados de tratamento de casos resistentes ...........31 6. Protocolos Laboratoriais .......................................................................................32 7. Protocolo de vigilância sentinela ..........................................................................41 8. Manejo clínico de casos resistentes detectados .....................................................44 Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 2017iv Este guia foi preparado pelo Professor Emmanuelle Cambau, Universidade de Paris Diderot, França; Dra. Laura Gillini (Programa Global de Hanseníase); Dr. Masanori Matsuoka, Museu Nacional de Hanseníase de Jukanbo, Japão. Outros colaboradores : Dr. Bertrand Cauchoix, Fondation Raoul Follereau, Paris, França Professor Stewart Cole, Escola Politécnica Federal de Lausane, Suíça Dr. Erwin Cooreman, Programa Global de Hanseníase, Escritório Regional da OMS para o Sudeste Asiático, Nova Delhi, Índia Dr. Anil Kumar, Programa Nacional de Erradicação da Lepra (National Leprosy Eradication Programme, NLEP), Nova Delhi, Índia Dr. VRR Pemmaraju, Programa Global de Hanseníase, Escritório Regional da OMS para o Sudeste Asiático, Nova Delhi, Índia Dr. Rupali Roy, Programa Nacional de Erradicação da Lepra (NLEP), Nova Delhi, Índia Dr. Paul Saunderson, Missões Americanas de Lepra, Noruega Dr. David Scollard, Programa Nacional de Doenças de Hansen, Baton Rouge, EUA Dr. Sirenda Vong, Departamento de Informação de Emergências de Saúde e Avaliação de Risco, Escritório Regional da OMS para o Sudeste Asiático, Nova Delhi, Índia Professor Aditama Tjandra Yoga, Assessor Especial do Diretor Regional, Escritório Regional da OMS para o Sudeste Asiático, Nova Delhi, Índia Mr. Rakesh Mani Rastogi, Desenvolvimento de Sistemas de Saúde, Escritório Regional da OMS para o Sudeste Asiático, Nova Delhi, Índia A versão final do documento foi revisada após um workshop realizado em Hyderabad, Índia, nos dias 10 e 11 de agosto de 2017, para discutir um modelo de resistência antimicrobiana na hanseníase na Índia. Este workshop contou com a presença do pessoal do Programa Nacional de Hanseníase, incluindo coordenadores estaduais e distritais de hanseníase, funcionários da OMS, especialistas do Instituto Jalma de Hanseníase e Outras Doenças Micobacterianas (Agra), Fundação para Pesquisa Médica (Mumbai), funcionários dos departamentos de dermatologia de hospitais de nível terciário e representantes de ONGs (A Missâo de Lepra, Alívio da Lepra. Missões Americanas de Lepra) que levaram em consideração os desafios e as abordagens discutidas com os representantes dos países. Lista de colaboradores Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 2017 v AITA Associação Internacional de Transporte Aéreo DTNs Doenças Tropicais Negligenciadas EERBH Elemento específico repetitivo do bacilo de Hansen IB Índice bacilar MB Multibacilar MDE Memorando de entendimento OMS Organização Mundial da Saúde ONG Organização Não Governamental PB Paucibacilar PBS Tampão fosfato-salino PCR Reação em cadeia da polimerase PGH Programa Global de Hanseníase PQT Tratamento Poliquimioterapia RAM Resistência antimicrobiana RRDQ Região de resistência determinada à quinolona RRDR Região de resistência determinada à rifampicina RRDS Região de resistência determinada à dapsona SGVA Sistema Global de Vigilância Antimicrobiana TB Tuberculose Abreviaturas Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 2017vi O surgimento de resistência às drogas é uma preocupação e uma ameaça a muitos programas de intervenção de doenças infecciosas, especialmente aqueles que têm prevenção secundária (quimioterapia) como o principal componente de sua estratégia de controle. A luta contra a hanseníase tem sido um grande sucesso, em grande parte devido ao desenvolvimento da poliquimioterapia (PQT) em 1981. A implantação da PQT no final da década de 1980 foi um fator importante para reduzir drasticamente o ônus da hanseníase até o ano 2005, logo após foi observada uma estabilização no número de casos em tratamento e uma redução, porém mais lenta na notificação. Como a rifampicina é o carro-chefe do regime de PQT, é importante monitorar o surgimento de bacilos resistentes à rifampicina, já que relatórios e publicações recentes indicaram a existência de resistência à rifampicina em várias áreas endêmicas. Antes da introdução da PQT, os pacientes eram tratados com monoterapia com dapsona por vários anos. A resistência à dapsona tem sido relatada desde o início dos anos 60. Em caso de resistência à rifampicina, as fluoroquinolonas passam a ser a categoria preferida de drogas de segunda linha. Infelizmente, os bacilos de Hansen resistentes às quinolonas também foram relatados em vários países, provavelmente devido ao uso extensivo de quinolona para tratar vários tipos de infecções. A resistência à clofazimina ainda é rara, mas este antimicrobiano não pode ser administrado isoladamente. Para enfrentar o desafio de conter a doença e ter a capacidade de responder a um aumento na circulação de bacilos resistentes às drogas, é essencial avaliar os padrões de sensibilidade às drogas em todo o mundo, bem como monitorar a resistência entre os casos novos e de retratamento. Sumário executivo Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 2017 1 Este documento tem como objetivo orientar os países sobre como testar a resistência a drogas na hanseníase. Ele destaca os sistemas de apoio clínico de campo laboratoriais que necessitam ser implantados para empreender essa atividade. A resistência antimicrobiana (RAM) é uma das áreas chave de intervenção da Estratégia Global para Hanseníase 2016- 2020, sob seu Pilar II “Combater a hanseníase e suas complicações ”. Sob esta estratégia, espera-se que todos os países que detectam a hanseníase criem um sistema para permitir o teste da RAM, seja em um laboratório nacional ou em um laboratório localizado no exterior. Este guia visa promover o uso de uma dupla abordagem padronizada: (1) para detectar a resistência primária e secundária a drogas anti-hansênicas, ou seja, a rifampicina, dapsona e ofloxacina; (2) padronizar os relatórios relacionados aos resultados dos testes e do tratamento realizados. A disponibilidade de dados sobre a resistência as drogas na hanseníase permitirá o monitoramento global, nacional e subnacional das tendências de resistência às drogas ao longo do tempo entre casos novos e de retratamento da hanseníase (ver definições na Seção 5.2). Também ajudará a identificar fatores de risco para resistência às drogas (idade, sexo, área de residência, categoria / tipo de paciente). O público-alvo do guia atualizado é formado por gestores de programas nacionais de hanseníase, clínicos e funcionários de centros de referência e coordenadores de laboratórios e técnicos em hanseníase, além de consultores que atuam no campo da hanseníase e de doenças tropicais negligenciadas (DTNs). Objetivos e público alvo 1 Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 20172 A rede atual de vigilância de resistência às drogas foi implementada conjuntamente pela Organização Mundial da Saúde (OMS) e a Fundação Nippon, apoiada nos últimos anos pelo financiamento da Federação Internacional das Associações Anti-Hanseníase (ILEP) entre 2008 e 2016. Os países que participaram da rede de vigilância sentinela foram: Benim, Brasil, Burquina Fasso, China, Colômbia, Etiópia, Filipinas, Guiné, Iêmen, Índia, Indonésia, Madagascar, Mali, Mianmar, Moçambique, Nepal, Níger, Paquistão e Vietnã. Em 2016 o Sri Lanka começou a testar amostras. Os países que fazem parte da rede testam amostras em laboratórios nacionais, como é o caso do Brasil (três laboratórios de testes), China, Colômbia, Índia (quatro laboratórios de testes), Indonésia e Nepal; ou enviam amostras para os quatro seguintes laboratórios: Laboratório Nacional de Pesquisa do Programa de Doença de Hansen, Baton Rouge, Louisiana, Estados Unidos da América (EUA); Instituto Global de Saúde, Escola Politécnica Federal de Lausane, Suíça; Centro Nacional de Referência sobre Micobactérias e Resistência a Medicamentos Anti-Tuberculose, Hospital Lariboisière, Paris, França; Centro de Pesquisas sobre Hanseníase, Instituto Nacional de Doenças Infecciosas, Tokio, Japão. Estes são considerados laboratórios internacionais de referência para a RAM na hanseníase. Os laboratórios de referência que fazem parte da rede em 2017 estão listados no Anexo 1. Alguns dos laboratórios nacionais estão localizados em hospitais eou em instituições governamentais, enquanto outros estão localizados em hospitais administrados por organizações não-governamentais (ONGs). O apoio da OMS / ILEP aos laboratórios consiste em fornecer financiamento para alguns dos laboratórios internacionais (Lausane e Paris) e financiar uma reunião semestral organizada pela OMS para discutir os resultados e os métodos laboratoriais. O custo para testes ao nível nacional é pago por governos nacionais ou ONGs internacionais. A rede tornou-se funcional em 2008, após identificação de mutações associadas à resistência às drogas em locigenômicos específicos do bacilo de Hansen, conferindo resistência à dapsona, rifampicina e ofloxacina. Inicialmente, o teste foi recomendado apenas para casos de recidiva para avaliar o nível de resistência secundária e os resultados correspondentes foram publicados no registro epidemiológico semanal (a publicação mais recente foi em junho de 2011: Wkly Epidemiol Rec. 2011; 23 (86): 2334). As primeiras diretrizes sobre vigilância da resistência às drogas na hanseníase foram publicadas em 2009 (Diretrizes para a vigilância global da resistência às drogas na hanseníase. Nova Delhi: Escritório Regional da OMS para o Sudeste Asiático, 2009). Histórico2 Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 2017 3 Este guia foi preparado pelo Programa Global de Hanseníase (GLP) da OMS, em coordenação com as principais partes interessadas em hanseníase. Desde 2011, alguns países já começaram a testar novos casos de resistência às drogas, além dos casos de reincidência, para avaliar o nível de resistência primária às drogas. Além disso, a dificuldade de encontrar a definição de recaída foi um obstáculo para o teste de resistência secundária. Isso pode vir a mudar levando-se em consideração as novas definições de casos de hanseníase incluídas na Estratégia Global de Hanseníase 2016–2020: Guia de Monitoramento e Avaliação (ver também a Seção 5.2). Laboratórios participantes da rede foram avaliados quanto à qualidade da amplificação genômica pelo laboratório internacional de referência no Japão em 2009 e 2011, com boa concordância. Cada laboratório envolvido utiliza técnicas próprias, como a reação em cadeia da polimerase (PCR), o sequenciamento direto, a análise por high resolution melting ou o sequenciamento de todo o genoma. A detecção da RAM na hanseníase ainda não foi padronizada. Os espécimes coletados consistiram em esfregaços intradérmicos (de acordo com as diretrizes de 2009); Nos últimos anos, biópsias de pele também foram coletadas e analisadas. Todos os dados coletados globalmente de 2010 a 2015 foram sintetizados durante a Consulta Global sobre Vigilância à Resistência Antimicrobiana em outubro de 2016. Relatórios formais foram recebidos em um total de 1086 casos de recidiva e 776 novos casos testados globalmente antes do final de 2015, entre os quais a resistência à rifampicina foi identificada em 57 casos de reincidência (5,2% de resistência secundária) e 16 casos novos (2,1% de resistência primária). Esses resultados apontaram a necessidade de expansão da rede de vigilância não só em termos de números de laboratórios e países envolvidos, mas também em termos de escopo, aumentando o número de amostras testadas do total de casos detectados e implementando um modelo de vigilância contínua para resistência secundária. Isto também está de acordo com o espaço que a RAM na hanseníase tem recebido como uma das principais áreas de intervenção da Estratégia Global de Hanseníase 2016–2020. A Assembleia Mundial da Saúde emitiu uma resolução sobre a RAM em 2015 (WHA 68.20) juntamente com um plano de ação global; portanto, a importância dada pela Estratégia Global para Hanseníase se encaixa dentro de uma atenção global geral à resistência às drogas. Por essas razões, o GLP, em colaboração com seus principais parceiros e partes interessadas, preparou este guia como uma atualização para as diretrizes de vigilância de 2009. 3 Fundamentos para o desenvolvimento do guia Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 20174 VISÃO UM M U NDO SEM HA NS EN ÍA SE OBJETIVO METAS 2020 0 < 1 0 4 Panorama da Estratégia Global para Hanseníase 2016–2020 Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 2017 5 5.1 Objetivos O objetivo do sistema de vigilância é determinar principalmente a resistência à rifampicina entre os casos de hanseníase, isoladamente ou combinados com resistência à dapsona e/ou ofloxacina entre novos casos (uma referência para resistência primária) e entre os casos de retratamento (uma referência para resistência secundária) e monitorar as taxas de resistência ao longo do tempo. Também forneceria informações adicionais para que uma possível associação entre resistência e sexo, grupos etários específicos e / ou localização geográfica dos casos de hanseníase possam ser identificadas. 5.2 Definições Novo caso de hanseníase: um paciente diagnosticado com hanseníase e que nunca recebeu tratamento para a doença anteriormente. Caso de retratamento de hanseníase: um paciente diagnosticado com hanseníase que já recebeu tratamento para a doença anteriormente. Os casos de retratamento são classificados nos seguintes grupos: • Retratamento após a perda do acompanhamento: um paciente diagnosticado com hanseníase que abandonou o tratamento antes de seu término e retorna à unidade de saúde para concluir o tratamento. • Recidiva: um paciente que completou um curso completo de tratamento para a hanseníase no passado e que retorna com sinais e sintomas da doença que não são considerados como decorrentes de uma reação de acordo com o médico. • Transferido: um paciente que iniciou o tratamento em uma unidade e se reporta em outra unidade para continuar o tratamento. • Outro retratamento: qualquer caso de hanseníase que não se encaixa em nenhuma das categorias acima e requer tratamento Ambos os casos novos e de retratamento podem ser classificados da seguinte forma: Caso PB: um caso de hanseníase com 1 a 5 lesões cutâneas sem a presença comprovada de bacilos na baciloscopia de esfregaço intradérmico. Caso MB: um caso de hanseníase com mais de 5 lesões cutâneas; ou com qualquer envolvimento de nervo (incluindo neurite pura ou qualquer número de lesões de pele e neurite); ou com presença comprovada de bacilos na baciloscopia de esfregaço intradérmico, independentemente do número de lesões cutâneas. 5 Visâo geral do sistema de vigilância sobre resistência antimicrobiana na hanseníase Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 20176 5.3 Resistência nos casos novos Amostras a serem testadas: esfregaço intradérmico ou biópsias de pele. Agentes antimicrobianos a serem investigados: as amostras são testadas para mutações que podem estar associadas à resistência à rifampicina, dapsona e ofloxacina. Critério de inclusão: Para detectar resistência primária, uma amostra do número total de casos novos de hanseníase detectados no ano deve ser testada. De modo a obter uma PCR positiva e testes bem sucedidos para a RAM, apenas serão testados os casos MB positivos com um índice bacilar IB ≥2 considerando que estes têm uma maior probabilidade de uma PCR positiva. Definição do desenho do sistema. A vigilância da RAM primária na hanseníase pode ser realizada com base em: • um sistema de vigilância contínua que testa todos os novos casos de MB (recomendado para países com alta capacidade laboratorial, recursos adequados e APENAS para um pequeno número de casos); • um estudo transversal (recomendado para países sem dados de base representativos e com recursos financeiros suficientes); • um sistema de vigilância sentinela com o objetivo de monitorar as tendências da resistência à rifampicina entre os novos casos de hanseníase ao longo de um período de tempo em várias regiões / estados (recomendado para países com dados de base nacionais / após uma pesquisa nacional). Um sistema sentinela após uma pesquisa nacional poderia ser uma abordagem razoável para gerar dados constantes para ser possível analisar as tendências; • determinação do tamanho de uma amostra arbitrária, calculando uma proporção alvo de todos os novos casos de MB a serem testados de acordo com a capacidade/ recursos. Deve-se usar um número NÃO menor que 10% do total de casos novos de MB notificados no ano anterior (recomendado para países sem dados de base nacionais e sem os recursos para realizar uma pesquisa nacional). Laboratórios nacionais ou internacionais serão identificados para realização do teste. Amostras de pele serão coletadas em unidades selecionadas (locais de estudo durante pesquisas ou locais de vigilância sentinela) após obter o consentimento do paciente. As amostras serão transportadas para o laboratório de teste nacional ou internacional designado. Quando as amostras são enviadas para o exterior por via aérea, elas devem ser enviadas de acordo com os regulamentos da Associação Internacional de Transporte Aéreo (AITA). Seleção de unidades de saúde para coleta de amostras: Como a baciloscopia ou biópsias de pele não são coletadas rotineiramente no nível periférico, os pacientes a serem testados Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 2017 7 terão que ser identificados entre aqueles que frequentam as unidades de nível intermediário onde a baciloscopia de esfregaço intradérmico e /ou biópsias são rotineiramente realizadas. Nas unidades selecionadas, todos os novos pacientes com um IB ≥2 serão testados para resistência às drogas. Sistemas de informação: Os registros dos pacientes serão mantidos nas unidades de coleta das amostras, no laboratório e em nível nacional, usando um registro RAM nacional (exemplo no Anexo 2). 5.4 Resistência entre casos de retratamento Amostras a serem testadas: esfregaço intradérmico ou biópsias de pele. Agentes antimicrobianos a serem investigados: As amostras serão testadas para mutações que podem estar associadas à resistência à rifampicina, dapsona e ofloxacina. Critério de inclusão. Para detectar resistência secundária, todos os casos de retratamento de hanseníase devem ser testados com a exceção de casos transferidos, a menos que esses casos sejam considerados de risco para a RAM devido ao tratamento irregular. Tais casos serão definidos como “outros retratamentos” no formulário do teste. De modo a obter uma PCR positiva e testes bem sucedidos para a RAM, apenas serão testados casos MB positivos com um índice bacilar IB ≥2 considerando que estes têm uma maior probabilidade de ter uma PCR positiva. Desenho do sistema. A vigilância da resistência às drogas entre os casos de retratamento na hanseníase será realizada por um método de vigilância contínua, pois o teste abrange todos os casos de retratamento (com IB ≥2 ) ao longo dos anos. Laboratórios nacionais e internacionais serão identificados para a realização do teste. Amostras de pele (biópsias ou raspado intradérmico) serão coletadas de unidades de nível intermediário identificadas para coleta de amostra para teste de RAM e transportadas para o laboratório de testes nacional ou internacional designado correspondente. As amostras enviadas por via aérea devem seguir os regulamentos da AITA (estes podem ser encontrados em http://apps.who. int/iris/bitstream/10665/254788/1/WHO-WHE-CPI-2017.8-eng.pdf?ua=1). Para que a vigilância seja implementada de acordo com esta metodologia, todos os casos de suspeita de retratamento terão que ser encaminhados às unidades específicas de nível intermediário para confirmar seu diagnóstico e coletar amostras para fins de vigilância de RAM. Isso indiretamente trará o benefício de melhorar a qualidade do diagnóstico de casos de suspeita de hanseníase de retratamento e potencialmente também facilitará o manejo de reações, já que alguns desses pacientes podem ser pacientes de hanseníase que já completaram o tratamento, mas ainda apresentam reações de base imunológica com alto risco de desenvolver deficiências e / ou agravamento de uma deficiência já existente. Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 20178 Sistemas de informação. Os registros dos pacientes serão mantidos nas unidades de coleta das amostras, no laboratório e em nível nacional, usando um registro RAM nacional (exemplo no Anexo 5). 5.5 Esquema para vigilância de RAM na hanseníase Fig. 1. Esquema para vigilância de RAM na hanseníase OMS Programa Global de Hanseníase Publicar o relatório anual sobre hanseníase na OMS Registro epidemiológico semanal. Ministério da Saúde Compilar dados no Registro Nacional de Resistência Antimicrobiana Enviar dados para a OMS através do relatório global anual de coleta de dados sobre a hanseníase Laboratório de referência / laboratório de referência global Fornecer amostras para controle de qualidade aos países e passar por controle de qualidade pelo Laboratório de Referência Global Capacitação de laboratórios nacionais Armazenamento de dados, incluindo mutações detectadas Laboratório (nacional ou internacional) PCR+Sequência folp1, rpoB e gyrA mutações genéticas Reportar os resultados para a unidade de coleta da amostra, para o Ministério da Saúde e para o laboratório de referência (ou para o laboratório de referência global) Unidade de saúde para coleta de amostras (locais de sentinela / locais de estudo) Para todos os MB, novos casos e retratamento coletar amostras (raspado intradermico ou biópsia). Se encontrado IB ≥2 enviar amostras para laboratório para testes de resistência às drogas. Global Health Institute, Lausanne,Suíça Repositório de mutações detectadas Fonte: Tabela desenvolvida pelo Professor E. Cambau, Dr M. Matsuoka e Dr L. Gillini Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 2017 9 Várias atividades são necessárias para estabelecer e / ou expandir o sistema de vigilância para a RAM na hanseníase: (1) identificar laboratório (s) para realizar testes moleculares para resistência a rifampicina, dapsona e ofloxacina. Tais laboratórios podem estar localizados no país ou no exterior (um dos quatro laboratórios de referência) e podem ser mais de um por país, de acordo com as necessidades; (2) identificar um laboratório no exterior, entre um dos quatro laboratórios internacionais (para países que testam apenas em laboratórios nacionais). Uma proporção das amostras precisa ser enviada periodicamente para o laboratório externo; (3) identificar as unidades de saúde para coleta de amostras para testar a resistência em casos MB com IB ≥2 ; (4) calcular a amostra a ser testada (número de novos casos MB a serem testados) em cada unidade de coleta; (5) estabelecer um sistema de transporte para enviar amostras para o laboratório de testes; (6) coletar sistematicamente informações relacionadas aos pacientes testados e aos resultados correspondentes, incluindo os resultados do tratamento (o que poderia ser feito pelo Programa Nacional, por um instituto nacional de saúde pública / pesquisa ou por um dos laboratórios nacionais de teste se a tecnologia de informação for adequada e / ou recursos humanos estiverem disponíveis); (7) monitorar as tendências de resistência ao longo do tempo por área geográfica, sexo, idade, categoria / tipo de paciente e, se possível, por fatores socioeconômicos. 6.1 Seleção dos laboratórios A capacidade laboratorial atual deve ser fortalecida para conduzir atividades de vigilância da hanseníase. A vigilância da resistência às drogas entre os casos novos é uma atividade contínua dos centros participantes, tanto nacionais quanto internacionais, teriam que levar em conta a necessidade de manter o trabalho da RAM durante um período de tempo, a menos que o modelo adotado seja uma pesquisa nacional temporária. No entanto, mesmo no último caso, o trabalho para realizar a pesquisa deve levar mais tarde à criação de um sistema de vigilância sentinela de rotina para garantir a disponibilidade de dados ao longo do tempo ou ser seguido por uma nova pesquisa após 3-5 anos. Um laboratório nacional ou internacional é suficiente para testes em países com baixa ocorrência de hanseníase, enquanto países com 6 Estabelecer elou expander um sistema de vigilância a nivel nacional Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 201710 um grande número de casos anuais devem manter mais de um laboratório para garantir o teste de todos os casos de retratamento e uma parte dos novos casos de MB. Os laboratórios podem ser administrados pelo governo ou por uma ONG. Caso uma ONG ou um laboratório internacional seja identificado, o Programa Nacional de Hanseníase deve elaborar um memorando de entendimento (MDE) para garantir o acesso aos dados de resistência pelo Programa. Laboratórios de testes nacionais e internacionais devem testar amostras ao longo do ano até que o número indicado de amostras a serem testadas seja atingido. Enquanto o desempenho prático do teste é de responsabilidade do laboratório, garantir a disponibilidade de uma rede para coleta correta de amostras, transporte, armazenamento de espécimes e remessa, coleta e transmissão de informações para o monitoramento de dados de resistência são deveres do Programa Nacional de Hanseníase. Deve-se explorar a possibilidade de estabelecer testes em um laboratório de tuberculose (TB) ou em um laboratório que atue como referência para a agência nacional encarregada da RAM ao estabelecer o sistema de vigilância. 6.2 Seleção de laboratórios para fins de controle de qualidade Como parte da capacitação e para garantir a confiabilidade dos dados nacionais, cada país que testa amostras ao nível nacional deve identificar um laboratório de referência para realizar o controle de qualidade. Os programas nacionais de hanseníase devem desenvolver um Memorando de Entendimento para garantir o acesso aos serviços relacionados ao controle de qualidade. Enquanto o desempenho prático do controle de qualidade é um dever do laboratório de referência internacional, garantir o envio regular de amostras para fins de controle de qualidade, registro e relato de informações relacionadas, armazenamento e revisão dos resultados das atividades de controle de qualidade são deveres do Programa Nacional de Hanseníase. O controle de qualidade dos laboratórios nacionais deve ser conduzido sob a supervisão do laboratório internacional de referência identificado como parceiro (Baton Rouge, EUA; Tóquio, Japão; Paris, França e Lausanne, Suíça; ver Anexo 1). Para preparar material padrão com o apoio do laboratório internacional de referência, enviamos amostras representativas de DNA e suspensões bacilares (sem mutação e com mutação reconhecida) uma vez ao ano. Além disso, as missões dos países seriam conduzidas pelo laboratório de referência uma vez a cada 1-3 anos para aumentar a capacidade nacional do laboratório e como parte da avaliação do controle de qualidade. Todos os espécimes de pele positivos e negativos de cada caso devem ser arquivados para garantia de qualidade e testes adicionais. As amostras devem ser mantidas congeladas no Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 2017 11 laboratório por 10 anos. Se necessário, um depósito pode ser organizado em um laboratório de referência, especialmente para amostras que apresentem novas mutações. Estas amostras devem ser compartilhados entre os laboratórios de referência. Os laboratórios internacionais de referência também devem estar sujeitos a um sistema de controle de qualidade, uma vez por ano, através do monitoramento coordenado pelo laboratório do Centro de Pesquisa de Hanseníase, Instituto Nacional de Doenças Infecciosas, Tóquio, Japão. Enquanto a tarefa prática de cumprir os protocolos de controle de qualidade por laboratórios nacionais e internacionais é tarefa dos mesmos, garantir que os recursos e mecanismos estejam em vigor para o controle de qualidade é um dever dos programas nacionais de hanseníase. 6.3 Identificação dos estabelecimentos para coleta de amostras As unidades de saúde são identificadas para coletar amostras de casos novos e de retratamento de MB para serem testadas quanto à resistência as drogas. Por conveniência, sugere-se que os locais selecionados sejam centros de nível secundário e terciário, onde exames / biópsias de pele são rotineiramente realizados para avaliar / classificar os pacientes. Isso garantiria que amostras de boa qualidade sejam coletadas e evitasse o encaminhamento de novos pacientes atendidos em um centro periférico para um nível mais alto de atendimento, apenas para fins de vigilância antimicrobiana. Todos os casos suspeitos de retratamento devem ser encaminhados para confirmação do diagnóstico em uma unidade de nível secundário / terciário. Para países grandes como a Índia e o Brasil, pelo menos uma unidade de saúde de coleta de amostras por distrito deve ser identificada entre todas as unidades de nível secundário / terciário que prestam serviços de hanseníase, seja ela uma unidade do governo ou uma ONG. Se necessário, treinamento deve ser fornecido para os técnicos de laboratório em hospitais distritais. A unidade ao nível municipal deve ser selecionada aleatoriamente se houver mais de um centro ao nível secundário / terciário disponível. Para países com menos casos, as unidades de saúde para coleta de amostras devem ser selecionadas apenas em grandes jurisdições administrativas (estado / província / região). Para esses países, a seleção de unidades de saúde de coleta de amostras por estado / província / região deve ser feita aleatoriamente entre os centros de nível secundário / terciário disponíveis naquele estado / província / região. Em cada unidade de saúde de coleta de amostras, os formulários apropriados devem ser preenchidos para acompanhar a remessa de amostras; as informações do paciente devem ser registradas para permitir a comunicação dos resultados e a prescrição do tratamento adequado, caso seja detectada resistência. As unidades de coleta de amostra devem solicitar o consentimento por escrito de cada paciente (ou dos pais, no caso de um menor) após fazer um breve esclarecimento sobre resistência às drogas na hanseníase. Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 201712 Se uma das unidades de saúde escolhidas for uma instituição / hospital de uma ONG (seja centro de saúde de coleta de amostras ou laboratório de testes), o Programa Nacional de Hanseníase deve desenvolver um MDE para garantir o acesso aos serviços e registro de relatórios com informações relacionadas à RAM. Embora a tarefa prática de coleta e envio de amostras seja um dever de cada unidade de coleta de amostras, assegurar o envio regular de amostras para testes, registros e relatórios de informações relacionadas, e supervisão para garantir que os protocolos padrão sejam seguidos por todas as instalações envolvidas são deveres dos programas nacionais de hanseníase. 6.4 Cálculo do tamanho da amostra Para cada unidade de saúde de coleta de amostra (uma unidade de estudo para pesquisa ou uma unidade sentinela em um modelo de vigilância), um cálculo do tamanho da amostra deve ser realizado de acordo com a fórmula fornecida no Anexo 7. Para países sem dados de referência locais sobre resistência, o tamanho da amostra para cada unidade de saúde de coleta de amostra deve ser determinado com o objetivo de testar pelo menos 10% do total de casos novos de MB detectados no ano anterior. Para todos os casos suspeitos de retratamento, deve haver um sistema que garantam encaminhamento dos mesmos para instalações ao nível secundário / terciário, onde suas amostras seriam coletadas mediante confirmação dos casos de retratamento, excluindo casos de transferidos sem suspeita de resistência. 6.5 Coleta sistemática de amostras Para todos os casos que atendem aos critérios de inclusão (diagnóstico de casos novo ou de retratamento confirmados, baciloscopia BI≥2), a amostra da esfregaço intradérmico para teste de RAM será feita com o consentimento do paciente, de acordo com as práticas clínicas e processamento laboratorial: • devem ser colhidas duas amostras de esfregaço intradérmico, sendo a lesão cutânea mais proeminente com IB ≥2 a amostragem preferida juntamente com o lóbulo da orelha; ou • uma biópsia de pele (por exemplo, biópsia por punch 4 mm) deve ser retirada de uma lesão proeminente com um BI ≥2. Para os casos novos, a coleta sistemática de amostras (de rotina) deve continuar em cada local de coleta de amostras até que o número de amostras a serem coletadas seja Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 2017 13 atingido, conforme definido no cálculo do tamanho da amostra (seção 6.4) ou até atingir um número correspondente a pelo menos 10% dos casos de MB detectados naquela unidade municipal / estadual no ano anterior. É necessário obter o consentimento do paciente de acordo com as diretrizes éticas do país. Para pacientes menores de 18 anos de idade, o consentimento dos pais deve ser solicitado. 6.5.1 Amostras de esfregaço intradérmico A coleta de material de esfregaço intradérmico deve se feita da mesma forma como para o exame de índice baciloscópico usando uma lâmina descartável de aço inoxidável. Deve-se ter cuidado para evitar a contaminação cruzada. A lâmina de aço inoxidável contendo as amostras de tecido deve ser enxaguada em um tubo de centrífuga (com tampa de rosca) de 1,8 mL pré-preenchido com 1 mL de etanol a 70% (etanol absoluto para grau de biologia molecular a 70% v/v) + água deionizada estéril de MilliQ ou raspagens teciduais humanas lavadas da superfície da lâmina e suspensas na solução. Isso significa que, em cada caso, duas amostras de esfregaço dérmico seriam coletadas e rotuladas de acordo com a prática nacional (alguns países usam o número de registro da hanseníase). Quando possível, amostras de pele também são guardadas em um cartão Whatman® FTA® Faça uma amostra pequena, proporcional ao tamanho do cartão. Ambos os materiais podem ser armazenados à temperatura ambiente. 6.5.2 Biópsia de pele Uma biópsia de pele é coletada preferencialmente usando um punch de 4 mm para casos novos. Para casos de retratamento, uma biópsia cirúrgica de 6 mm é preferível, especialmente se o IB for próximo de 2+. A biópsia é então colocada em um tubo estéril de centrífuga de 1.8 mL (com tampa de rosca) pré-preenchido com 1 mL de etanol a 70% (etanol absoluto para grau de biologia molecular a 70% v/v) + água deionizada estéril de MilliQ ou com qualidade de injeção humana 30% v/v, (sendo a mistura preparada em laboratório) como descrito acima. As amostras podem ser mantidas à temperatura ambiente até serem enviadas para o laboratório, possivelmente em lotes, dependendo do custo do transporte e do número de amostras por mês. Os bacilos são rapidamente inativados, isso significa que as amostras podem ser enviadas por transporte de rotina, sem a necessidade de controlar a temperatura durante o transporte, ou mesmo sem precauções adicionais de controle de risco biológico. Para casos em que a detecção molecular é negativa (resultados de PCR negativos devido a inibição ou uma pequena quantidade de DNA), pode ser necessário coletar amostras Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 201714 adicionais de outra lesão. Isso deve ser feito depois de discutir com o laboratório de testes e caso a caso. Fig. 2. Coleta de esfregaço intradérmico e tubo de centrífuga com 1mL de etanol 70% para a armazenamento de amostra de tecido para teste de RAM. Fig. 3. Coleta de biópsia de pele por punch e tubo para armazenamento e transporte (foto cortesia: Dr Beatrice Flageul). Funcionários da unidade de referência e nos locais de sentinela devem ser treinados para coleta adequada de amostras e seu transporte. Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 2017 15 6.6 Testes laboratoriais Assim que o laboratório de testes, nacional ou internacional, receba as amostras, as seguintes etapas devem ser realizadas: Amplificação de regiões determinantes de resistência a fármacos dos genes rpoB, folP1 e gyrA Cada laboratório aplica seu próprio método aprovado. Sequenciamento do PCR amplificado produtos ou hibridação com sondas específicas (o método de hibridação pode ser aplicado em laboratórios sem sequenciadores. Os laboratórios de referência estão frequentemente usando sequenciadores) Distinção entre a sequência do alelo selvagem e verificação da presença de substituição de aminoácidos (mutação) Relatório de resultados O DNA do Mycobacterium leprae presente em amostras de pele é amplificado por PCR e mutações por sequenciamento ou hibridização, de acordo com a técnica utilizada pelo laboratório. Vários métodos, que já mostraram bom desempenho, podem ser usados. Três técnicas são apresentadas como exemplos no Anexo 6: um PCR interno + protocolo de sequenciamento, um PCR disponível comercialmente + kit de hibridização e sequenciamento de todo o genoma. No caso de PCRs negativos para os genes folP1, rpoB ou gyrA, recomenda-se realizar uma PCR visando outra sequência de DNA, tal como o elemento repetitivo específico do Mycobacterium leprae (RLEP) para amplificação. Isto permite a avaliação da presença do DNA do Mycobacterium leprae na amostra. Seja qual for a técnica utilizada pelo laboratório, obrigatoriamente ela deve ser capaz de detectar mutações conhecidas por conferirem resistência (ver Fig. 4, Tabela 1). Estudos adicionais serão necessários para identificar outras mutações que confiram resistência. Por essa razão, parte do escopo da rede de vigilância é criar um “banco” global de mutações detectadas para ser gerenciado pelo Instituto Global de Saúde, Lausane. A partir de 1993, o sequenciamento genético foi feito para os filamentos de Mycobacterium leprae conhecidos por serem resistentes em experimentos do tipo mouse footpad isolados dos casos de falha no tratamento. Isto mostrou claramente que algumas mutações missense (mutações possuindo uma mudança de aminoácidos) conferem resistência à dapsona (mutação no gene folP1), rifampicina (mutação no gene rpoB) e as quinolonas (mutação no gene gyrA). Como estas mutações estão agrupadas dentro de cada Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 201716 gene respectivo, as regiões que determinam a resistência à droga foram descritas como região determinante de resistência à dapsona (RDRD), região determinante de resistência à rifampicina (RDRR) e região determinante de resistência à quinolona (RDRQ) (ver Bibliografia). O sequenciamento do genoma do Mycobacterium leprae levou recentemente à uma modificação do sistema de numeração usado anteriormente. Fig. 4. Sequências de nucleotídeo e aminoacidos das regiões determinantes de resistência às drogas. Os códons mais frequentemente envolvidos na resistência são destacados em retângulos. A rifampicina liga-se à subunidade β (codificada pelo gene rpoB) da RNA polimerase e certas mutações no gene rpoB levam à resistência à rifampicina em Mycobacterium leprae e Mycobacterium tuberculosis. Mutações missense que levam à substituição de qualquer um dos seguintes aminoácidos (posições 438, 441, 451, 456 e 458) ou inserção de nucleotídeos entre a posição 439 e 440 conferem resistência à rifampicina no Mycobacterium leprae (Tabela 1). Mutações observadas em outras posições (de 432 a 437) devem ser relatadas com cautela e discutidas com um microbiologista de um dos quatro laboratórios internacionais de referência. Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 2017 17 Table 1. Mutações em drogas anti-hansênicas atingem genes que conferem resistência ao Mycobacterium leprae Gene Substituição do aminoácidodevido à mutaçãogenética Mudança do nucleotídeo (5’–>3’) rpoB Gln438Val cag gtg Asp441Tyr gat tat Asp441Asn gat aat His451Asp cac gac His451Tyr cac tac Ser456Leu tcg ttg Ser456Met tcg atg Ser456Phe tcg ttc Ser456Trp tcg tgg Leu458Val ctg gtg Leu458Pro ctg ccg folP1 Thr53Ala acc gcc Thr53Arg acc agc Thr53Ile acc atc Pro55Arg ccc cgc Pro55Leu ccc ctc Pro55Ser ccc tcc gyrA Gly89Cys ggc tgc Ala91Val gca gta Observação: Aminoácidos mutantes em negrito são mutações de alta frequência para Mycobacterium leprae associadas à resistência às drogas. O sistema de numeração é o da sequênciaTN do genoma do Mycobacterium leprae (GenBank AL583923; [1]) Mutações missenses na região determinante de resistência à sulfona do gene folP1 (codificando a di-hidropteroato sintase) e resultando em substituições de aminoácidos nas posições 53 e 55 conferem resistência à dapsona ao Mycobacterium leprae em nível intermediário e alto nos experimentos de mouse footpad. A correlação entre resistência à ofloxacina e mutação missense no gene gyrA foi confirmada nas posições 91 (Ala91Val) e 89 (Gly89Cys). Mutações envolvendo os códons 92 e 95 podem ser possivelmente consideradas responsáveis pela resistência à ofloxacina de acordo com os resultados do Mycobacterium tuberculosis, mas devem ser reportadas com cautela e discutidas com um microbiologista de um dos quatro laboratórios de referência internacional. Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 201718 Após a realização dos testes laboratoriais, consulte o fluxograma abaixo a fim de relatar os resultados: A PCR específica para genes de resistência às drogas é positiva? Se a PCR for negativa; verificar se a amostra contém DNA suficiente de Mycobacterium leprae (por PCR, RLEP ou outra PCR específica); se as PCRs forem todas negativas, peça outra amostra de BI+ IfSe a PCR for positiva, determine a sequência ou hibride com oligo nucleotídeos de tipo selvagem e mutados – Se não houver mutação: relatar como suscetível – Se mutação for presente: – É uma mutação silenciosa? (que não altera o aminoácido codificado) Se sim, não reportar – É uma mutação missense? (que confere uma mudança/substituição do aminoácido) Se sim, reporte a substituição de aminoácidos com o sistema de numeração, conforme mostrado na Tabela 1. – É uma das substituições que conferem resistência às drogas na hanseníase, conforme descrito na Tabela 1? Se sim, relate a sequência como resistente. Em caso negativo, discuta com o laboratório internacional de referência sobre o procedimento para reportar. Envie o formulário de relatório laboratorial para o centro de referência e para o Gerente do Programa Nacional de Hanseníase Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 2017 19 6.7 Registro sistemático de informações Os resultados do teste serão utilizados pela unidade de coleta/ estudo/ sentinela de amostras para a administração adequada do paciente e pelo Programa Nacional de Hanseníase para o monitoramento apropriado. Portanto, os resultados do teste do laboratório precisam chegar tanto na unidade de saúde que está dando assistência ao paciente e também ao Programa Nacional de Hanseníase, a fim de ser incluído no Registro Nacional de Resistência às drogas para Hanseníase (Anexo 2). Para isso, foram criados formulários de informação clínica padrão para registrar os dados que serão enviados aos laboratórios de referência e retornados às unidades de saúde (Anexos 3, 4 e 5). Ao final do tratamento dos casos de resistência detectados, uma cópia do prontuário deve ser enviada ao Programa Nacional de Hanseníase para permitir o registro dos resultados do tratamento (Anexo 5). O Programa Nacional de Hanseníase deverá reportar à OMS anualmente o seguinte: (1) número de novos casos MB testados assim como o número e proporção de casos de resistência (à uma droga ou mais de uma droga); (2) número de casos MB de retratamento testados e número e proporção de casos de resistência (mono e multi-resistentes). O envio global de dados resulta em uma publicação sobre hanseníase no registro epidemiológico semanal da OMS, que a partir de 2017 incluirá dados sobre resistência às drogas, em consonância com a importância que esse aspecto tem tido na Estratégia Global de Hanseníase 2016-2020. Em âmbito global, alguns países estão implementando uma plataforma on-line para reportar e monitorar a RAM, esse sistema é chamado de Sistema Global de Vigilância de Resistência Antimicrobiana (SGVRAS). No momento, o GLP está explorando a possibilidade de integrar os dados de resistência às drogas para hanseníase na plataforma online do SGVRAS. Para os países que contam com um instituto nacional de saúde pública/ pesquisa e/ ou centros colaboradores de hanseníase com ferramentas adequadas de TI/ saúde pública, incluindo recursos humanos, a coleta e análise de dados podem ser feitas por esse centro para o Programa Nacional de Hanseníase. No entanto, mesmo sob este acordo, o domínio e a responsabilidade pelo monitoramento das tendências de resistência as drogas continua sendo do Programa Nacional de Hanseníase. Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 201720 6.8 Monitoramento de resistência antimicrobiana Os programas nacionais de hanseníase terão que monitorar as tendências de resistência entre os casos novos e de retratamento ao longo do tempo, além de monitorar a proporção de pacientes testados. Os resultados do retratamento devem ser analisados por tipo de retratamento, tentando identificar fatores de risco para resistência, como por exemplo perda do acompanhamento. Particularmente seria preocupante uma proporção crescente de casos resistentes à rifampicina, especialmente se estes estiverem entre os novos casos, e se o total de novos casos de hanseníase permanecem estáveis em número ou não ao longo do tempo. Sugere-se compilar devidamente o registro de resistência às drogas para poder analisar dados entre diferentes categorias e monitorar os resultados do tratamento. Isso ajudaria a identificar grupos de risco para resistência por idade, sexo, local de residência e/ ou fatores socioeconômicos e categoria de paciente (por exemplo, retratamento após perda do acompanhamento), assim como fatores de risco que levam à falha do tratamento. Para países com alto número de casos de hanseníase, sugere-se que um banco de dados nacional informatizado seja estabelecido e periodicamente compartilhado com o laboratório de referência para identificar mutações mais frequentes e possíveis padrões de transmissão por meio de pesquisas, incluindo sequenciamento do genoma completo feito pelo laboratório da Escola Politécnica Federal de Lausane. Os países também poderiam usar o banco de dados como uma ferramenta para conduzir pesquisa operacional e científica periodicamente para identificar fatores de risco adicionais, tais como atraso no diagnóstico, tratamento procurado no setor privado, comorbidades, etc. Fatores associados aos resultados do tratamento com drogas de segunda linha também devem ser identificados. Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 2017 21 (1) Adams LB, Job CK, Krahenbuhl JL. Role of inducible nitric oxide synthase in resistance to Mycobacterium leprae in mice. Infect Immun. 2000; 68: 5462–5. (2) Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence sata. Bioinformatics. 2014; 30: 2114-20. (3) Cambau E, Perani E, Guillemin I, Jamet P, Ji B. Multidrug-resistance to dapsone, rifampicin, and ofloxacin in Mycobacterium leprae. Lancet. 1997; 349: 103–4. (4) Cambau E, Bonnafous P, Perani E, Sougakoff W, Ji B, Jarlier V. Molecular detection of rifampin and ofloxacin resistance for patients who experience relapse of multibacillary leprosy. Clin Infect Dis. 2002; 34: 39–45. (5) Cambau E, Carthagena L, Chauffour A, Ji B, Jarlier V. Dihydropteroate synthase mutations in the folP1 gene predict dapsone resistance in relapsed cases of leprosy. Clin Infect Dis. 2006; 42: 238–41. (6) Cambau E, Chauffour-Nevejans A, Tejmar-Kolar L, Matsuoka M, Jarlier V. Detection of antibiotic resistance in leprosy using GenoType LepraeDR, a novel ready-to-use molecular test. PLoS Negl Trop Dis. 2012; 6(7): e1739. (7) Cole S, Eiglmeier K, Parkhill J, James K, Thomson N, Wheeler P et al. Massive gene decay in the leprosy bacillus. Nature. 2001; 409: 1007–11. (8) Gillis TP, Williams DL. Dapsone resistance does not appear to be associated with a mutation in the dihydropteroate synthase-2 gene of Mycobacterium leprae. Indian J Lepr. 1999; 71: 11–18. (9) Gillis TP, Williams DL. Dapsone resistance in Mycobacterium leprae. Lepr Rev. 2000; 71 (Suppl): S91–S95. (10) Ginsberg AM, Spigelman M. Challenges in tuberculosis drug research and development. Nat Med. 2007; 13 (3): 290–4. (11) Hirawati, Katoch K, Chauhan DS, Singh HB, Sharma VD, Singh M et al. Detection of M. leprae by reverse transcription PCR in biopsy specimens from leprosy cases: a preliminary study. J Commun Dis. 2006; 38: 280–7. (12) Honore N, Cole ST. Molecular basis of rifampin resistance in Mycobacterium leprae. Antimicrob Agents Chemother. 1993; 37: 414–18. (13) Honore N, Perani E, Telenti A, Grosset J, Cole ST. A simple and rapid technique for the detection of rifampin resistance in Mycobacterium leprae. Int J Lepr Other Mycobact Dis. 1993; 61: 600–4. (14) Kai M, Matsuoka M, Nakata N, Maeda S, Gidoh M, Maeda Y et al. Diaminodiphenylsulfone resistance of Mycobacterium leprae due to mutations in the dihydropteroate synthase gene. FEMS Microbiol Lett. 1999; 177: 231–5. (15) Katoch VM, Lavania M, Chauhan DS, Sharma R, Hirawati, Katoch K. Recent advances in molecular biology of leprosy. Indian J Lepr. 2007; 79: 151–66. (16) Kim SK, Lee SB, Kang TJ, Chae GT. Detection of gene mutations related with drug resistance in Mycobacterium leprae from leprosy patients using Touch-Down (TD) PCR. FEMS Immunol Med Microbiol. 2003; 36: 27–32. (17) Koboldt DC, Zhang Q, Larson DE, Shen D, Mclellan MD, Lin L, Miller CA, Mardis ER, Ding L, Wilson RK. VarScan 2: Somatic mutation and copy number alteration discovery in cancer by exome sequencing. Genome Res. 2012; 22: 568–76. (18) Langmead B, Salzberg SL. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods. 2012; 9: 357–9. (19) Lavania M, Katoch K, Sachan P, Dubey A, Kapoor S, Kashyap M et al. Detection of Mycobacterium leprae DNA from soil samples by PCR targeting RLEP sequences. J Commun Dis. 2006; 38: 269–73. (20) Lee SB, Kim SK, Kang TJ, Chae GT, Chun JH, Shin HK et al. The prevalence of folP1 mutations associated with clinical resistance to dapsone, in Mycobacterium leprae isolates from South Korea. Ann Trop Med Parasitol. 2001; 95: 429–32. Bibliografia Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 201722 (21) Maeda S, Matsuoka M, Nakata N, Kai M, Maeda Y, Hashimoto K et al. Multidrug resistant Mycobacterium leprae from patients with leprosy. Antimicrob Agents Chemother. 2001; 45: 3635–9. (22) Matrat S, Cambau E, Jarlier V, Aubry A. Are all the DNA gyrase mutations found in Mycobacterium leprae clinical strains involved in resistance to fluoroquinolones? Antimicrob Agents Chemother. 2008; 52: 745–7. (23) Matsuoka M, Kashiwabara Y, Namisato M. A Mycobacterium leprae isolate resistant to dapsone, rifampin, ofloxacin and sparfloxacin. Int J Lep Other Mycobact Dis. 2000; 68: 452–5. (24) Matsuoka M, Kashiwabara Y, Liangfen Z, Goto K, Kitajima S. A second case of multidrug resistant Mycobacterium leprae isolated from a Japanese patient with relapsed lepromatous leprosy. Int J Lepr Other Mycbact Dis. 2003; 71: 240–3. (25) Matsuoka M, Budiawan T, Aye KS, Kyaw K, Tan EV, Cruz ED et al. The frequency of drug resistance mutations in Mycobacterium leprae isolates in untreated and relapsed leprosy patients from Myanmar, Indonesia and the Philippines. Lepr Rev. 2007; 78: 343–52. (26) Parashar D, Chauhan DS, Sharma VD, Katoch VM. Applications of real-time PCR technology to mycobacterial research. Indian J Med Res. 2006; 124: 385–98. (27) Ramasoota P, Wongwit W, Sampunachot P, Unnarat K, Ngamying M, Svenson SB. Multiple mutations in the rpoB gene of Mycobacterium leprae strains from leprosy patients in Thailand. Southeast Asian J Trop Med Public Health. 2000; 31: 493–7. (28) Roche PW, Shrestha N, Thomas A, Honore N, Cole ST. Rapid detection of resistance to rifampicin in Mycobacterium leprae. 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Simultaneous detection of Mycobacterium leprae and its susceptibility to dapsone using DNA heteroduplex analysis. J Clin Microbiol. 2001; 39(6): 2083–8. (34) Williams DL, Gillis TP. Molecular detection of drug resistance in Mycobacterium leprae. Lepr Rev. 2004; 75: 118–30. (35) de Wit MY, Faber WR, Krieg SR, Douglas JT, Lucas SB, Montreewasuwat N et al. Application of a polymerase chain reaction for the detection of Mycobacterium leprae in skin tissues. J Clin Microbiol. 1991; 29: 906–10. (36) Woods SA, Cole ST. A rapid method for the detection of potentially viable Mycobacterium leprae in human biopsies: a novel application of PCR. FEMS Microbiol Lett. 1989; 53(3): 305–9. (37) You EY, Kang TJ, Kim SK, Lee SB, Chae GT. Mutations in genes related to drug resistance in Mycobacterium leprae isolates from leprosy patients in Korea. J Infect. 2005; 50: 6–11. (38) Zhang L, Namisato M, Matsuoka M. A mutation at codon 516 in the rpoB gene of Mycobacterium leprae confers resistance to rifampin. Int J Lepr Other Mycobact Dis. 2004; 72: 468–72. Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 2017 23 Documentos OMS (1) Global Leprosy Strategy 2016–2020.“Accelerating towards a leprosy-free world”. NewDelhi: World Health Organization Regional Office for South-East Asia; 2016. (2) Global Leprosy Strategy 2016–2020.“Acceleratingtowardsaleprosy-freeworld” – Operational Manual. New Delhi: World Health Organization Regional Office for South-East Asia; 2016. (3) Global Leprosy Strategy 2016–2020. “Accelerating towards a leprosy-free world” – Monitoring and Evaluation Guide. New Delhi: World Health Organization Regional Office for South-East Asia; 2017. (4) World Health Organization. Global leprosy update, 2016: accelerating reduction of disease burden. Wkly Epidemiol Rec.2017; 35: 501–19. (5) Resolution WHA67.25. Antimicrobial resistance. In: Sixty-seventh World Health Assembly, Geneva, 19–24 May 2014. Resolutions and Decisions, annexes. Geneva: World Health Organization; 2014 (WHASS1/2014WHA67/2014/REC/25). (6) Surveillance of drug resistance in leprosy: 2009. Wkly Epidemiol Rec. 2010; 85(29): 281–4. (7) Guidelines for global surveillance of drug resistance in leprosy. NewDelhi: WHO Regional Office for South- East Asia; 2009 (http://www.searo.who.int/entity/leprosy/documents/SEA_GLP_2009_2/en/, accessed 6 July 2017). (8) Global action plan on antimicrobial resistance. Geneva: World Health Organization; 2015 (http://www. who.int/antimicrobial-resistance/global-action-plan/en/, accessed 6 July 2017). Outras publicações (1) Executive summary: Global antimicrobial resistance alerts and implications. Clin Infect Dis. 2005; 41 (Suppl 4): S221–S3. Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 201724 Anexo 1 Laboratórios de referência internacional National Reference Centre on Mycobacteria and Resistance to Anti-tuberculosis Drugs, Assistance publique-Hôpitaux de Paris (APHP) Chefe: Professor Emmanuelle Cambau Hôpital Lariboisière 2 rue Ambroise Paré 75010 Paris France Telefone: +33-1-49956554; Fax: +33-1-49958537 Email: emmanuelle.cambau@aphp.fr Global Health Institute Chefe: Professor Stewart Cole École Polytechnique Fédérale de Lausanne Station No.15 CH-1015 Lausanne Switzerland Telefone: +41-919-6817760; Fax: +41-919-6817748 Email: stewart.cole@epfl.ch Leprosy Research Center Chefe: Dr Yuji Miyamoto National Institute of Infectious Diseases 4-2-1Aoba-cho,Higashimurayama-shi Tokyo189-0002 Japan Telefone: +81-42-3918211; Fax: +81-42-3949092 Email: yujim@niid.go.jp National Hansen’s Disease Program Laboratory Research Branch Chefe: Dr Rahul Sharma Department of Health and Human Services Health Resource Administration, Health System Bureau, SVM-LSU, RM 3517W, Skip Bertonma Dr. Baton Rouge, LA 70803 United States of America Telefone: +1-225-5789839; Fax: +1-225-5789856 Email: RSharma1@hrsa.gov Anexos Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 2017 25 Anexo 2 Registro nacional de resistência às drogas de hanseníase Nome Sobrenome Número do registro de hanseníase Tipo de paciente (novo/ retratamento) Tipo de retratamento Data de início do tratamento PQT Nome e localização da unidade de tratamento Data de coleta da amostra Nome e localização da unidade coletora da amostra Região de coleta da amostra de pele Índice Baciloscopico (IB) dos esfregações intradérmico laboratório nacional Resultados laboratório nacional Resultados PCR laboratório nacional Resultados PCR laboratório de referência Resultados seq Rifampicina laboratório nacional Resultados seq Rifampicina laboratório de referência Resultados seq Dapsona laboratório nacional Resultados seq Dapsona laboratório de referência Resultados seq Ofloxacina laboratório nacional Resultados seq Ofloxacina laboratório de referência Resultados seq Ofloxacina laboratório de referência Regime de tratamento (para casos de resistência a droga) Início do tratamento (para casos de resistência às drogas) Fim do tratamento (para casos de resistência às drogas) Resultados do Tratamento Observações Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 201726 Anexo 3 Formulário1. Formulário de relatório clínico para casos de hanseníase MB a serem testados para resistência às drogas I. Detalhes do relatório Número do registro de hanseníase: _________________________________ País: _______________________________________ Tipo de unidade de saúde reportando: Unidade de Saúde Primária/outro: nome e endereço: ______________________ Unidade Sentinela: nome e endereço: _______________________________ Data do relatório (DD/MM/AAAA): ____/____/_______ Data de coleta do espécime (DD/MM/AAAA): ____/____/_______ II. Informações Demográficas e histórico médico do caso Data de Nascimento: _____________ Sexo: M/F Nacionalidade ou país de residência do paciente: ___________________ País de origem: _______________________________ Consentimento do Paciente para participação: Sim/Não(Se optar por não, ignorar os próximos passos) Quimioprofilaxia: Sim/Não Se sim, qual droga foi prescrevida: __________________________ Tratamento prévio para TB: Sim/Não Tratamento prévio com o f l o xa c ina ou outras quinolonas por mais de um mês: Sim / Não III. Classificação do caso Novo Retratamento: Retreatmentoapós perda do acompanhamento Reincidência Transferido Outro retratamento Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 2017 27 IV. Histórico de tratamento (somente para casos de retratamento) Tratado com PQT, ano: Tratado com rifampicina, dapsona, clofazimina (exceto em PQT), ano: Tratado com outras drogas: especificar V. Apresentação clínica no momento do encaminhamento para teste de resistência Características clínicas: __________________________________________________ ___________________________________________________________________ Número de lesões na pele: ___________ Resultados do esfregaço intradérmico de regiões específicas (se houver, juntamente com a data do teste): 1. Região: _____________ Data do esfregaço: ___/___/______ 2. Região: _____________ Data do esfregaço: ___/___/______ 3. Região: _____________ Data do esfregaço: ___/___/______ Classificação da doença: A: (MB/PB) B: Ridley–Jopling – (BB/BT/TT/BL/LL) VI. Tipo de amostra Biópsia, número de amostras: ____________ Região de coleta: ____________ Esfregaço intradérmico, número de amostras: _________ Região de coleta: ____________ Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 201728 Anexo 4 Formulário 2. Relatório do laboratório de testes Nome do laboratório de teste: ____________________________________________ _______________________________________________________________________ Endereço: ______________________________________________________________ _______________________________________________________________________ Telefone: _________________ Fax: _______________ Email: ___________________ Identificação do CasoCase identification Número do registro de hanseníase: Iniciais do caso: Idade: Sexo: Nome do instituto que enviou a espécime: _______________________________________________________________________ Endereço: ________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ Telefone: __________________ Fax: ______________ Email: _____________________________________________ Tipo de caso: Novo Retratamento Data de aceite: _____/_____/________ (dd/mm/aa) Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 2017 29 Tipo de amostra recebida: biópsia, esfregaço intradérmico (Circule ambos se mais de um tipo de amostra for recebido) Resultados do sequenciamento Gene rpoB (rifampicina) PCR negativa (outra PCR testada: __________________) Sem mutação (não reportar mutação silenciosa) Presença de uma mutação conhecida por conferir resistência às drogas mutação de nucleotídeos (X para Y no nucleotídeo Z*) ____________ substituição do aminoácido (A para B na posição C*): _____________ Presença de outra mutação (A para B na posição C*) Gene folP1(dapsona) PCR negativa(outra PCR testada: __________________) Sem mutação(não reportar mutação silenciosa) Presença de uma mutação conhecida por conferir resistência às drogas mutação de nucleotídeos (X para Y no nucleotídeo Z*) ____________ substituição do aminoácido (A para B na posição C*): _____________ Presença de outra mutação (X para Y na posição Z*) Gene gyrA (ofloxacina) PCR negativa (outra PCR testada:__________________) Sem mutação (não reportar mutação silenciosa) Presença de uma mutação conhecida por conferir resistência às drogas mutação de nucleotídeos (X para Y no nucleotídeo Z*) ____________ substituição do aminoácido (A para B na posição C*) : ____________ Presença de outra mutação (X para Y na posição Z*) *sistema de numeração da sequência do genoma do Microbacterium leprae TN (número de acesso do NCBT AL4550380.1) Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 201730 Nome do biólogo correspondente (e assinatura) Assinatura Data do relatório: ___/___/________ (dd/mm/aa) Nota: A presença ou ausência de mutações conhecidas por conferir resistência às drogas deve ser reportada da seguinte maneira: • “nenhuma mutação conhecida por conferir resistência” se essas mutações não forem encontradas e a sequência apresentar códons do tipo selvagem; • “presença de mutações conhecidas por conferir resistência” se pelo menos uma dessas mutações for observada. A substituição (por exemplo Ser456Leu) deve ser indicada com base no sistema de numeração do genoma do Mycobacterium leprae da sequência TN (ver Tabela 1 e Fig. 4); • “outra mutação missense”: pode ser uma nova mutação ou uma mutação descrita anteriormente, mas sem conhecimento de resistência. A mutação deve ser indicada de acordo com a substituição (por exemplo, Lys411Asn), com a mudança de nucleotídeos entre parênteses (por exemplo, aaa para aac) com base no sistema de numeração do genoma do Micobacterium leprae da sequência TN (ver Figura 4). Sequências de DNA correspondentes e dados relativos à descrição de novas mutações também serão enviados para um banco de dados comum localizado na Ecole Polytechnique Federale de Lausanne • não reportar mutações silenciosas, por exemplo as mutações que não alteram o aminoácido. Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 2017 31 Anexo 5 Formulário de relatório para resultados de tratamento de casos resistentes Detalhes do relatório • Número de registro de hanseníase: ______________ • Iniciais/sexo: M/F /idade (em números) • Tipo de caso Novo Retratamento (tipo de retratamento) • Data do relatório:__ / __ / ____ (dd/mm/aa) • Data de conclusão do tratamento:__ / __ / ____ (dd/mm/aa) Tipo de resistência • Rifampicina somente • Dapsona somente • Ofloxacina somente • Rifampicina + dapsona • Rifampicina + dapsona+ ofloxacina • Rifampicina + ofloxacina • Dapsona+ ofloxacina Tratamento prescrito por: Dr: _____________________________ Nome da unidade de saúde: ________________________ Regime de tratamento prescrito • MB-PQT Opção A: 400 mg de ofloxacina + 100 mg de minociclina + 50 mg de clofazimina, diariamente durante 6 meses, seguido de 400 mg de ofloxacina + 50 mg de clofazimina diariamente durante 18 meses. ou Opção B: 400 mg de ofloxacina + 100 mg de minociclina + 50 mg de clofazimina, diariamente durante 6 meses, seguido de 100 mg de minociclina + 50 mg de clofazimina diariamente durante 18 meses • Outro tratamento (Especificar): Resultados do tratamento • Tratamento concluído • Faleceu • Abandonou o acompanhamento • Transferido para outra unidade • Resposta insatisfatória ao tratamento Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 201732 Anexo 6 Protocolos Laboratoriais 1. Extração de DNA Protocolo A para amostras de esfregaço intradérmico : método do tampão de lise (adaptado de de Wit 1991; J Clin Microbiol. 1991; 29: 906–10) • Centrifugue de 10 a 20 minutos na velocidade máxima (deve ser superior a 15 000 x g). • Descarte o sobrenadante. Resuspender o precipitado em tampão fosfato-salino (PBS). • Deixe repousar por mais de 30 minutos antes de suspender no PBS. • Centrifugue de 10 a 20 minutos na velocidade máxima. • Ressuspender o sedimento em 50 µl de tampão de lise *. Sobreponha óleo mineral para evitar a evaporação do tampão. • Incubar durante a noite a 60 °C. • Aquecer durante 10 min a 97 °C para inativar a proteinase K. • Transfira para um tubo de DNA low-binding, tal como o DNA LoBind da Eppendorf. *Tampão de lise Solução padrãoI: proteinaseK 1mg/mL em100mM Tris-HCl,pH 8,5 Solução padrãoII:0.5% Tween20 Misture 1 volume de Solução padrão I e 1 volume de Solução padrão II Diluir 5 vezes com Tris-HCl 100 mM, pH. 8,5 ou em água destilada Normalmente, 100 µL da solução padrão I e II são misturados com 800 µL de Tris-HCl 100 mM, pH 8,5 ou em água destilada. Protocolo B para amostra de biópsia: método de congelamento-ebulição (adaptado de Woods, 1989) • Se armazenado em 70% etanol, coloque os tubos abertos dentro de um armário de biosegurança para o etanol evaporar, até que a biópsia esteja seca (24-48 horas). Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 2017 33 • Pique a biópsia da pele e triture-a com esferas de vidro para obter a suspensão da biópsia na solução de Hanks ou outro tampão/água estéril. • Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 2017 • Após inativação a 95°C por 30 minutos, o DNA é extraído da seguinte forma: 200 µL da suspensão da biópsia é submetida a 5 séries de choques térmicos, alternadamente fervendo (1 minuto a 100°C) e congelando (1 minuto em gelo seco) a suspensão da biópsia. E então incube a 95°C por 15 minutos seguindo por uma imersão em banho ultrassônico (Branson) por 15 minutos, se possível. Protocolo C para amostra em cartão FTA • Retire um disco de amostra de 3 mm do centro do esfregaço usando a punção da biópsia • Transfira para um tubo de 1.5mL. • Adicione 500 µl de H2O estéril para o tubo e imediatamente pulse vórtex 3 vezes, por um total de 5 segundos. • Usando uma técnica estéril, transfira o disco imediatamente para um tubo de microcentrífuga contendo 30 µL de H2O estéril. Assegure-se de que o disco está completamente imerso pela H2O ao brevemente centrifugar o tubo por 10 segundos. • Transfira o tubo para um bloco de aquecimento a 95 °C por 15-30 minutos. • No final do período de incubação, retire a amostra do bloco e pulse vórtex, ou bata levemente na amostra aproximadamente 60 vezes. Protocolo D para amostra de esfregaço cutâneo DNeasy e sangue e tecido (Qiagen) • Amostras de esfregaço cutâneo são suspensos em 70% etanol em centrifugação por 10-20 minutos na velocidade máxima (deve ser mais de 15 000 x g). • Descarte o sobrenadante. Resuspenda o precipitado em 500 µL de PBS. Deixe descansar por mais de 30 minutos e substitua o etanol por PBS. • Centrifugue por 10-20 minutos na velocidade máxima. • Suspenda uma porção da amostra em 180 µL de tampão enzimático de lise. • Incube por pelo menos 30 minutos a 27 °C. • Adicione 25 µL de proteinase K e 200 µL de tampão AL (sem etanol). Misture no vórtex. Incube a 56 °C por 30 minutos. Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 201734 • Adicione 200 µL de etanol (96-100%) na amostra, e misture de maneira homogênea na vórtex. • Pipete a mistura na coluna da minispin DNeasy em um tubo de coleta de 2 mL. Centrifugue em >6000 x g por 1 minuto. Discarte o escoamento e o tubo de coleta. • Coloque a coluna DNeasy minispin em um novo tubo de coleta de 2 mL, adicione 500 µL de tampão AW1 e centrifugue por 1 min em > 6000 x g por 1 minuto. Descarte o escoamento e o tubo e coleta. • Coloque a coluna DNeasy minispin em um novo tubo de coleta de 2 mL, adicione 500 µL de tampão AW2 e centrifugue por 3 min em > 20000 x g por 3 minutos para secar a membrana DNeasy. Descarte o escoamento e o tubo e coleta. • Coloque a coluna DNeasy minispin em um tubo limpo de microcentrífuga de 1.5 mL ou 2 mL, e pipete 200 µL de tampão AE diretamente na membrana de DNeasy. Incube em temperatura ambiente por 1 minuto, e então centrifugue por 1 minuto em >600 x g para eluir. 2. Sequenciamento de PCR (a) Protocolo interno para sequenciamento de Mistura de PCR: 12.5 µL de PCR master mix (2X) 0.5 µl de Taq polymerase 1.25 µL de forward primer em uma concentração final de 0.5 µM 1.25 µL de primer reverso em uma concentração final de 0.5 µM 5.0-7.5 µL de água para um volume final de 25 µL 2.5-5.0 µL de modelo de DNA Ciclo térmico: Desnaturar a 95 ° C por 30 segundos Denaturar a 95 ° C por 15 segundos Ligar os primers a 57 ° C por 15 s 40 ciclos Extender a 72 ° C por 60 s Extensão final a 72 ° C por 7 minutos Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 2017 35 Fonte: Diretrizes para vigilância global da resistência às drogas em hanseníase. Nova Delhi; Escritório Regional da OMS para o Sudeste Asiático, 2009 (Ilustrado pelo Dr. M. Matsuoka) Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 201736 Protocolo interno de reação em sequenciamento Mistura para reação de sequenciamento de PCR 1–3 µL (1–3 ng de 100–200 bp) produtos de PCR purificados 20 µL de água destilada, acrescente até completar volume total 4 µL Bigdye terminator Ver 1.1 2µL de tampão 5XSEQ 1 µL 3.3 M primer (mesmo primer usado para PCR é diluído 6X) Reação do ciclo térmico Ciclo 1: 96 °C por 30 s Cycle 2: 96 °C por 10 s Cycle 3: 50 °C por 10 s Cycle 4: 60 °C por 3 min Repita o ciclo 2–4 25 vezes Purificação de produtos de reação de sequenciamento (por exemplo, cartucho de filtração em gel Performa DTR) Preparação de amostras para sequenciamento Adicione 25 µL de reagentes HI (Applied Biosystems) aos tubos de amostra para resolver os produtos de sequenciação secos. Vórtex completamente e gire para baixo. Transfira a amostra para tubos de amostra para sequenciamento. Aqueça por 2 min a 95 °C e, em seguida, resfrie rapidamente em água gelada; gire para baixo. Pronto para aplicar ao sequenciador após ressuspensão no tampão de carregamento. b) Kit comercial padronizado GenoType LepraeDR v1.0 para sequenciamento por PCR (fabricado pela Hain Lifesciences, http://www. hain-lifeescience.de/en/) Após a extração de DNA (veja os protocolos acima), o procedimento é uma amplificação multiplexa de regiões determinantes da resistência às drogas (DRDRs) em rpoB, folP1 e gyrA com primers biotinilados seguidos por uma hibridização reversa (teste de fita de DNA usando amplificação por PCR (ensaio de linha de sonda). O kit contém todos os reagentes para PCR multiplex e hibridização, incluindo controles de qualidade internos, mas a polimerase de DNA Hotstart Taq termoestável precisa ser fornecida separadamente. Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 2017 37 O primer nucleotide mix (PNM) contém primers biotinilados para a amplificação de regiões específicas do genoma bacteriano. As tiras de membrana são revestidas com sondas específicas complementares aos ácidos nucleicos amplificados. Após desnaturação química, os amplicons de fita única se ligam às sondas (hibridização). A ligação altamente específica de cadeias de DNA complementares é assegurada por condições rigorosas que resultam da combinação de composição de tampão e uma certa temperatura. Assim, as sondas discriminam com segurança muitas variações de sequência nas regiões gênicas examinadas. A fosfatase alcalina conjugada com estreptavidina liga- se à biotina dos amplicons através da metade da estreptavidina. Finalmente, a fosfatase alcalina transforma um substrato adicionado em um corante, que se torna visível nas tiras de membrana como um precipitado colorido. Um modelo garante a interpretação fácil e rápida do padrão de bandas obtido. Cada fita de DNA inclui cinco zonas de controle: • uma zona de controle conjugada (CC) para verificar a ligação do conjugado na tira e uma reação cromogênica correta • uma zona de controle universal (UC) que detecta, até onde se sabe, todas as micobactérias e membros do grupo de bactérias Gram-positivas com alto conteúdo de G+C • três zonas de controle de locus (rpoB, gyrA e folP1) que verificam a sensibilidade ideal da reação para cada um dos locos gênicos testados. Fig. 5. Fita de DNA do kit GenoType LepraeDR (A) Esquema da fita. (B) Exemplos de fitas de DNA (A) Esquema da fita e detalhes das sondas Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 201738 Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 2017 39 (B) Exemplos de fitas de DNA c) Sequenciamento do genoma completo para encontrar mutações de resistência às drogas Para fins de sequenciamento, o DNA pode ser extraído de biópsias de pele humana de BI conhecido usando o seguinte protocolo personalizado que remove a maior parte do DNA hospedeiro, seguido por lise das bactérias e purificação do DNA do M. leprae em colunas de sílica. Biópsias de punção (6 mm) em etanol a 70% são primeiro reidratadas em 500 µl de solução balanceada de Hank e, em seguida, picadas com uma tesoura ou rompidas por esferas de zircônio de 2,8 mm (Bertin Technology, França). Cada execução de extração pode incluir um lote de 5 a 9 amostras e um controle em branco. Para digerir a pele e o tecido humano, a amostra é incubada com uma mistura de 0,5 U de colagenase e dispase (Roche, Suíça) por 30 min a 37 ° C; as células liberadas são recolhidas num tubo separado e o tecido restante é digerido por incubação com tripsina em PBS (10 mg / mL) a 56 ° C até à digestão completa. As células liberadas são reunidas e centrifugadas durante 10 min a 10 000 g antes da ressuspensão em 1 mL de PBS. As células são lisadas com 500 µL de tampão AHL (kit de microbioma QIAmp, Qiagen) durante 30 min em temperatura ambiente com rotação end-over-end. A mistura é então centrifugada durante 10 min a 10 000 g e ressuspensa em 190 µl de tampão RDD. Em seguida, 2,5 µl de benzonase são adicionados para remover o DNA hospedeiro (QIAmp microbiome kit, Qiagen) incubando a 37 ° C por 30 min. Em seguida, a mistura é tratada com proteinase K (20 mg / mL) a 56 ° C por 30 min para inativar a DNAase. As células bacterianas são então lisadas mecanicamente por batimento de esferas e enzimaticamente usando tratamento com proteinase K (20 mg / mL) de acordo com as recomendações do fabricante antes da purificação do DNA em colunas baseadas em sílica (Qiamp microbiome kit, Qiagen). Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 201740 Em seguida, as amostras de DNA são sonicadas para obter fragmentos de 400 pb usando um instrumento Covaris S220. As bibliotecas Illumina são preparadas usando o kit Kapa Hyper Prep (Kapa Biosystem, MA, EUA) e PentAdpters (Pentabases, Dinamarca) ou adaptadores indexados Illumina. Os fragmentos são selecionados antes da amplificação usando grânulos AMPUre com uma razão de 0,5X para o primeiro e 0,2X para a segunda seleção. A concentração de adaptadores indexados e o número de ciclos de amplificação são adaptados em relação à concentração inicial de DNA de acordo com as instruções do fabricante (Kapa Biosystem, MA, EUA). Após o controle de qualidade (a concentração da biblioteca e o tamanho são determinados usando um analisador de fragmentos), as bibliotecas podem ser multiplexadas e sequenciadas como leituras de 100 bases simples em um instrumento Illumina HiSeq 2500 (https://www.illumina.com). As leituras brutas são então adaptadas e ajustadas com qualidade usando o Trimmomatic v0.33 (Bolger et al. 2014) e mapeadas no genoma de referência do M. leprae TN (número de acesso do NCBI AL450380.1) com Bowtie2 (versão 2.2.5; Langmead e Salzberg 2012) seguido de uma chamada variante usando o VarScan v2,3,9 (Koboldt et al. 2012) ou outros programas de mapeamento. Os polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) podem ser chamados após a aplicação de verificações de qualidade, ou seja, uma cobertura geral mínima de cinco leituras não duplicadas, um mínimo de três leituras não duplicadas suportando o SNP, um índice de qualidade de mapeamento >8, um índice de qualidade base >15 e uma frequência de SNP acima de 80%. Esses pontos de corte são escolhidos para evitar resultados falso-positivos. Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 2017 41 Anexo 7 Protocolo de vigilância sentinela Cálculo do tamanho da amostra. O tamanho da amostra (n) será calculado com base no nível de resistência esperado conforme a fórmula e explicações relacionadas abaixo: n where: N = número médio anual de novos casos de hanseníase MB registrados no site sentinela nos últimos cinco anos Z = valor z (da distribuição normal padrão) que corresponde ao nível de confiança desejado (estreitar o intervalo de confiança de 95% a 90% resultará em algumas reduções no tamanho da amostra; se o intervalo de confiança for 95%, então z = 1,96 e em 90%, z = 1,65); d = precisão absoluta (como um decimal 0.01 ou 0.02, significando um erro dentro de 1% ou 2% da proporção verdadeira); g = estimativa anterior da proporção de novos casos com resistência à rifampicina x (1 + mudança antecipada na estimativa anterior). A mudança antecipada pode ser considerada como a mudança que o sistema sentinela deve ser capaz de detectar. Essa alteração é expressa como um decimal, com um prefixo negativo (-) se uma diminuição for antecipada e um prefixo positivo (+) se um aumento for antecipado. Por exemplo, um aumento de 4% em relação à estimativa anterior seria expresso como uma mudança antecipada de +0,04; assim g = estimativa anterior x (1 + 0,04) = estimativa anterior x 1,04. Similarmente, se uma redução de 10% é antecipada do nível de resistência anterior no ano corrente, então g = estimativa anterior x (1-0,04) ou g = estimativa anterior x (0,96). Sugere-se dobrar o tamanho da amostra calculado com a fórmula. Isso é feito para neutralizar o efeito de design e aumentar a precisão do esquema de amostragem (um tamanho de amostra grande o suficiente para detectar mudanças antecipadas em uma escala maior, considerando a incerteza do nível de resistência da linha de base e a falta de tendência conhecida na maioria dos países). Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 201742 Para os países em que o nível basal de resistência não é conhecido, 10% do total de novos casos de hanseníase MB detectados por ano serão testados em um laboratório nacional ou internacional. Seleção da amostra. Depois de corrigir o tamanho da amostra, a próxima questão é como selecionar a amostra dos casos novos de MB. O primeiro passo a ser dado é identificar o número de distritos endêmicos atendidos pelos sítios-sentinela e, em seguida, alocar o número de amostras a serem selecionadas de cada um desses distritos de acordo com o número médio de novos casos de MB registrados nos últimos cinco anos. Depois de calcular o número de amostras a serem retiradas de cada municipio endêmico, as amostras devem ser selecionadas pelo esquema sistemático. Um guia passo-a-passo é dado abaixo: • Suponha que a fórmula mencionada acima retornou um tamanho de amostra de 20; depois, aumentando o tamanho da amostra digamos 50%, ou seja, 50% de 20 = 10, o tamanho total da amostra será 20 + 10 = 30. • Além disso, suponha que o site sentinela abrange apenas dois distritos, A e B, com um número médio de novos casos de MB de 150 e 250 (37,5% e 62,5% do total de casos de MB), respectivamente. Agora, um total de 30 amostras precisam ser distribuídas entre esses dois distritos proporcionalmente ao número médio de novos casos de MB. Isso implica que, do distrito A, 11 amostras precisam ser testadas, enquanto do distrito B, 19 amostras precisam ser testadas. • Para desenhar uma amostra sistemática circular do distrito A, temos que descobrir o inteiro k mais próximo, que pode ser obtido conforme abaixo: k = 150 = -------- 11 = 13.66 = 14 (aproximadamente) Agora, selecione um número aleatório entre 1 e 14. Digamos que seja 12; em seguida, selecione cada décimo segundo paciente da lista de novos pacientes MB registrados no ano atual e essa será sua primeira amostra do distrito A; agora, selecione a segunda amostra adicionando k (14) a ela, ou seja, 12 +14 = 26, o número de série do paciente 26 será o segundo e o número de série do paciente 40 será a terceira amostra. Da mesma forma, o número de série do paciente 124 será o nono e o número de série 138 será a décima amostra. No entanto, agora 138 + 14 = 152, e existem apenas 150 pacientes. Então a Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 2017 43 décima primeira amostra será 152 - 150 = 2, ou seja, o paciente com o número de série 2 no começo será a décima primeira amostra. Da mesma forma, uma amostra para o distrito B pode ser feita. Outro exemplo de um esquema de amostragem sistemática circular é dado com N = 14 em = 5. Então k = número inteiro mais próximo. Digamos que o primeiro número selecionado aleatoriamente de 1 a 14 seja 7. Então, a amostra sistemática circular consiste em unidades com números de série 7, 10, 13, 16 - 14 = 2, 19 - 14 = 5. Por favor, note que a conclusão tirada sobre resistência refere-se apenas às áreas que o site sentinela está cobrindo. Um guia para vigilância da resistência antimicrobiana na hanseníase: atualização 201744 Anexo 8 Manejo clínico de casos resistentes detectados Todos os casos incluídos na vigilância devem ser imediatamente colocados em tratamento com a terapia multidroga padrão (PQT) logo após a coleta da amostra, sem esperar pelos resultados do laboratório de referência sobre o status da resistência as drogas. Embora a PGH esteja preparando as diretrizes sobre o tratamento da hanseníase, inclusive para casos resistentes, até o momento, a única orientação sobre tratamento de casos resistentes pode ser encontrada no relatório da Oitava Reunião do Comitê de Especialistas em Hanseníase, realizada em Genebra, em Genebra. 2010. De acordo com o relatório, o seguinte é uma orientação sobre o possível manejo clínico de casos resistentes. • Se os resultados mostrarem uma tensão sensível, o tratamento com MB-PQT deve ser continuado. • Para os pacientes que são relatados como resistentes apenas à dapsona, a MB- PQT padrão pode ser continuada, mas o paciente deve ser observado no final do tratamento e regularmente examinado para possível recaída. • Para pacientes com resistência apenas às quinolonas, a PQT deve ser continuada. • No caso de o laboratório de referência relatar o M. leprae resistente à rifampicina, um dos seguintes regimes de tratamento deve ser prescrito: 400 mg de ofloxacina + 100 mg de minociclina + 50 mg de clofazimina, diariamente durante 6 meses; seguido por 400 mg de ofloxacina OU 100 mg de minociclina + 50 mg de clofazimina diariamente por mais 18 meses. O regime de tratamento acima mencionado é obrigatório para pacientes portadores de M. leprae resistente à rifampicina e à dapsona. Para os casos resistentes à rifampicina, mas suscetíveis à dapsona, o regime de tratamento acima também é sugerido. Alternativamente, um regime de tratamento que inclua dapsona pode ser discutido com o centro nacional de referência. É obrigatório relatar resultados de tratamento de pacientes com hanseníase detectados com drogas resistentes através do formulário do Anexo 5 (seja em cópia impressa ou eletrônica) e enviá-los ao Programa Nacional de Hanseníase para que as informações possam ser inseridas no registro de resistência à drogas.
9 7 8 9 2 9 0 2 2 6 1 9 2 ISBN 978-92-9022-619-2 La red actual para la vigilancia de la resistencia a los medicamentos contra la lepra ha sido dirigida por la Organización Mundial de la Salud (OMS) desde 2008 con el apoyo financiero de The Nippon Foundation inicialmente y de las American Leprosy Missions y la Fondation Raoul Follereau en años recientes. Esta Guía ha sido preparada por el Programa Mundial de Lepra (GLP) de la OMS. Amplía el alcance de la vigilancia para incluir también nuevos casos de lepra. También se han incorporado las nuevas definiciones de caso de la Guía de monitoreo y evaluación de la Estrategia mundial para la lepra (2016-2020). La guía de vigilancia antimicrobiana promueve una cobertura mucho más amplia de las pruebas de acuerdo con la importancia general otorgada a la resistencia antimicrobiana (RAM) como se describe en la Estrategia mundial para la lepra 2016-2020. En 2015, la Asamblea Mundial de la Salud aprobó la Resolución WHA68.20 para abordar la RAM, por lo que se identificó la necesidad de una mayor atención y mejores sistemas de vigilancia, incluida la lepra. Por estas razones, GLP, en colaboración con socios clave y partes interesadas, ha preparado esta Guía como una actualización de las Directrices para la vigilancia mundial de la farmacorresistencia en la lepra (2009). Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra Actualización 2017 Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra Actualización 2017 Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: actualización 2017 ISBN: 978 92 9022 643 7 © Organización Mundial de la Salud (“World Health Organization”) 2018 Algunos derechos reservados. Este trabajo está disponible bajo la licencia ‘Creative Commons’ Reconocimiento-No comercial-Compartir-Igual 3.0 IGO licencia (CC BY-NC-SA 3.0 IGO; https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/igo). De conformidad con los términos de esta licencia, puede copiar, redistribuir y adaptar el trabajo para fines no comerciales, siempre que el trabajo esté debidamente citado, como se indica a continuación. En cualquier uso de este trabajo, no debe sugerirse que la OMS respalde una organización, productos o servicios específicos. El uso del logotipo de la OMS no está permitido. Si adapta el trabajo, debe licenciar su trabajo bajo la misma licencia ‘Creative Commons’ o la equivalente. Si crea una traducción de este trabajo, debe agregar la siguiente exención de responsabilidad junto con la cita sugerida: “Esta traducción no fue creada por la Organización Mundial de la Salud (OMS). La OMS no es responsable del contenido o la precisión de esta traducción. La edición original en inglés será la edición vinculante y auténtica”. Toda mediación relacionada con las disputas que surjan en virtud de la licencia se llevará a cabo de conformidad con las normas de mediación de la Organización Mundial de la Propiedad Intelectual. Cita sugerida. Una guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos en la lepra: actualización de 2017. Nueva Delhi: Organización Mundial de la Salud, Oficina Regional para Asia Sudeste; 2017. Licencia: CC BY-NC-SA 3.0 IGO. Datos de catalogación en la publicación (CIP). Los datos de CIP están disponibles en http://apps.who.int/iris. Ventas, derechos y licencias. Para comprar publicaciones de la OMS, consulte http://apps.who.int/ bookorders. Para enviar solicitudes de uso comercial y consultas sobre derechos y licencias, consulte http://www.who.int/about/licensing. Materiales de terceros. 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La mención de empresas específicas o de productos de ciertos fabricantes no implica que sean respaldados o recomendados por la OMS con preferencia a otros de naturaleza similar que no se mencionan. Se exceptúan los errores y las omisiones, los nombres de los productos patentados se distinguen por iniciales en mayúsculas. La OMS ha tomado todas las precauciones razonables para verificar la información contenida en esta publicación. Sin embargo, el material publicado se distribuye sin garantía de ningún tipo, ya sea expresa o implícita. La responsabilidad de la interpretación y el uso del material recaen en el lector. En ningún caso, la OMS será responsable de los daños derivados de su uso. Fotos de portada: Mr Masanori Matsuoka Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 2017 iii Contenido Lista de colaboradores ................................................................................................... iv Abreviaciones y acrónimos .............................................................................................. v Resumen ejecutivo ....................................................................................................... vii 1. Objetivos de la guía y su población objetivo ..........................................................1 2. Antecedentes .........................................................................................................2 3. Justificación para desarrollar la guía ........................................................................3 4. Estrategia mundial contra la lepra 2016-2020 de un vistazo ...................................4 5. Resumen del sistema de vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos ...............5 5.1 Objetivos ......................................................................................................5 5.2 Definiciones .................................................................................................5 5.3 Resistencia entre casos nuevos ......................................................................6 5.4 Resistencia entre los casos de retratamiento ..................................................7 5.5 Esquema para la vigilancia de RAM en lepra .................................................8 6. Establecer o expandir un sistema de vigilancia a nivel nacional ...............................9 6.1 Selección de los laboratorios de prueba involucrados ....................................9 6.2 Selección de laboratorios para fines de control de calidad ...........................10 6.3 Identificación de instalaciones de salud de recolección de muestras ............11 6.4 Cálculo del tamaño de muestra ...................................................................12 6.5 Recolección sistemática de muestras ...........................................................13 6.6 Pruebas de laboratorio ................................................................................15 6.7 Registro sistemático de la información .........................................................20 6.8 Monitoreo de la resistencia a los antimicrobianos ........................................21 Bibliografía ...................................................................................................................22 Anexos 1. Laboratorios internacionales de referencia ...........................................................25 2. Registro nacional de resistencia a los medicamentos contra la lepra .....................26 3. Formulario 1. Formulario de informe clínico para los casos de lepra MB que deben someterse a pruebas de resistencia a los medicamentos ............................27 4. Formulario 2. Informe del laboratorio de prueba ..................................................29 5. Formulario de informe para los resultados del tratamiento de casos resistentes .....32 6. Protocolos de laboratorio .....................................................................................33 7. Protocolo de vigilancia centinela ..........................................................................42 8. Manejo clínico de casos resistentes detectados .....................................................45 Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 2017iv Esta guía fue realizada por la profesora Emmanuelle Cambau, Universidad Paris Diderot, Francia; Dra. Laura Gillini (Programa Global de Lepra); y el Sr. Masanori Matsuoka, Museo Nacional de lepra de Jukanbo, Japón. Otros colaboradores fueron: Dr. Bertrand Cauchoix, Fundación Raoul Follereau, Paris, Francia Profesor Stewart Cole, Escuela Politécnica Federal de Lausana, Suiza Dr. Erwin Cooreman, Programa Global de Lepra, Oficina Regional de la OMS para el Sudeste de Asia, Nueva Delhi, India Dr. Anil Kumar, Programa Nacional de Erradicación de lepra (NLEP), Nueva Delhi, India Dr. V R R Pemmaraju, Programa Mundial contra la Lepra, Oficina Regional de la OMS para el Sudeste de Asia, Nueva Delhi, India Dr. Rupali Roy, Programa Nacional de Erradicación de lepra (NLEP), Nueva Delhi, India Dr. Paul Saunderson, American Leprosy Missions, Noruega Dr. David Scollard, Programa Nacional de Enfermedad de Hansen, Baton Rouge, EE. UU. Dr. Sirenda Vong, Departamento de Información de Emergencia y Evaluación de Riesgos de Salud, Oficina Regional de la OMS para el Sudeste de Asia, Nueva Delhi, India Profesor Aditama Tjandra Yoga, Asesor Especial del Director Regional, Oficina Regional de la OMS para el Sudeste de Asia, Nueva Delhi, India Sr. Rakesh Mani Rastogi, Desarrollo de sistemas de salud, Oficina Regional de la OMS para el Sudeste de Asia , Nueva Delhi, India El borrador final del documento se revisó después de un taller celebrado en Hyderabad (India) del 10 al 11 de agosto de 2017 para analizar un modelo de resistencia a los antimicrobianos de lepra en la India. A este taller asistieron personal de NLEP, incluidos coordinadores de lepra estatales y de distrito, personal de la OMS, expertos del Instituto Jalma de Lepra y Otras Enfermedades Micobacterianas (Agra), la Fundación de Investigación Médica (Mumbai), personal de departamentos de dermatología de nivel terciario hospitales y representantes de ONG (“The Leprosy Mission”, “Netherlands Leprosy Relief”, “Lepra UK”, “American Leprosy Missions”), y tomaron en cuenta los desafíos y enfoques discutidos con los representantes de los países. Lista de colaboradores Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 2017 v AITA Asociación Internacional de Transporte Aéreo DRDR región determinante de la resistencia a la dapsona ETD enfermedades tropicales desatendidas GLASS Sistema Global de Vigilancia de la Resistencia a los Antimicrobianos IB índice bacilar ILEP Federación Internacional de Asociaciones contra la Lepra MB Multi-Bacilar MDE memorando de entendimiento (MOU por sus siglas en inglés de memorandum of understanding) OMS Organización Mundial de la Salud ONG organización no gubernamental PB Pauci-Bacilar PBS salina tamponada con fosfato PCR reacción en cadena de la polimerasa PQT poliquimioterapia PGL Programa Global de Lepra (GLP por su sigla en inglés) QRDR región determinante de la resistencia a la quinolona RAM resistencia antimicrobiana RLEP Elemento repetitivo específico de DNA de M. leprae RRDR región determinante de la resistencia a la rifampicina TB tuberculosis Abreviaciones y acrónimos
Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 2017 vii La aparición de resistencia a los medicamentos es una preocupación y una amenaza para muchos programas de intervención de enfermedades infecciosas, especialmente aquellos que tienen prevención secundaria (quimioterapia) como el componente principal de su estrategia de control. La lucha contra la lepra ha sido un gran éxito, en gran parte debido al desarrollo de la poliquimioterapia (PQT) en 1981. El despliegue de la PQT a finales de la década de 1980 ha sido un factor importante para reducir drásticamente la carga de lepra hasta el año 2005, después de lo cual se observó una meseta en el número de casos en tratamiento y una reducción mucho más lenta en la notificación. Como la rifampicina es la columna vertebral del régimen de PQT, es importante controlar la aparición de cepas resistentes, ya que informes y publicaciones recientes han indicado la existencia de resistencia a rifampicina en varias áreas endémicas. Antes de la introducción de la PQT, los pacientes eran tratados con monoterapia con dapsona durante varios años. La resistencia a la dapsona se ha reportado desde principios de la década de 1960. En caso de resistencia a la rifampicina, las fluoroquinolonas se convierten en la categoría preferida de los medicamentos de segunda línea. Desafortunadamente, cepas de Mycobacterium leprae resistentes a quinolonas también se han reportado en varios países, probablemente debido al amplio uso de las quinolonas para tratar varios tipos de infecciones. La resistencia a la clofazimina sigue siendo rara, pero este antimicrobiano no se puede administrar solo. Para enfrentar el desafío de contener la enfermedad y poder responder a un aumento en la circulación de las cepas resistentes a los medicamentos, es esencial evaluar los patrones de sensibilidad a los medicamentos a nivel mundial, así como monitorear la resistencia entre los casos nuevos y de retratamiento. Resumen ejecutivo
Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 2017 1 Este documento tiene como objetivo orientar a los países sobre cómo evaluar la resistencia a los medicamentos contra lepra. Resalta los sistemas de soporte clínico, de campo y de laboratorio que se deben implementar para llevar a cabo esta actividad. La resistencia a los antimicrobianos (RAM) es una de las áreas clave de intervención de la Estrategia global contra la lepra 2016-2020, en su Pilar II “Detener la lepra y sus complicaciones”. Conforme a esta Estrategia, se espera que todos los países que detecten la lepra establezcan un sistema para permitir las pruebas de RAM, ya sea en un laboratorio nacional o en un laboratorio ubicado en el extranjero. Esta guía tiene como objetivo promover el uso de un doble enfoque estandarizado: (1) detectar la resistencia primaria y secundaria a medicamentos para el tratamiento de lepra, específicamente, rifampicina, dapsona y ofloxacina; (2) estandarizar los informes relacionados con los resultados de las pruebas realizadas y los resultados de tratamiento de los pacientes. La disponibilidad de datos sobre la resistencia a los medicamentos en lepra permitirá un seguimiento a nivel mundial, nacional y sub-nacional de las tendencias de la resistencia a los medicamentos a lo largo del tiempo entre los casos nuevos y de retratamiento de lepra (ver definiciones en la Sección 5.2). También puede ayudar a identificar los factores de riesgo para la resistencia a los medicamentos (edad, sexo, área de residencia, categoría/ tipo del paciente). El público destinatario de la guía actualizada está formado por gerentes de programas nacionales de lepra, clínicos y personal en centros de referencia y sitios centinela, coordinadores de laboratorio y técnicos que trabajan en lepra, así como consultores que trabajan en el campo de lepra y enfermedades tropicales desatendidas (ETD). Objetivos de la guía y su población objetivo 1 Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 20172 La red actual de vigilancia de fármaco-resistencia fue implementada conjuntamente por la Organización Mundial de la Salud (OMS) y la Fundación Nippon, seguida en años posteriores por el apoyo financiero de la Federación Internacional de Asociaciones contra la Lepra (ILEP) entre 2008 y 2016. Los países que participaron en la red de vigilancia centinela fueron: Benín, Brasil, Burkina Faso, China, Colombia, Etiopía, Guinea, India, Indonesia, Madagascar, Malí, Mozambique, Myanmar, Nepal, Níger, Pakistán, Filipinas, Vietnam y Yemen. En 2016 Sri Lanka se unió a la vigilancia de resistencia. Los países que forman parte de la red o prueban muestras en laboratorios nacionales, como es el caso de Brasil (dos laboratorios de prueba), China, Colombia, India (cuatro laboratorios de prueba), Indonesia y Nepal, o envían muestras a los siguientes cuatro laboratorios: Subdivisión de Investigación de Laboratorios de los Programas Nacionales de Enfermedades de Hansen, Baton Rouge, Luisiana, Estados Unidos de América (EE.UU.); Instituto Global de Salud, Escuela Politécnica Federal de Lausana, Suiza; Centro Nacional de Referencia sobre Micobacterias y Resistencia a los Medicamentos Antituberculosos, “Hospital Lariboisière”, París, Francia; y Centro de Investigación de lepra, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, Tokio, Japón. Estos laboratorios se consideran laboratorios internacionales de referencia para la resistencia a los antimicrobianos en la lepra. Los laboratorios de referencia que forman parte de la red en 2017 se enumeran en el Anexo 1. Algunos de los laboratorios nacionales están ubicados dentro de hospitales y / o instituciones gubernamentales, mientras que otros se encuentran en hospitales administrados por organizaciones no gubernamentales (ONG). El apoyo de la OMS / ILEP a los laboratorios consiste en proporcionar fondos a algunos de los laboratorios internacionales (Lausana y París) y financiar una reunión bianual organizada por la OMS para analizar los resultados y los métodos de laboratorio. El costo de las pruebas a nivel nacional corre a cargo de gobiernos nacionales u ONG internacionales. La red se hizo funcional en 2008 después de la identificación de mutaciones asociadas con la resistencia a los medicamentos en loci- genómicos específicos de ‘Mycobacterium leprae’, lo que confiere resistencia a dapsona, rifampicina y ofloxacina. Inicialmente, solo se recomendaron pruebas para casos de recaída para evaluar el nivel de resistencia secundaria y los resultados correspondientes se publicaron en el registro epidemiológico semanal (la publicación más reciente fue en junio de 2011: Wkly Epidemiol Rec. 2011; 23 (86): 2334). Las primeras directrices sobre la vigilancia de la fármacoresistencia en lepra se publicaron en 2009 (Directrices para la vigilancia mundial de la fármacoresistencia de lepra. Nueva Delhi: Oficina Regional de la OMS para Asia Sudoriental; 2009). Antecedentes2 Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 2017 3 Esta guía ha sido desarrollada por el Programa Global de Lepra (PGL) de la OMS en coordinación con los principales interesados en lepra. Desde 2011, algunos países ya han comenzado a estudiar aislamientos obtenidos de casos nuevos de lepra para resistencia a los medicamentos, además de aislamientos de los casos de recaída para poder evaluar el nivel de resistencia primaria. Además, la dificultad de cumplir con la definición de recaída fue una barrera para probar la resistencia secundaria. Esto puede cambiar a la luz de las nuevas definiciones de casos de lepra incluidas en la Estrategia global contra la lepra 2016- 2020: Guía de seguimiento y evaluación (ver también la sección 5.2). Los laboratorios que participan en la red fueron evaluados por la calidad de la amplificación genómica por el laboratorio internacional de referencia en Japón en 2009 y 2011 con buena concordancia. Cada uno de los laboratorios implicados utiliza sus propias técnicas, como la secuenciación directa de los productos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), el análisis de tira de ADN, el análisis de fusión de alta resolución o la secuenciación del genoma completo. La detección de RAM en lepra no se ha estandarizado hasta el momento. Las muestras recolectadas consistieron en frotis de piel (según las pautas de 2009); en años posteriores, también se recogieron y analizaron biopsias de piel. Todos los datos recopilados a nivel mundial de 2010 a 2015 se sintetizaron durante la Consulta mundial sobre la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos en octubre de 2016. Se recibieron informes formales sobre un total de 1086 casos de recaída y 776 casos nuevos probados a nivel mundial antes de finales de 2015, entre ellos la resistencia a la rifampicina se identificó en 57 casos de recaída (5,2% de resistencia secundaria) y 16 casos nuevos (2,1% de resistencia primaria). Estos resultados señalaron la necesidad de ampliar la red de vigilancia no solo en términos de laboratorios y países involucrados, sino también en términos de alcance, aumentar el número de muestras analizadas del total de casos detectados e implementar un modelo de vigilancia continua para la resistencia secundaria. Esto también está en consonancia con el espacio que se ha otorgado a la RAM en la lucha contra la lepra como una de las áreas clave de intervención en el marco de la Estrategia Global contra la Lepra 2016-2020. La Asamblea Mundial de la Salud emitió una resolución sobre RAM en 2015 (WHA 68.20) junto con un plan de acción global; por lo tanto, esta importancia otorgada bajo la Estrategia Global contra la Lepra se ajusta a una atención global general a la resistencia a los medicamentos. Por estas razones, el PGL en colaboración con sus principales socios y partes interesadas, ha preparado esta guía como una actualización de la guía de vigilancia de 2009. 3 Justificación para desarrollar la guía Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 20174 4 Estrategia mundial contra la lepra 2016-2020 de un vistazo ESTRATEGIA MUNDIAL PARA LA LEPRA 2016-2020 Reducir todavía más la carga mundial y local de morbilidad por lepra. INDICADORES Meta al 2020 Número de niños diagnosticados de lepra y con deformidades visibles 0 Tasa de pacientes recién diagnosticados de lepra que presentan deformidades visibles <1 por millón Número de países cuya legislación permite la discriminación por causa de la lepra 0 PILARES Y COMPONENTES 1. Fortalecer la implicación del gobierno, la coordinación y la creación de alianzas • • • • • 2. Detener la lepra y evitar sus complicaciones • • • • • • • 3. Eliminar la discriminación y promover la inclusión • • • • • • • Ningún caso. Sin transmisión de la infección lepromatosa. Ninguna discapacidad causada por la lepra. Ningún tipo de estigma- tización o discriminación. al reforzar la sensibilización de los pacientes y de la comunidad a la lepra; al aumentar la detección temprana mediante la búsqueda activa de casos (por ejemplo, mediante campañas) en las zonas de mayor endemicidad y mejorar la gestión de los contactos; al procurar un comienzo oportuno del tratamiento y fomentar su cumplimiento, incluido el trabajo en busca de mejores pautas terapéuticas; al mejorar la prevención y el manejo de las discapacidades; al fortalecer la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos, incluida la red de laboratorios; al fomentar los enfoques innovadores en materia de capacitación, remisiones y mantenimiento de los conocimientos y la experiencia sobre la lepra, como la cibersalud; al promover intervenciones de prevención de la infección y la enfermedad. al procurar el compromiso político y la asignación de recursos suficientes para los programas contra la lepra; al contribuir a la cobertura universal de salud con un interés especial en los niños, las mujeres y las poblaciones subatendidas, incluidos los migrantes y las personas desplazadas; al fomentar las alianzas con agentes estatales y no estatales y promover la colaboración y las alianzas intersectoriales a escala internacional y en los países; al facilitar y llevar a cabo investigaciones fundamentales y operativas sobre todos los aspectos de la lepra y aumentar al máximo la base de datos fidedignos que habrá de fundamentar las políticas, las estrategias y las actividades; al fortalecer los sistemas de vigilancia y de información en salud con el propósito de realizar el seguimiento y la evaluación de los programas (incluido el sistema de información geográfica). al fomentar la inclusión en la sociedad y abordar todas las formas de discriminación y estigmatización; al habilitar a las personas afectadas por la lepra y fortalecer su capacidad para participar activamente en los servicios de atención de la enfermedad; al vincular las comunidades en las iniciativas cuyo objeto es mejorar los servicios de atención de la lepra; al promover la creación de coaliciones entre las personas afectadas por la lepra y fomentar la integración de estas coaliciones y de sus miembros en otras organizaciones comunitarias; al fomentar el acceso a los servicios de apoyo social y económico, por ejemplo, facilitar la generación de ingresos para las personas afectadas por la lepra y sus familias; al apoyar la rehabilitación comunitaria de las personas con discapacidades causadas por la lepra; al obrar en favor de la abolición de las leyes discriminatorias y promover la adopción de políticas que faciliten la inclusión de las personas afectadas por la lepra. U N M UND O SIN L EP R A Persp ectiva Finalidad Metas Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 2017 5 5.1 Objetivos El objetivo del sistema de vigilancia es determinar principalmente la resistencia a la rifampicina en casos de lepra, ya sea sola o combinada con resistencia a dapsona y/o ofloxacina en casos nuevos (un indicador de resistencia primaria) y entre casos de retratamiento (proxy de resistencia secundaria) y para controlar las tasas de resistencia a lo largo del tiempo. También proporcionaría información desglosada para que una posible asociación entre la resistencia y grupos específicos de sexo y edad, y/o ubicación geográfica de los casos de lepra se puedan identificar. 5.2 Definiciones Nuevo caso (de lepra): un paciente diagnosticado con lepra que nunca ha sido tratado por la enfermedad. Caso de retratamiento (de lepra): un paciente diagnosticado con lepra que ya ha recibido tratamiento para la enfermedad en el pasado. Los casos de retratamiento se clasifican además en los siguientes grupos: • Retratamiento después de pérdida durante el seguimiento: un paciente diagnosticado con lepra que ha abandonado el tratamiento antes de su finalización y regresa al centro de salud para completar el tratamiento. • Recaída: un paciente que ha completado un ciclo completo de tratamiento para lepra en el pasado y que regresa con signos y síntomas de la enfermedad que no se consideran debidos a una reacción según el médico. • Transferido: un paciente que ha empezado el tratamiento en una instalación e informa a otra instalación para continuar el tratamiento. • Otros retratamientos: cualquier caso de lepra que no se ajusta a ninguna de las categorías anteriores y requiera tratamiento. Tanto los casos nuevos como los de retratamiento pueden clasificarse de la siguiente manera: Caso PB: un caso de lepra con 1-5 lesiones cutáneas y sin presencia demostrada de bacilos en una mancha cutánea. Caso MB: un caso de lepra con >5 lesiones cutáneas; o con cualquier implicación nerviosa (incluida la neuritis pura o cualquier cantidad de lesiones cutáneas y neuritis); o con la presencia demostrada de bacilos en una frotis de piel, independientemente del número de lesiones cutáneas. 5 Resumen del sistema de vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 20176 5.3 Resistencia entre casos nuevos Muestras para ser probadas. Frotis de piel hendida o biopsias de piel Agentes antimicrobianos a investigar. Las muestras se analizan en busca de mutaciones que se sabe están asociadas a la resistencia a rifampicina, dapsona y ofloxacina. Criterios de inclusión. Para detectar la resistencia primaria, se debe probar un cierto número del total de casos nuevos de lepra detectados por año. Para tener una PCR positiva y pruebas exitosas para RAM, solo se probarán los casos MB con frotis positiva con un índice bacilar (IB) >2+, ya que estos tienen una mayor probabilidad de una PCR positiva. Definir el diseño del sistema. La vigilancia de la RAM primaria en la lepra se puede llevar a cabo en función de cualquiera: • un sistema de vigilancia continua que prueba todos los casos nuevos MB (recomendado para países con alta capacidad de laboratorio, recursos adecuados y un número reducido de casos SOLAMENTE); • una encuesta transversal (recomendada para países sin datos representativos de referencia y con suficientes recursos financieros); • un sistema de vigilancia centinela con el objetivo de monitorear las tendencias en la resistencia a la rifampicina en casos nuevos de lepra durante un período de tiempo en diversas regiones/estados (recomendado para países con datos de referencia nacionales/después de una encuesta nacional). Un sistema centinela después de una encuesta nacional podría ser un enfoque razonable para generar datos constantes y poder analizar tendencias • configurar un tamaño de muestra arbitrario, calculando una proporción objetivo de todos los casos nuevos de MB que se probarán de acuerdo con la capacidad / recursos. Esto NO debe ser inferior al 10% del total de casos nuevos MB notificados en el año anterior (recomendado para países sin datos de referencia a nivel nacional y sin los recursos para llevar a cabo una encuesta nacional). Se identificarán laboratorios nacionales o internacionales para realizar las pruebas. Las muestras de piel se recolectarán de instalaciones seleccionadas (sitios de estudio durante encuestas o sitios de vigilancia centinela) después de obtener el consentimiento del paciente y se transportará al laboratorio de prueba nacional o internacional asignado correspondiente. Cuando las muestras se envían al exterior por vía aérea, deben enviarse según las normas de la Asociación Internacional de Transporte Aéreo (IATA). Selección de instalaciones de salud de recolección de muestras. Como los frotis de piel o las biopsias de piel no se recogen de forma rutinaria a nivel periférico, los pacientes Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 2017 7 que se someterán a la prueba deberán identificarse entre los que informan a instalaciones de nivel intermedio donde se realizan rutinariamente frotis o biopsias de piel. En las instalaciones seleccionadas, a todos los pacientes nuevos con un IB ≥2 se les haría una prueba de resistencia a los medicamentos Sistema de información. Los registros de los pacientes se mantendrían en la instalación que recolecta las muestras, en el laboratorio y a nivel nacional utilizando un registro RAM nacional (ejemplo en el Anexo 2). 5.4 Resistencia entre los casos de retratamiento Muestras para ser probadas. Frotis en la piel o biopsias de la piel Agentes antimicrobianos a investigar. Las muestras se analizan en busca de mutaciones que se sabe están asociadas con la resistencia a la rifampicina, la dapsona y la ofloxacina. Criterios de inclusión. Para detectar resistencia secundaria, todos los casos de lepra de retratamiento deben probarse con la excepción de casos transferidos, a menos que se considere que estos casos están en riesgo de RAM debido a un tratamiento irregular. En tales casos, se definirán como “otros retratamientos” en el formulario de prueba. Para tener una PCR positiva y pruebas exitosas de resistencia a los medicamentos, solo se probarán los casos MB confirmados con frotis positivos con un IB ≥2, ya que estos tienen una mayor probabilidad de una PCR positiva. Diseño del sistema. La vigilancia de la resistencia a los medicamentos entre los casos de retratamiento en la lepra se llevaría a cabo mediante un método de vigilancia continua, ya que las pruebas cubren todos los casos de retratamiento (con IB ≥2) a lo largo de los años. Se identifican laboratorios nacionales e internacionales para realizar las pruebas. Las muestras de piel (biopsias o frotis de piel) se recolectarán de instalaciones de salud de nivel intermedio identificadas para la recolección de muestras para evaluar la RAM y se transportarán al laboratorio de pruebas nacional o internacional designado. Cuando las muestras se envíen por aire, deben seguir las regulaciones de la IATA (estas se pueden encontrar en http:// apps.who.int/iris/bitstream/10665/254788/1/WHO-WHE-CPI-2017.8-eng.pdf?ua=1). Para implementar la vigilancia de acuerdo con esta metodología, todos los casos sospechosos de retratamiento deberían derivarse a esas instalaciones específicas de nivel intermedio para confirmar su diagnóstico y recolectar muestras para fines de vigilancia de RAM. Esto tendría el beneficio indirecto de mejorar la calidad del diagnóstico para los casos sospechosos de lepra en retratamiento y posiblemente también mejorar el tratamiento de las reacciones, ya que algunos de esos pacientes podrían ser pacientes con lepra que ya completaron el tratamiento, pero aún experimentan reacciones inmunitarias que son extremadamente riesgosas para desarrollar discapacidades y/o empeorar un impedimento ya existente. Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 20178 Sistema de información. Los registros de los pacientes se mantendrían en la instalación de recogida de muestras, en el laboratorio y a nivel nacional utilizando un registro de RAM nacional (se muestra un ejemplo en el Anexo 5.) 5.5 Esquema para la vigilancia de RAM en lepra Fig. 1. Esquema para la vigilancia de RAM en la lepra Programa Mundial de Lepra de la OMS Publicar el informe anual de lepra en el registro epidemiológico semanal de la OMS Ministerio de Salud Compilar datos en el Registro Nacional de Resistencia Antimicrobiana Presentar datos a la OMS a través del informe anual de recopilación de datos sobre lepra Laboratorio de referencia/ laboratorio de referencia mundial Proporcionar muestras para el control de calidad a los países y someterse al control de calidad por parte del Laboratorio de Referencia Mundial Fomento de la capacidad de los laboratorios nacionales Almacenamiento de datos, incluyendo de mutaciones detectada Laboratorio (en el país o en el extranjero) Secuenciación PCR+ para mutaciones del gen folP1, rpoB y gyrA Informe los resultados al sitio de recolección de muestras, al Ministerio de Salud y al laboratorio de referencia (o al laboratorio de referencia global) Instalaciones de salud de recolección de muestras (sitios centinela/sitios de estudio) Para todos los casos MB nuevos y de retratamiento, recolectar muestras (frotis cutáneo o biopsia cutánea). Si se encuentra IB ≥ 2 enviar muestras al laboratorio para la prueba de resistencia a los medicamentos Instituto Mundial de la Salud, Lausanne, Suiza Repositorio de mutaciones detectadas Fuente: Tabla desarrollada por el Profesor E. Cambau, el Dr. M. Matsuoka y el Dr. L. Gillini Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 2017 9 Se requieren varias actividades para establecer y / o expandir el sistema de vigilancia de RAM en lepra: (1) identificar laboratorios para llevar a cabo pruebas moleculares para la resistencia a rifampicina, dapsona y ofloxacina. Dichos laboratorios podrían estar ubicados en el país o en el extranjero (uno de los cuatro laboratorios de referencia) y podrían ser más de uno por país, según las necesidades; (2) identificar un laboratorio externo al país, entre uno de los cuatro laboratorios internacionales (para países que realizan pruebas solo en laboratorios nacionales). Una parte de las muestras debería enviarse periódicamente al laboratorio externo; (3) identificar los centros de salud de recolección de muestras para evaluar la resistencia a los medicamentos en casos nuevos MB con un IB ≥2; (4) calcular la muestra (cantidad de casos nuevos MB que se probarán) en cada instalación de recolección de muestras que deberá probarse; (5) establecer un sistema de transporte para enviar muestras al laboratorio de pruebas; (6) recopilar sistemáticamente información relacionada con los pacientes evaluados y los resultados correspondientes, incluidos los resultados del tratamiento (que podría realizar el Programa Nacional, un instituto nacional de salud pública / investigación o uno de los laboratorios nacionales de pruebas si la tecnología de la información es adecuada [IT] / recursos humanos están disponibles); (7) monitorear las tendencias en resistencia a lo largo del tiempo y por área geográfica, sexo, edad, categoría / tipo de paciente y, de ser posible, por factores socioeconómicos. 6.1 Selección de los laboratorios de prueba involucrados Se debe fortalecer la capacidad actual de laboratorio para llevar a cabo actividades de vigilancia de lepra. La vigilancia de la resistencia a los medicamentos entre los casos nuevos sería una actividad constante y los centros participantes - tanto nacionales como internacionales - tendrían que tener en cuenta la necesidad de mantener el trabajo de RAM durante un período de tiempo, a menos que el modelo adoptado sea una encuesta nacional puntual. Sin embargo, incluso en este último caso, el trabajo realizado para realizar la encuesta conduciría más adelante a la creación de un sistema de vigilancia centinela de rutina para garantizar la disponibilidad de los datos a lo largo del tiempo o una nueva encuesta después 6 Establecer o expandir un sistema de vigilancia a nivel nacional Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 201710 de 3-5 años. Un laboratorio nacional o internacional es suficiente para realizar pruebas en países con baja carga de lepra, mientras que los países con un gran número de casos anualmente deben identificar a más de un laboratorio para poder verificar todos los casos de retratamiento y una proporción de casos nuevos de MB. Los laboratorios podrían ser administrados por el gobierno o una ONG. En caso de que se identifique una ONG o un laboratorio internacional, el Programa Nacional contra Lepra debe desarrollar un memorando de entendimiento (MDE) para garantizar el acceso a los datos de resistencia por parte del Programa. Los laboratorios de pruebas nacionales e internacionales deben analizar muestras durante todo el año hasta que se alcance el número indicado de muestras a analizar. Si bien la realización práctica de las pruebas es responsabilidad del laboratorio, garantizar la disponibilidad de una red para la correcta recolección de muestras, el transporte, el almacenamiento de muestras y el envío, y la recopilación y transmisión de datos para permitir el monitoreo de los datos de resistencia son obligaciones del Programa Nacional de Lepra. Se debe explorar la posibilidad de establecer pruebas dentro de un laboratorio de tuberculosis (TB) o dentro del laboratorio que sirva de referencia para la agencia nacional a cargo de RAM al establecer el sistema de vigilancia. 6.2 Selección de laboratorios para fines de control de calidad Como parte de la creación de capacidades y para garantizar la confiabilidad de los datos nacionales, cada país que prueba muestras a nivel nacional debe identificar un laboratorio de referencia para realizar el control de calidad. Los programas nacionales de lepra deben desarrollar un MDE para garantizar el acceso a los servicios relacionados con el control de calidad. Si bien el desempeño práctico del control de calidad es un deber del laboratorio de referencia internacional, garantizar el envío regular de muestras para fines de control de calidad, registro e informe de información relacionada y almacenamiento y revisión de los resultados de las actividades de control de calidad son deberes del Programa Nacional de Lepra. El control de calidad de los laboratorios nacionales se realizaría bajo la supervisión del laboratorio internacional de referencia identificado como socio (Baton Rouge, Estados Unidos, Tokio, Japón, París, Francia y Lausana, Suiza, véase el Anexo 1). Para preparar material estándar con el apoyo del laboratorio de referencia internacional se enviarían muestras representativas de ADN y bacilares (sin mutación, mutación conocida) una vez al año. Además, el laboratorio de referencia realizará las misiones en los países una vez cada 1-3 años para aumentar la capacidad nacional de laboratorio y como parte de la evaluación del control de calidad. Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 2017 11 Todas las muestras de piel positivas y negativas de cada caso deben archivarse para garantizar la calidad y realizar más pruebas. Las muestras deben mantenerse congeladas en el laboratorio durante al menos 10 años. Si es necesario, se puede organizar un depósito en un laboratorio de referencia, especialmente para cepas que muestran nuevas mutaciones. Estos deben ser compartidos con los laboratorios de referencia. Los laboratorios internacionales de referencia también deberían estar sujetos a un sistema de control de calidad una vez al año a través de un monitoreo coordinado por el laboratorio del Centro de Investigación de lepra, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, Tokio, Japón. Si bien la tarea práctica de cumplir con los protocolos de control de calidad por parte de los laboratorios nacionales e internacionales es su tarea, garantizar que los recursos y los mecanismos estén en su lugar para el control de calidad es un deber de los programas nacionales contra lepra. 6.3 Identificación de instalaciones de salud de recolección de muestras Se identifican las instalaciones de salud para recolectar muestras de casos MB tanto nuevos como de retratamiento para someterlos a pruebas de resistencia a los medicamentos. Para mayor comodidad, se sugiere que los sitios seleccionados sean centros de nivel secundario y terciario donde se realizan rutinariamente frotis s/biopsias de piel para evaluar/clasificar a los pacientes. Esto garantizaría la recolección de muestras de buena calidad y evitaría la derivación de nuevos pacientes atendidos en un centro periférico a un nivel superior de atención únicamente con fines de vigilancia antimicrobiana. Todos los casos sospechosos de retratamiento deben derivarse en cualquier caso para confirmar el diagnóstico en un centro de nivel secundario/terciario. Para países grandes como India y Brasil, se debe identificar al menos un centro de salud de recolección de muestras por distrito entre todas las instalaciones de nivel secundario/terciario que brindan servicios de lepra, ya sea un establecimiento gubernamental o de una ONG. Si es necesario, se debe capacitar a los técnicos de laboratorio en los hospitales del distrito. La instalación a nivel de distrito debe seleccionarse aleatoriamente si hay más de un centro de nivel secundario/terciario disponible. Para los países con menos casos, las instalaciones de salud de recolección de muestras deberían seleccionarse solo en una gran jurisdicción administrativa (estado/provincia/región). Para esos países, la selección de instalaciones de salud de recolección de muestras por estado/provincia/región debe hacerse al azar entre los centros de nivel secundario/terciario disponibles en ese estado/provincia/región. Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 201712 En cada instalación de salud de recolección de muestras, se deben completar los formularios correspondientes para acompañar el envío de las muestras; la información del paciente debe registrarse para permitir la comunicación de resultados y la prescripción del tratamiento adecuado en caso de que se detecte resistencia. Las instalaciones de recolección de muestras deben solicitar el consentimiento por escrito de cada paciente (o los padres en el caso de un menor) después de una breve sesión informativa sobre la resistencia a los medicamentos en la lepra. Si uno de los establecimientos de salud seleccionados es una institución / hospital ONG (ya sea como un centro de salud de colección de muestras o como laboratorio de pruebas), el Programa Nacional de Lepra debería desarrollar un MDE para garantizar el acceso a los servicios y la información relacionada con RAM. Si bien la tarea práctica de recolección y envío de muestras es un deber de cada instalación de salud de recolección de muestras, asegurar el envío regular de muestras para pruebas, registro y reporte de información relacionada, y supervisión para asegurar que los protocolos estándar sean seguidos por todas las instalaciones involucradas, son deberes de los programas nacionales de lepra. 6.4 Cálculo del tamaño de muestra Para cada instalación de salud de recolección de muestras (un sitio de estudio en una encuesta o un sitio centinela en un modelo de vigilancia), se debe realizar un cálculo del tamaño de muestra según la fórmula que figura en el Anexo 7. Para los países que no tienen datos de referencia locales sobre resistencia, el tamaño de muestra para cada instalación de salud de recolección de muestras debe determinarse con el objetivo de evaluar al menos el 10% del total de casos nuevos MB detectados en el año anterior. Para todos los casos sospechosos de retratamiento, debe existir un sistema para asegurar su derivación a instalaciones de nivel secundario / terciario donde se recolectarían sus muestras si se confirma que son casos de retratamiento, excluyendo los casos transferidos sin sospecha de resistencia. Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 2017 13 6.5 Recolección sistemática de muestras Para todos los casos que cumplan los criterios de inclusión, el muestreo de frotis de piel se realizará con el consentimiento del paciente de acuerdo con la práctica clínica y el procesamiento del laboratorio: • se deben tomar dos muestras de frotis cutáneas de la lesión con una IB ≥2, siendo el lóbulo de la oreja el lugar de muestreo preferido junto con la lesión cutánea más prominente; o bien • se debe tomar una biopsia de piel (por ejemplo, una biopsia con punción de 4 mm) de una lesión prominente con una IB ≥2. Para casos nuevos, la recolección sistemática (de rutina) de muestras debe continuar en cada sitio de recolección de muestras hasta que se alcance el número de muestras que se recogerán, como se define en el cálculo del tamaño de muestra (sección 6.4) o hasta alcanzar un número correspondiente al menos 10% de los casos MB detectados en esa instalación a nivel de distrito/estado en el año anterior. El consentimiento necesario del paciente debe obtenerse de acuerdo con las pautas éticas del país. Para pacientes menores de 18 años, se debe buscar el consentimiento de los padres. 6.5.1 Muestras de frotis de piel Las muestras de frotis de piel se recogen de la misma manera que los frotis de la piel para el examen de IB, utilizando una cuchilla desechable de acero inoxidable. Se debe tener precaución para evitar la contaminación cruzada. Después de tomar la muestra de frotis de piel, enjuagar la cuchilla de acero inoxidable en 1 ml de etanol al 70% (etanol absoluto de grado biológico molecular preparado al 70% v/v con agua desionizada estéril de MilliQ o agua destilada de uso médico); preparar la mezcla en el laboratorio en un tubo con tapa rosca tipo eppendorf de 1,8 ml asegurándose de que los raspados del tejido se laven desde la superficie de la cuchilla y se suspendan en la solución. Para cada paciente se deben tomar dos muestras de frotis de piel etiquetadas de acuerdo con la práctica nacional (algunos países usan el número de registro de lepra). Las muestras de frotis de piel también se pueden almacenar en una tarjeta de papel Whatman® FTA®. La muestra recogida en la cuchilla se impregna en el papel Whatman que se deberé delimitar y marcar adecuadamente para su reconocimiento. Ambas muestras en etanol al 70% y en papel Whatman se pueden almacenar a temperatura ambiente. Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 201714 6.5.2 Biopsia de piel Se escoge una lesión activa para proceder a la toma de la biopsia de piel preferiblemente con un punch de 4 mm para casos nuevos. Para casos de retratamiento, se prefiere una biopsia quirúrgica con bisturí de 6 mm, especialmente si el IB está cerca de 2+. La biopsia se almacena en un tubo estéril tipo eppendorf de 1,8 ml con tapón de rosca, precargado con 1 ml de etanol al 70% (etanol absoluto de grado biológico molecular al 70% v/v + agua desionizada estéril de MilliQ o destilada de uso médico, la mezcla se prepara en el laboratorio) como se describió anteriormente. Si esto no se puede preparar en el establecimiento de salud, las biopsias pueden permanecer en un tubo estéril vacío de 1,8 ml (con tapón de rosca) sin conservantes. Las muestras se pueden mantener a temperatura ambiente hasta que se envíen al laboratorio, posiblemente en lotes, según el costo de transporte y el número de muestras por mes. Los bacilos se inactivan rápidamente, lo que significa que las muestras se pueden enviar por transporte de rutina sin la necesidad de controlar la temperatura durante el transporte, o tomar precauciones adicionales para el control de riesgo biológico. Para los casos en que la detección molecular es negativa (resultados de PCR negativos debido a la inhibición o una pequeña cantidad de ADN), podría ser necesario recolectar muestras adicionales de otra lesión. Esto debe hacerse después de discutir con el laboratorio de pruebas y basado en caso por caso. Fig. 2. Examen de frotis de piel y tubo de centrífuga con 1 ml de etanol al 70% para la recolección de muestras de tejido Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 2017 15 Fig. 3. Muestreo de biopsia por punción de piel con punch de 4mm y tubo para transporte (Foto cortesía: Dr. Beatrice Flageul) El personal en las instalaciones de referencia y en los sitios centinela debe estar capacitado en la recolección adecuada de muestras y transporte. 6.6 Pruebas de laboratorio Una vez que el laboratorio de pruebas, sea nacional o internacional, reciba las muestras, los siguientes pasos tendrían que llevarse a cabo: Amplificación de las regiones determinantes de la resistencia a los fármacos de los genes rpoB, folP1 y gyrA Cada laboratorio aplica su propio método aprobado. Secuenciación de los productos de PCR amplificados o hibridación con sondas específicas (el método de hibridación se puede aplicar en laboratorios sin secuenciadores. Los laboratorios de referencia a menudo usan secuenciadores.) Distinción entre secuencia de tipo salvaje y verificar la presencia de aminoácidos sustituidos por mutación Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 201716 El DNA de M. leprae se amplifica de las muestras de piel por PCR (polymerase chain reaction) y se busca si hay mutaciones asociadas a resistencia. Los informes de resultados por secuenciación o hibridación, se reportan según la técnica utilizada por el laboratorio. Se pueden usar varios métodos, todos muestran un buen desempeño. En el Anexo 6 se presentan tres técnicas como ejemplos: un protocolo interno de secuenciación PCR+, un kit de hibridación PCR+ disponible comercialmente y la secuenciación del genoma completo. En el caso de las PCR negativas para los genes folP1, rpoB o gyrA, se recomienda realizar una PCR que confirme la existencia de M. leprae en la muestra del paciente, dirigida a otra secuencia de ADN, como el elemento repetitivo específico de M. leprae (RLEP). Esto permite determinar la presencia de ADN de M. leprae en la muestra. Cualesquiera que sean las técnicas utilizadas por el laboratorio, es obligatorio poder detectar mutaciones conocidas de conferir resistencia (ver la Fig. 4 y Tabla 1). Se necesitará más investigación para identificar mutaciones adicionales que confieren resistencia. Por esta razón, parte del alcance de la red de vigilancia es crear un “banco” global de mutaciones detectadas para ser administrado por el Instituto Mundial de la Salud, Lausana. Desde 1993 en adelante, la secuenciación de genes se ha realizado para los aislados de M. leprae que se sabe que son resistentes en los experimentos de la almohadilla plantar del ratón y se aislaron de los casos con falla del tratamiento. Esto demostró claramente que algunas mutaciones sin sentido (mutaciones que confieren un cambio de aminoácido) confieren resistencia a dapsona (mutación en el gen folP1), rifampicina (mutación en el gen rpoB) y las quinolonas (mutación en el gen gyrA). Como estas mutaciones están agrupadas dentro de cada gen respectivo, las regiones que determinan la resistencia a los fármacos se describieron como región determinante de la resistencia a dapsona (DRDR), región determinante de resistencia a rifampicina (RRDR) y región determinante de resistencia a quinolona (QRDR) (ver Bibliografía). La secuenciación del genoma de M. leprae ha llevado recientemente a la modificación del sistema de numeración utilizado anteriormente. Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 2017 17 Fig. 4. Secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las regiones determinantes de la resistencia a los fármacos. Los codones que se sabe que están más frecuentemente implicados en la resistencia se destacan en rectángulos. La rifampicina se une a la subunidad β (codificada por el gen rpoB) de la RNA polimerasa y ciertas mutaciones en el gen rpoB conducen a la resistencia a la rifampicina en M. leprae y M. tuberculosis. Las mutaciones que llevan a la sustitución de cualquiera de los siguientes aminoácidos (posiciones 438, 441, 451, 456 y 458) o la inserción de nucleótidos entre las posiciones 439 y 440 confieren resistencia a la rifampicina en M. leprae (Tabla 1). Las mutaciones observadas en otras posiciones (de 432 a 437) deben informarse con precaución y discutirse con un microbiólogo de uno de los cuatro laboratorios de referencia internacionales. Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 201718 Tabla 1. Mutaciones dentro de los genes objetivo de los fármacos para tratar la lepra que confieren resistencia a Mycobacterium leprae Gen Sustitución de aminoácidos debido a la mutación genética Cambio de nucleótidos (5’ –> 3’) rpoB Gln438Val cag gtg Asp441Tyr gat tat Asp441Asn gat aat His451Asp cac gac His451Tyr cac tac Ser456Leu tcg ttg Ser456Met tcg atg Ser456Phe tcg ttc Ser456Trp tcg tgg Leu458Val ctg gtg Leu458Pro ctg ccg folP1 Thr53Ala acc gcc Thr53Arg acc agc Thr53Ile acc atc Pro55Arg ccc cgc Pro55Leu ccc ctc Pro55Ser ccc tcc gyrA Gly89Cys ggc tgc Ala91Val gca gta Nota. Los aminoácidos mutantes en negrita son mutaciones de alta frecuencia para M. leprae asociadas con la resistencia a los fármacos. El sistema de numeración es el de la cepa TN del genoma M. leprae (GenBank AL583923; [1]) Las mutaciones de sustitución en la región determinante de la resistencia a sulfona del gen folP1 (que codifica dihidropteroato sintasa) y que resultan en sustituciones de aminoácidos en las posiciones 53 y 55 confieren resistencia a dapsona en M. leprae a nivel intermedio y alto en el ensayo de almohadilla plantar de ratón. La correlación entre la resistencia a ofloxacina y la mutación sustitutiva en el gen gyrA se ha confirmado en las posiciones 91 (Ala91Val) y 89 (Gly89Cys). Se puede considerar que las mutaciones que involucran los codones 92 y 95 confieren resistencia a la ofloxacina según los resultados de M. tuberculosis, pero deben notificarse con precaución y discutirse con un microbiólogo de uno de los cuatro laboratorios internacionales de referencia. Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 2017 19 Después de que se hayan realizado las pruebas de laboratorio, para informar sobre los resultados, consultar el diagrama de flujo de a continuación: ¿La PCR específica para los genes de resistencia a los medicamentos es positiva? Si la PCR es negativa; verificar si la muestra contiene suficiente ADN de M. leprae (mediante PCR RLEP u otra PCR específica); si las PCR son todas negativas, solicitar otra muestra IB+ Si la PCR es positiva, determinar la secuencia o hibridar con oligonucleótidos de tipo salvaje y mutados – si no hay mutación: informar como susceptible – si hay presencia de mutación: – ¿Es una mutación silenciosa? (No cambia el aminoácido codificado) si es así, no informar – ¿Es una mutación ‘sustitutiva’? (confiere un cambio / sustitución de aminoácido) En caso afirmativo, informar la sustitución de aminoácidos con el sistema de numeración como se muestra en la Tabla 1. – ¿Es una de las sustituciones que confiere resistencia a los medicamentos en la lepra como se describe en la Tabla 1? En caso afirmativo, informar la cepa como resistente. Si no, discutir cómo informarlo con el laboratorio de referencia internacional. Enviar el formulario de informe de laboratorio a la instalación de referencia y al Gerente del Programa Nacional de Lepra. Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 201720 6.7 Registro sistemático de la información Los resultados de la prueba serán utilizados por la instalación de recogida de muestras / estudio / sitio centinela para el manejo apropiado del paciente y por el Programa Nacional de Lepra para el monitoreo apropiado. Por lo tanto, los resultados de las pruebas de laboratorio deben llegar tanto a la instalación que está administrando al paciente como al Programa Nacional de Lepra, para inscribirse en el Registro Nacional de Resistencia a las Drogas contra la Lepra (Anexo 2). Para lograr esto, se han desarrollado formularios estándar de información clínica para registrar los datos que serán enviados a los laboratorios de referencia y de regreso a los centros de salud (Anexos 3, 4 y 5). Al final del tratamiento de los casos detectados con resistencia, se debe enviar una copia de la tabla de pacientes al Programa Nacional de Lepra para permitir el registro de los resultados del tratamiento (Anexo 5). El Programa Nacional de Lepra tendrá que informar anualmente a la OMS sobre lo siguiente: (1) número de casos nuevos MB probados, y número y proporción de casos resistentes (a un medicamento y a más de un medicamento); (2) número de casos MB de retratamiento probados, y número y proporción de casos resistentes (mono y multiresistentes). La presentación de datos globales da como resultado una publicación sobre la lepra en el registro epidemiológico semanal de la OMS, que a partir de 2017 incluirá datos sobre resistencia a los medicamentos, de acuerdo con la importancia que este aspecto ha tenido en la Estrategia global contra la lepra 2016-2020. A nivel mundial, algunos países están implementando una plataforma en línea para informar y monitorear la RAM, que se llama Sistema Mundial de Vigilancia de la Resistencia a los Antimicrobianos (GLASS). Por el momento, el GLP está explorando la posibilidad de integrar los datos de resistencia a los medicamentos para la lepra en la plataforma de GLASS en línea. Para los países que cuentan con un instituto nacional de salud pública/ investigación y/o con centros colaboradores para la lepra con herramientas adecuadas de IT / salud pública, incluyendo recursos humanos, la recopilación y el análisis de los datos podrían realizarse por dicho centro en nombre del Programa Nacional contra Lepra. Sin embargo, incluso bajo tal acuerdo, la propiedad y la responsabilidad de monitorear las tendencias en la resistencia a los medicamentos permanecen con el Programa Nacional de Lepra. Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 2017 21 6.8 Monitoreo de la resistencia a los antimicrobianos Los programas nacionales de lepra deberán monitorear las tendencias a lo largo del tiempo de resistencia entre los casos nuevos y de retratamiento, junto con monitorear la proporción de pacientes evaluados. Los resultados del retratamiento deben analizarse por tipo de retratamiento, mientras se intentan identificar los factores de riesgo de resistencia, como la no adhesión al tratamiento o pérdida durante el seguimiento. De particular preocupación sería una proporción creciente de casos resistentes a la rifampicina, especialmente si se trata de casos nuevos, y si el número total de casos nuevos de lepra permanece estable en el tiempo. Se sugiere compilar debidamente el registro de resistencia a los medicamentos para poder analizar los datos entre las diferentes categorías y monitorear los resultados del tratamiento. Esto ayudaría a identificar los grupos de riesgo de resistencia por edad, sexo, lugar de residencia y/o factores socioeconómicos, y categoría de paciente (por ejemplo, retratamiento después de la pérdida durante el seguimiento), así como los factores de riesgo para el fracaso del tratamiento. Para los países con una gran carga de lepra, se sugiere que se establezca una base de datos computarizada nacional y se comparta periódicamente con el laboratorio de referencia para identificar mutaciones más frecuentes y posibles patrones de transmisión a través de estudios, incluida la secuenciación del genoma completo realizada por el laboratorio en la Escuela Politécnica Federal de Lausana. Los países también podrían utilizar la base de datos como una herramienta para llevar a cabo periódicamente investigaciones operacionales y científicas para identificar factores de riesgo potenciales adicionales tales como retraso en el diagnóstico, tratamiento buscado en el sector privado, comorbilidades, etc. También se pueden identificar los factores asociados con los resultados del tratamiento con medicamentos de segunda línea. Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 201722 (1) Adams LB, Job CK, Krahenbuhl JL. Role of inducible nitric oxide synthase in resistance to Mycobacterium leprae in mice. Infect Immun. 2000; 68: 5462–5. (2) Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence sata. Bioinformatics. 2014; 30: 2114-20. (3) Cambau E, Perani E, Guillemin I, Jamet P, Ji B. Multidrug-resistance to dapsone, rifampicin, and ofloxacin in Mycobacterium leprae. Lancet. 1997; 349: 103–4. (4) Cambau E, Bonnafous P, Perani E, Sougakoff W, Ji B, Jarlier V. Molecular detection of rifampin and ofloxacin resistance for patients who experience relapse of multibacillary leprosy. Clin Infect Dis. 2002; 34: 39–45. (5) Cambau E, Carthagena L, Chauffour A, Ji B, Jarlier V. Dihydropteroate synthase mutations in the folP1 gene predict dapsone resistance in relapsed cases of leprosy. Clin Infect Dis. 2006; 42: 238–41. (6) Cambau E, Chauffour-Nevejans A, Tejmar-Kolar L, Matsuoka M, Jarlier V. Detection of antibiotic resistance in leprosy using GenoType LepraeDR, a novel ready-to-use molecular test. PLoS Negl Trop Dis. 2012; 6(7): e1739. (7) Cole S, Eiglmeier K, Parkhill J, James K, Thomson N, Wheeler P et al. Massive gene decay in the leprosy bacillus. Nature. 2001; 409: 1007–11. (8) Gillis TP, Williams DL. Dapsone resistance does not appear to be associated with a mutation in the dihydropteroate synthase-2 gene of Mycobacterium leprae. Indian J Lepr. 1999; 71: 11–18. (9) Gillis TP, Williams DL. Dapsone resistance in Mycobacterium leprae. Lepr Rev. 2000; 71 (Suppl): S91–S95. (10) Ginsberg AM, Spigelman M. Challenges in tuberculosis drug research and development. Nat Med. 2007; 13 (3): 290–4. (11) Hirawati, Katoch K, Chauhan DS, Singh HB, Sharma VD, Singh M et al. Detection of M. leprae by reverse transcription PCR in biopsy specimens from leprosy cases: a preliminary study. J Commun Dis. 2006; 38: 280–7. (12) Honore N, Cole ST. Molecular basis of rifampin resistance in Mycobacterium leprae. Antimicrob Agents Chemother. 1993; 37: 414–18. (13) Honore N, Perani E, Telenti A, Grosset J, Cole ST. A simple and rapid technique for the detection of rifampin resistance in Mycobacterium leprae. Int J Lepr Other Mycobact Dis. 1993; 61: 600–4. (14) Kai M, Matsuoka M, Nakata N, Maeda S, Gidoh M, Maeda Y et al. Diaminodiphenylsulfone resistance of Mycobacterium leprae due to mutations in the dihydropteroate synthase gene. FEMS Microbiol Lett. 1999; 177: 231–5. 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Lepr Rev. 2000;71 (Suppl):S96–S97; discussion S97–S99. (29) Sapkota BR, Ranjit C, Macdonald M. Reverse line probe assay for the rapid detection of rifampicin resistance in Mycobacterium leprae. Nepal Med Coll J. 2006; 8: 122–7. (30) Sapkota BR, Ranjit C, Neupane KD, Macdonald M. Development and evaluation of a novel multiple-primer PCR amplification refractory mutation system for the rapid detection of mutations conferring rifampicin resistance in codon 425 of the rpoB gene of Mycobacterium leprae. J Med Microbiol. 2008; 57: 179–84. (31) Williams DL, Waguespack C, Eisenach K, Crawford JT, Portaels F, Salfinger M et al. Characterization of rifampin resistance in pathogenic mycobacteria. Antimicrob Agents Chemother. 1994; 38: 2380–6. (32) Williams DL, Spring L, Harris E, Roche P, Gillis TP. Dihydropteroate synthase of Mycobacterium leprae and dapsone resistance. Antimicrob Agents Chemother. 2000; 44: 1530–7. (33) Williams DL, Pittman TL, Gillis TP, Matsuoka M, Kashiwabara Y. 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A mutation at codon 516 in the rpoB gene of Mycobacterium leprae confers resistance to rifampin. Int J Lepr Other Mycobact Dis. 2004; 72: 468–72. Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 201724 Documentos de la OMS (1) Estrategia Mundial para la Lepra 2016-2020. “Acelerando hacia un mundo libre de lepra”. Nueva Delhi: Oficina Regional de la Organización Mundial de la Salud para Asia Sudeste; 2016. (2) Estrategia Mundial para la Lepra 2016-2020. “Acelerando hacia un mundo libre de lepra” – Manual Operativo. Oficina Regional de la Organización Mundial de la Salud para Asia Sudeste; 2016. (3) Estrategia Mundial para la Lepra 2016-2020. “Acelerando hacia un mundo libre de lepra” – Guía de Monitoreo y Evaluación. Oficina Regional de la Organización Mundial de la Salud para Asia Sudeste; 2017. (4) World Health Organization. Global leprosy update, 2016: accelerating reduction of disease burden. Wkly Epidemiol Rec. 2017;35:501–19. (5) Resolution WHA67.25. Antimicrobial resistance. In: Sixty-seventh World Health Assembly, Geneva, 19–24 May 2014. Resolutions and Decisions, annexes. Geneva: World Health Organization; 2014 (WHASS1/2014WHA67/2014/REC/25). (6) Surveillance of drug resistance in leprosy: 2009. Wkly Epidemiol Rec. 2010;85(29):281–4. (7) Guidelines for global surveillance of drug resistance in leprosy. New Delhi: WHO Regional Office for South-East Asia; 2009 (http://www.searo.who.int/entity/leprosy/documents/SEA_GLP_2009_2/en/, accessed 6 July 2017). (8) Global action plan on antimicrobial resistance. Geneva: World Health Organization; 2015 (http://www. who.int/antimicrobial-resistance/global-action-plan/en/, accessed 6 July 2017). Otras publicaciones (1) Executive summary: Global antimicrobial resistance alerts and implications. Clin Infect Dis. 2005;41 (Suppl 4): S221–S3. Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 2017 25 Anexo 1 Laboratorios internacionales de referencia National Reference Centre on Mycobacteria and Resistance to Anti-tuberculosis Drugs, Assistance publique-Hôpitaux de Paris (APHP) In-charge: Professor Emmanuelle Cambau Hôpital Lariboisière 2 rue Ambroise Paré 75010 Paris France Phone: +33-1-49956554; Fax: +33-1-49958537 Email: emmanuelle.cambau@aphp.fr Global Health Institute In-charge: Professor Stewart Cole École Polytechnique Fédérale de Lausanne Station No. 15 CH-1015 Lausanne Switzerland Phone: +41-919-6817760; Fax: +41-919-6817748 Email: stewart.cole@epfl.ch Leprosy Research Center Dr Yuji Miyamoto National Institute of Infectious Diseases 4-2-1 Aoba-cho, Higashimurayama-shi Tokyo 189-0002 Japan Phone: +81-42-3918211; Fax: +81-42-3949092 Email: yujim@niid.go.jp National Hansen’s Disease Programs Laboratory Research Branch In-charge: Dr Rahul Sharma Department of Health and Human Services Health Resource Administration, Health System Bureau, SVM-LSU, RM 3517W, Skip Bertonma Dr. Baton Rouge, LA 70803 United States of America Phone: +1-225-5789839; Fax: +1-225-5789856 Email: Sharma, Rahul (HRSA) <RSharma1@hrsa.gov> Anexos Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 201726 Anexo 2 Registro nacional de resistencia a los medicamentos contra la lepra Nombre Apellido Número de registro de lepra Tipo de paciente (nuevo/retratamiento) Tipo de retratamiento Fecha de inicio del tratamiento PQT Nombre y ubicación Planta de tratamiento Fecha de recolección de muestras Nombre y ubicación Instalación que recoge la muestra Sitio de la piel de la colección de muestras Frotis de la piel con hendidura índice de BI en el laboratorio nacional Resultados del laboratorio nacional Resultados PCR del laboratorio nacional Resultados PCR laboratorio de referencia Resultados seq. Rifampicina Laboratorio nacional Resultados Seq Rifampicina laboratorio de referencia Resultados seq. Dapsona Laboratorio nacional Resultados Seq Dapsona laboratorio de referencia Resultados Seq Ofloxacina laboratorio nacional Resultados Seq Ofloxacina laboratorio de referencia Resultados Seq Ofloxacina laboratorio de referencia Régimen de tratamiento (para casos fármaco-resistentes) Inicio del tratamiento) (para casos fármaco-resistentes) Fin del tratamiento (para casos fármaco- resistentes) Resultados del tratamiento Observaciones Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 2017 27 Anexo 3 Formulario 1. Formulario de informe clínico para los casos de lepra MB que deben someterse a pruebas de resistencia a los medicamentos I. Reporte detallado Número de registro de lepra: _________________________________ Nombre del país: ___________________________________________ Informes tipo de instalación: Centro de atención primaria/otro: nombre y dirección: __________________ ________________________________________________________________ Sitio centinela: nombre y dirección: ________________________________ Fecha de reporte (DD/MM/AAAA): ____/____/_______ Fecha de recolección de la muestra (DD/MM/AAAA): ____/____/_______ II. Datos demográficos e historial médico del caso Fecha de nacimiento: _____________ Sexo: M / F Ciudadanía o residencia del paciente: ___________________ País de origen: _______________________________________ Consentimiento del paciente para participar: Si / No (Si no, omitir los siguientes pasos) Quimioprofilaxis: Si / No En caso afirmativo, qué medicamento se administró: __________________________ Tratamiento previo de TB: Si / No Tratamiento previo con ofloxacina u otras quinolonas durante más de un mes: Si / No III. Clasificación de caso Nuevo retratamiento: Retratamiento después de la Recaída pérdida durante el seguimiento Transferido Otro retratamiento Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 201728 IV. Historia de tratamiento (solo para casos de retratamiento) Tratado con PQT, año: Tratado con rifampicina, dapsona, clofazimina (no en la presentación de PQT), año: Tratado con otros medicamentos: especificar V. Presentación clínica en el momento de la referencia para la prueba de resistencia Características clínicas: __________________________________________________ ___________________________________________________________________ Cantidad de lesiones en la piel: ___________ Resultados de frotis de la piel de sitios específicos (si los hay, junto con la fecha de la prueba): 1. Sitio: _____________ IB: ________ Fecha del frotis: ___/___/______ 2. Sitio: _____________ IB: ________ Fecha del frotis: ___/___/______ 3. Sitio: _____________ IB: ________ Fecha del frotis: ___/___/______ Clasificación de enfermedad: A: (MB/PB) B: Ridley–Jopling – (BB/BT/TT/BL/LL) VI. Tipo de muestra Biopsia, número de muestras: ____________ Sitio de colección: ____________ Frotis de la piel, número de muestras: _________ Sitio de colección: _________ Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 2017 29 Anexo 4 Formulario 2. Informe del laboratorio de prueba Nombre del laboratorio de prueba: _______________________________________ _______________________________________________________________________ Dirección: ______________________________________________________________ _______________________________________________________________________ Teléfono: Fax: Email: ___________________ Identificación de caso Registro de casos de lepra: número: iniciales del caso: Edad: Sexo: Nombre del instituto que envía el espécimen _______________________________________________________________________ Dirección: ______________________________________________________________ _______________________________________________________________________ Teléfono: __________________ Fax: ______________ Email: _____________________________________________ Tipo de caso: Nuevo retratamiento Fecha de aceptación: _____/_____/________ (dd/mm/aa) Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 201730 Tipo de espécimen recibido: biopsia / frotis de piel (Hacer un círculo en ambos si se recibe más de un tipo de muestra) Resultados de secuencia gen rpoB PCR negativa (otra prueba de PCR: __________________) Sin mutación (no informar mutación silenciosa) Presencia de una mutación conocida por conferir resistencia a los medicamentos mutación de nucleótido (X a Y en el nucleótido Z*) ____________________ sustitución de aminoácido (A a B en la posición C*): __________________ Presencia de otra mutación (A a B en la posición C*) gen folP1 PCR negativa (otra prueba de PCR: __________________) Sin mutación (no informar mutación silenciosa) Presencia de una mutación conocida por conferir resistencia a los medicamentos mutación de nucleótido (X a Y en el nucleótido Z*) ____________________ sustitución de aminoácido (A a B en la posición C*): __________________ Presencia de otra mutación (X a Y en la posición Z*) gen gyrA PCR negativa (otra prueba de PCR: __________________) Sin mutación (no informar mutación silenciosa) Presencia de una mutación conocida por conferir resistencia a los medicamentos mutación de nucleótido (X a Y en el nucleótido Z*) ____________________ sustitución de aminoácido (A a B en la posición C*): __________________ Presencia de otra mutación (X a Y en la posición Z*) * sistema de numeración de la cepa del genoma de M. leprae TN (NCBT número de acceso AL4550380.1) Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 2017 31 Nombre del biólogo correspondiente (y firma) Firma Fecha del informe: ___/___/________ (dd/mm/aa) Nota: La presencia o ausencia de mutaciones que se sabe que confieren resistencia a los medicamentos se debe informar como: • “no se conoce ninguna mutación que confiera resistencia” si estas mutaciones no se encuentran y la secuencia muestra codones de tipo salvaje; • “Presencia de mutaciones conocidas por conferir resistencia” si se observa al menos una de estas mutaciones. La sustitución (por ejemplo, Ser456Leu) debe establecerse sobre la base del sistema de numeración del genoma de M. leprae a partir de la cepa TN (ver Tabla 1 y Fig. 4); • “Otra mutación ‘sustitutiva’”: esta podría ser una nueva mutación o una mutación descrita anteriormente pero no se sabe que confiera resistencia. La mutación debe escribirse con respecto a la sustitución (por ejemplo, Lys411Asn), con el cambio de nucleótidos entre paréntesis (por ejemplo, aaa aac) sobre la base del sistema de numeración del genoma de M. leprae de la cepa TN (ver Fig. 4). Las secuencias de ADN correspondientes y los datos relativos a la descripción de nuevas mutaciones también se enviarán a una base de datos común ubicada en la École Polytechnique Fédérale de Lausanne; • no informar mutaciones silenciosas, es decir, mutaciones que no cambian el aminoácido. Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 201732 Anexo 5 Formulario de informe para los resultados del tratamiento de casos resistentes Reporte detallado • Número de registro de lepra: ______________ • Iniciales / sexo: M / F Edad_________ (en numeros) • Tipo de caso: Nuevo Retratamiento (tipo de retratamiento) • Fecha del informe:__ / __ / ____ (dd/mm/aa) • Fecha de finalización del tratamiento:__ / __ / ____ (dd/mm/aa) Tipo de resistencia • Solo rifampicina • Solo dapsona • Solo ofloxacina • rifampicina + dapsona • rifampicina + dapsona + ofloxacina • rifampicina + ofloxacina • dapsona + ofloxacina Tratamiento prescrito por: Dr.: ______________________________ Nombre de la instalación: ________________________ Régimen de tratamiento prescrito • MB-PQT Opción A: 400 mg de ofloxacina + 100 mg de minociclina + 50 mg de clofazimina, diariamente durante 6 meses seguido de 400 mg de ofloxacina + 50 mg de clofazimina durante 18 meses diariamente o Option B: 400 mg de ofloxacina + 100 mg de minociclina + 50 mg de clofazimina, diariamente durante 6 meses seguido de 100 mg de minociclina + 50 mg de clofazimina diariamente para 18 meses • Otro tratamiento (especificar): ____________________________________________ Resultados del tratamiento • Tratamiento completado • Fallecido • Perdido para dar seguimiento • Transferido afuera • Respuesta insatisfactoria al tratamiento Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 2017 33 Anexo 6 Protocolos de laboratorio 1. Extracción de ADN Protocolo A para muestras de frotis de piel: método de tampón de lisis (adaptado de Wit 1991; J Clin Microbiol. 1991; 29: 906–10) • Centrifugar durante 10-20 minutos a velocidad máxima (debe ser más de 15 000 x g). • Desechar el sobrenadante. Re-suspender el precipitado en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Dejar reposar por más de 30 minutos antes de suspender en la PBS. • Centrifugar durante 10-20 minutos a velocidad máxima. • Re-suspender el sedimento en 50 µL de amortiguador de lisis*. Superponer aceite mineral para evitar la evaporación del amortiguador. • Incubar durante la noche a 60 °C. • Calentar durante 10 minutos a 97 °C para inactivar la proteinasa K. • Transferir a un tubo de ADN de bajo enlace tal como el producto Eppendorf DNA LoBind. *Amortiguador de lisis Solución madre I: proteinasa K 1 mg/mL en 100 mM de Tris-HCl, pH 8.5 Solución madre II: 0.5% Tween 20 Mezclar 1 volumen de solución I y 1 volumen de solución II Diluir 5 veces con 100 mM de Tris-HCl, pH. 8.5 o agua destilada Generalmente, se mezclan 100 µL de solución madre I y II con 800 µL de Tris-HCl 100 mM, pH 8,5 o agua destilada. Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 201734 Protocolo B para muestra de biopsia: método de congelación en ebullición (adaptado de Woods 1989) • Si se almacena en etanol al 70%, colocar los tubos abiertos debajo de una campana de seguridad para que el etanol se evapore, hasta que la biopsia esté seca (24–48 h). • Picar la biopsia de la piel y moler con perlas de vidrio para obtener una suspensión de biopsia en solución de Hanks u otro amortiguador / agua estéril. • Después de la inactivación a 95 °C durante 30 min, el ADN se extrae de la siguiente manera: 200 µL de la suspensión de biopsia se somete a cinco series de descargas calor-frío, alternadamente hirviendo (1 min a 100 °C) y congelando (1 min en hielo seco). Luego incubar a 95 °C durante 15 minutos, seguido de inmersión en un baño de ultrasonidos (Branson) durante 15 minutos si es posible. Protocolo C para muestra de tarjeta FTA • Retirar un disco de muestra de 3 mm del centro del frotis con un punzón de biopsia. • Transferir a un tubo de 1.5 mL. • Añadir 500 µL de H2O estéril al tubo e inmediatamente pulsar el vórtice 3 veces, por un total de 5 segundos. • Utilizando una técnica estéril, transferir inmediatamente el disco a un tubo de micro-centrífuga de 0,5 ml que contenga 30 µL de H2O estéril. Asegurarse de que el disco esté completamente sumergido en el H2O centrifugando brevemente el tubo durante 10 segundos. • Transferir el tubo a un bloque calefactor a 95 °C durante 15-30 minutos. • Al final del período de incubación, retirar la muestra del bloque y pulse el vórtice, o golpear suavemente la muestra aproximadamente 60 veces. Protocolo D para muestra de piel cortada por sangre y tejido DNeasy (Qiagen) • Muestras de piel suspendidas en etanol al 70% por centrifugación durante 10-20 minutos a velocidad máxima (debe ser más de 15 000 x g). • Desechar el sobrenadante. Re-suspender el precipitado en 500 µL de PBS. Dejar reposar durante más de 30 minutos y reemplazar el etanol con PBS. • Centrifugar durante 10-20 minutos a velocidad máxima. • Suspender un sedimento de muestra en 180 µL de amortiguador de lisis enzimático. • Incubar durante al menos 30 minutos a 37 °C. Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 2017 35 • Añadir 25 µL de proteinasa K y 200 µL de amortiguador AL (sin etanol). Mezclar mediante agitación de vórtice. Incubar a 56 °C durante 30 min. • Añadir 200 µL de etanol (96-100%) a la muestra, y mezclar bien con agitación de vórtice. • Pipetear la mezcla en la columna de minispin DNeasy colocada en un tubo de recolección de 2 ml. Centrifugar a >6000 x g por 1 min. Desechar el tubo de flujo y de recolección. • Colocar la columna de minispin DNeasy en un nuevo tubo de recolección de 2 ml, agregar 500 µl de amortiguador AW1 y centrifugar durante 1 minuto a >6000 xg para 1 minuto. Desechar el tubo de flujo y de recolección. • Colocar la columna de minispin DNeasy en un nuevo tubo de recolección de 2 ml, agregue 500 µL de amortiguador AW2 y centrifugar durante 3 min a 20 000 x g para secar la membrana DNeasy. Desechar el tubo de flujo y de recolección. • Colocar la columna de minispin DNeasy en un tubo de micro-centrífuga limpio de 1,5 ml o 2 ml y pipetear 200 µL de amortiguador AE directamente sobre la membrana DNeasy. Incubar a temperatura ambiente durante 1 minuto, y luego centrifugar durante 1 minuto a >6000 x g para eluir. 2. Secuenciación de PCR (a) Protocolo interno para la secuenciación de PCR Mezcla de PCR: 12.5 µL mezcla maestra de PCR (2X) 0.5 µL de polimerasa Taq 1.25 µL de cebador directo a una concentración final de 0.5 µM 1.25 µL de cebador inverso a una concentración final de 0.5 µM 5.0–7.5 µL de agua hasta el volumen final de 25 µL 2.5–5.0 µL plantilla DNA Ciclo termico: Desnaturalizar a 95 °C durante 30 s Desnaturalizar a 95 °C durante 15 s Recocer a 57 °C durante 15 s 40 ciclos Extender a 72 °C durante 60 s Extensión final a 72 °C durante 7 min. Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 201736 Fuente: Directrices para la vigilancia mundial de la fármaco-resistencia en la lepra. Nueva Delhi; Oficina Regional de la OMS para Asia Sudeste, Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 2017 37 Protocolo interno (In-house) de reacción de secuenciación Mezclar para la reacción de secuenciación de PCR 1–3 µL (1–3 ng de 100–200 bp) productos de PCR purificados 20 µL de agua destilada se suman al volumen total 4 µL terminador Bigdye Ver 1.1 2µL de amortiguador 5XSEQ 1 µL de cebador 3.3 M (el mismo cebador utilizado para PCR se diluye X6) Reacción térmica del ciclo Ciclo 1: 96 °C durante 30 s Ciclo 2: 96 °C durante 10 s Ciclo 3: 50 °C durante 10 s Ciclo 4: 60 °C durante 3 min Repetir el ciclo 2-4 25 veces Purificación de productos de reacción de secuenciación (por ejemplo, mediante cartucho de filtración en gel, Performa DTR) Preparación de muestras para la secuenciación. Agregar 25 µL de reactivos de HI (Applied Biosystems) a los tubos de muestra para resolver los productos de secuenciación en seco. Dar vórtice completamente y centrifugar. Transferir la muestra a los tubos de muestra para la secuencia. Calentar durante 2 minutos a 95 °C y luego enfriar rápidamente en agua con hielo; centrifugar. Listo para aplicar al secuenciador después de la re-suspensión en el búfer de carga. b) Kit comercial estandarizado GenoType LepraeDR v1.0 para secuenciación de PCR (fabricado por Hain Lifesciences, http://www.hain- lifescience.de/en/) Después de la extracción de ADN (ver protocolos anteriores), el procedimiento es una amplificación múltiple de regiones determinantes de la resistencia a los fármacos (DRDR) en rpoB, folP1 y gyrA con cebadores biotinilados seguidos por una hibridación inversa (prueba de tira de ADN usando amplificación por PCR). El kit contiene todos los reactivos para PCR múltiple e hibridación, incluidos los controles de calidad internos, pero el ADN polimerasa HotstartTaq termoestable debe proporcionarse por separado. La mezcla de nucleótidos cebadores (PNM) contiene cebadores biotinilados para la amplificación de regiones específicas del genoma bacteriano. Las tiras de membrana están Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 201738 recubiertas con sondas específicas complementarias a los ácidos nucleicos amplificados. Después de la desnaturalización química, los amplicones monocatenarios se unen a las sondas (hibridación). La unión altamente específica de cadenas de ADN complementarias está garantizada por las condiciones rigurosas que resultan de la combinación de la composición del tampón y una cierta temperatura. Por lo tanto, las sondas discriminan de forma fiable varias variaciones de secuencia en las regiones génicas examinadas. La fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina se une a la biotina de los amplicones a través del resto de estreptavidina. Finalmente, la fosfatasa alcalina transforma un sustrato añadido en un tinte, que se vuelve visible en las tiras de la membrana como un precipitado coloreado. Una plantilla garantiza la interpretación fácil y rápida del patrón de bandas obtenido. Cada banda de ADN incluye cinco zonas de control: • una zona de control conjugada (CC) para verificar la unión del conjugado en la tira y una reacción cromogénica correcta • una zona de control universal (UC) que detecta, por lo que se sabe, todas las micobacterias y miembros del grupo de bacterias Grampositivas con un alto contenido de G+C • tres zonas de control del locus (rpoB, gyrA y folP1) que verifican la sensibilidad óptima de la reacción para cada uno de los genes loci probados. Fig. 5. Tira de ADN del kit GenoType LepraeDR. (A) Esquema de la tira. (B) Ejemplos de tiras de ADN (A) Esquema de la tira y detalles de las sondas Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 2017 39 Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 201740 (B) Ejemplos de tiras de ADN c) Secuenciación de todo el genoma para encontrar mutaciones de resistencia a fármacos Para fines de secuenciación, el ADN puede extraerse de biopsias de piel humana de IB conocida utilizando el siguiente protocolo personalizado que elimina la mayor parte del ADN del huésped, seguido de la lisis de las bacterias y la purificación del ADN de M. leprae en columnas de sílice. Las biopsias de perforación (6 mm) en etanol al 70% se rehidratan primero en 500 µL de la solución balanceada de Hank y luego se cortan finamente con tijeras o se rompen mediante perlas utilizando perlas de circonio de 2,8 mm (Bertin Technology, Francia). Cada ejecución de extracción podría incluir un lote de 5-9 muestras y un control en blanco. Para digerir la piel y el tejido humano, la muestra se incuba con una mezcla de 0,5 U de colagenasa y dispasa (Roche, Suiza) durante 30 min a 37 °C; las células liberadas se recogen en un tubo separado y el tejido restante se digiere mediante incubación con tripsina en PBS (10 mg / ml) a 56 °C hasta la digestión completa. Las células liberadas se agrupan y se centrifugan durante 10 minutos a 10 000 g antes de la re-suspensión en 1 ml de PBS. Las células se lisan con 500 µL de amortiguador AHL (kit de microbioma QIAmp, Qiagen) durante 30 min a temperatura ambiente con rotación de extremo a extremo. La mezcla se centrifuga luego durante 10 min a 10 000 g y se re-suspende en 190 µL de amortiguador RDD. Luego se añaden 2,5 µL de benzonasa para eliminar el ADN del huésped (kit de microbioma QIAmp, Qiagen) incubando a 37 °C durante 30 min. A continuación, la mezcla se trata con proteinasa K (20 mg / ml) a 56 °C durante 30 minutos para inactivar la DNAase. Las células bacterianas son lisadas mecánicamente mediante perlas y enzimáticamente usando tratamiento con proteinasa K (20 mg / ml) según las recomendaciones del fabricante antes de la purificación del ADN en columnas a base de sílice (kit de microbioma QIAmp, Qiagen). Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 2017 41 A continuación, se sonican muestras de ADN para obtener fragmentos de 400 pb usando un instrumento Covaris S220. Las bibliotecas de Illumina se preparan utilizando el kit Kapa Hyper Prep (Kapa Biosystem, MA, EE. UU.) Y PentAdpters (Pentabases, Dinamarca) o los adaptadores indexados Illumina. Los fragmentos se seleccionan antes de la amplificación usando perlas AMPUre con una proporción de 0.5X para la primera y 0.2X para la segunda selección. La concentración de adaptadores indexados y el número de ciclos de amplificación se adaptan con respecto a la concentración inicial de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Kapa Biosystem, MA, EE. UU.). Después del control de calidad (la concentración y el tamaño de la biblioteca se determinan utilizando un analizador de fragmentos), las bibliotecas pueden multiplexarse y secuenciarse como 100 lecturas de un solo extremo en un instrumento Illumina HiSeq 2500 (https://www.illumina.com). Las lecturas crudas se recortan luego con adaptador y calidad usando Trimmomatic v0.33 (Bolger et al., 2014) y se mapean en el genoma de referencia M. leprae TN (número de acceso NCBI AL450380.1) con Bowtie2 (versión 2.2.5; Langmead y Salzberg 2012) seguido de una variante de llamadas utilizando VarScan v2,3,9 (Koboldt et al., 2012) u otros programas de mapeo. Los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) pueden invocarse después de aplicar controles de calidad, es decir, una cobertura global mínima de cinco lecturas no duplicadas, un mínimo de tres lecturas no duplicadas que respaldan el SNP, un puntaje de calidad de mapeo> 8, un puntaje de calidad base> 15 y una frecuencia de SNP superior al 80%. Estos límites se eligen para evitar resultados falsos positivos. Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 201742 Anexo 7 Protocolo de vigilancia centinela Cálculo de tamaño de muestra. El tamaño de la muestra (n) se calculará en función del nivel de resistencia esperado según la fórmula y las explicaciones relacionadas a continuación: n dónde: N = número promedio anual de casos nuevos MB de lepra registrados en el sitio centinela en los últimos cinco años Z = valor z (de la distribución normal estándar) que corresponde al nivel de confianza deseado (reducir el intervalo de confianza del 95% al 90% dará lugar a algunas reducciones en el tamaño de la muestra; si el intervalo de confianza es del 95%, entonces z = 1,96 y a 90%, z = 1,65); d = precisión absoluta (como un decimal 0,01 o 0,02, significando un error dentro del 1% o 2% de la proporción verdadera); g = estimación previa de la proporción de casos nuevos con resistencia a Rifampicina x (1 + cambio anticipado en la estimación anterior). El cambio anticipado se puede considerar como el cambio que el sistema centinela debería ser capaz de detectar. Este cambio se expresa como un decimal, con un prefijo negativo (-) si se anticipa una disminución y un prefijo positivo (+) si se anticipa un aumento. Por ejemplo, un aumento del 4% de la estimación anterior se expresaría como un cambio anticipado de +0,04; por lo tanto, g = estimación anterior x (1 + 0,04) = estimación anterior x 1,04. De manera similar, si se anticipa una reducción del 10% del nivel de resistencia anterior en el año actual, entonces g = estimación anterior x (1-0.04) o g = estimación anterior x (0,96). Se sugiere duplicar el tamaño de muestra calculado con la fórmula. Esto se hace para neutralizar el efecto de diseño y aumentar la precisión del esquema de muestreo (un tamaño de muestra lo suficientemente grande como para detectar cambios anticipados en una escala mayor, considerando la incertidumbre del nivel de resistencia inicial y la falta de tendencia conocida en la mayoría de países). Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 2017 43 Para los países en los que el nivel de resistencia inicial no se conoce en absoluto, 10% del total de casos nuevos MB de lepra detectados por año será probado en un laboratorio nacional o internacional. Selección de muestras. Después de corregir el tamaño de muestra, el siguiente problema es cómo seleccionar la muestra de los casos nuevos MB. El primer paso es identificar el número de distritos endémicos que atienden los sitios centinela y luego asignar el número de muestras que se seleccionarán de cada uno de esos distritos de acuerdo con el número promedio de casos nuevos de MB registrados en los últimos cinco años. Después de calcular el número de muestras que se extraerán de cada distrito endémico, las muestras deben seleccionarse por el esquema sistemático. A continuación, se brinda una guía paso a paso: • Supongamos que la fórmula antes mencionada arrojó un tamaño de muestra de 20; luego, después de aumentar el tamaño de la muestra, digamos en un 50%, es decir, 50% de 20 = 10, el tamaño total de la muestra será 20 + 10 = 30. • Además, supongamos que el sitio centinela cubre solo dos distritos, A y B, con un número promedio de casos nuevos MB de 150 y 250 (37.5% y 62.5% del total de casos MB), respectivamente. Ahora, se debe distribuir un total de 30 muestras entre estos dos distritos en proporción a su número promedio de casos nuevos de MB. Esto implica que, desde el distrito A, se deben analizar 11 muestras, mientras que desde el distrito B, se deben probar 19 muestras. • Para dibujar una muestra sistemática circular del distrito A, tenemos que encontrar el entero más cercano k, que se puede obtener de la siguiente manera: k = 150 = -------- 11 = 13.66 = 14 (aproximadamente) • Ahora, seleccionar un número aleatorio entre 1 y 14. Por ejemplo, seleccionamos 12; luego elegir cada doceavo paciente de la lista de nuevos pacientes con MB registrados en el año actual y esta será su primera muestra del distrito A; ahora, seleccionar la segunda muestra agregando k (14) a ella, es decir, 12+14 = 26, el número de serie del paciente 26 será la segunda y el número de serie del paciente 40 será la tercera muestra. De manera similar, el número de serie del paciente 124 será el noveno y el número de serie 138 será la décima muestra. Sin embargo, Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 201744 ahora 138+14 = 152, y solo hay 150 pacientes. Entonces la undécima muestra será 152 - 150 = 2, es decir, el paciente con número de serie 2 al comienzo será la undécima muestra. Del mismo modo, se puede extraer una muestra para el distrito B. Otro ejemplo gráfico de un esquema circular de muestreo sistemático se da con N = 14 y n = 5. Luego k = entero más cercano. Deje que el primer número seleccionado aleatoriamente de 1 a 14 sea 7. Luego, la muestra sistemática circular consta de unidades con números de serie 7, 10, 13, 16 - 14 = 2, 19 - 14 = 5. Tener en cuenta que la conclusión sobre la resistencia se refiere solo a las áreas que cubre el sitio centinela. Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra: Actualización 2017 45 Anexo 8 Manejo clínico de casos resistentes detectados Todos los casos incluidos en la vigilancia deben someterse inmediatamente a tratamiento con la terapia estándar de múltiples fármacos (PQT) inmediatamente después de la recolección de la muestra sin esperar los resultados del laboratorio de referencia sobre el estado de la resistencia a los medicamentos. Si bien el PGL está preparando las directrices sobre el tratamiento de lepra, incluso en casos resistentes, hasta la fecha, la única orientación sobre el tratamiento de casos resistentes se puede encontrar en el informe de la Octava reunión del Comité de Expertos en Lepra celebrada en Ginebra en 2010. Según el informe, la siguiente es una guía sobre la posible gestión clínica de los casos resistentes. • Si los resultados muestran una cepa sensible, el tratamiento MB-PQT debe continuarse. • Para pacientes que se informa que son resistentes a Dapsona solamente, se puede continuar con MB-PQT estándar, pero se debe hacer un seguimiento al paciente al final del tratamiento y examinarse regularmente para detectar posibles recaídas. • Para pacientes con resistencia solo a quinolonas, se debe continuar con la PQT. • En caso de que el laboratorio de referencia informe M. leprae resistente a Rifampicina, se debe prescribir uno de los siguientes regímenes de tratamiento: 400 mg ofloxacina + 100 mg minociclina + 50 mg clofazimina, diariamente durante 6 meses; seguido de 400 mg ofloxacina O 100 mg minociclina + 50 mg clofazimina diariamente durante 18 meses adicionales. El régimen de tratamiento mencionado anteriormente es obligatorio para los pacientes que tienen tanto M. leprae resistente a Rifampicina como a Dapsona. Para casos resistentes a rifampicina, pero susceptibles a dapsona, también se sugiere el régimen de tratamiento anterior. Alternativamente, un régimen de tratamiento que incluya Dapsona podría discutirse con el centro nacional de referencia. Es obligatorio informar los resultados del tratamiento de pacientes con lepra detectados con resistencia a los medicamentos a través del formulario del Anexo 5 (ya sea en forma impresa o por medios electrónicos) y enviarlo al Programa Nacional de Lepra para que la información pueda ser ingresada en el registro de resistencia a los medicamentos. La red actual para la vigilancia de la resistencia a los medicamentos contra la lepra ha sido dirigida por la Organización Mundial de la Salud (OMS) desde 2008 con el apoyo financiero de The Nippon Foundation inicialmente y de las American Leprosy Missions y la Fondation Raoul Follereau en años recientes. Esta Guía ha sido preparada por el Programa Mundial de Lepra (GLP) de la OMS. Amplía el alcance de la vigilancia para incluir también nuevos casos de lepra. También se han incorporado las nuevas definiciones de caso de la Guía de monitoreo y evaluación de la Estrategia mundial para la lepra (2016-2020). La guía de vigilancia antimicrobiana promueve una cobertura mucho más amplia de las pruebas de acuerdo con la importancia general otorgada a la resistencia antimicrobiana (RAM) como se describe en la Estrategia mundial para la lepra 2016-2020. En 2015, la Asamblea Mundial de la Salud aprobó la Resolución WHA68.20 para abordar la RAM, por lo que se identificó la necesidad de una mayor atención y mejores sistemas de vigilancia, incluida la lepra. Por estas razones, GLP, en colaboración con socios clave y partes interesadas, ha preparado esta Guía como una actualización de las Directrices para la vigilancia mundial de la farmacorresistencia en la lepra (2009). Guía para la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos para lepra Actualización 2017 9 7 8 9 2 9 0 2 2 6 4 3 7 ISBN 978-92-9022-643-7
Le réseau actuel de surveillance de la pharmacorésistance de la lèpre est dirigé depuis 2008 par l'Organisation mondiale de la Santé (OMS) avec le soutien financier de la Fondation Nippone initialement et de l'American Leprosy Missions et la Fondation Raoul Follereau ces dernières années. Ce guide a été préparé par le Programme mondial de Lutte contre la Lèpre (GLP) de l'OMS. Il élargit le champ de la surveillance pour inclure également les nouveaux cas de lèpre. Les nouvelles définitions de cas du Guide de Suivi et d'Évaluation de la Stratégie mondiale de Lutte contre la Lèpre 2016–2020 ont également été incorporées. Le guide de surveillance antimicrobienne favorise une couverture beaucoup plus large des tests en fonction de l'importance globale accordée à la résistance antimicrobienne, comme l'indique la Stratégie mondiale de Lutte contre la Lèpre 2016–2020. En 2015, l'Assemblée mondiale de la Santé a adopté la Résolution WHA68.20 pour lutter contre la résistance aux antimicrobiens, de sorte que le besoin d'une attention accrue et de meilleurs systèmes de surveillance, y compris pour la lèpre, a été identifié. Pour ces raisons, GLP, en collaboration avec les principaux partenaires et parties prenantes, a préparé ce guide en tant que mise à jour des Directives pour la surveillance mondiale de la pharmacorésistance de la lèpre (2009). 9 7 8 9 2 9 0 2 2 6 4 2 0 ISBN 978-92-9022-642-2 Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre Mise à jour 2017 World Health House Indrprastha Estate Mahatma Gandhi Marg New Delhi, India www.searo.who.int Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre Mise à jour 2017 Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre : Mise à jour 2017 ISBN : 978 92 9022 642 0 © Organisation mondiale de la Santé 2018 Certains droits réservés. Ce travail est disponible sous la licence Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 3.0 IGO (CC BY-NC-SA 3.0 IGO ; https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/igo). Selon les termes de cette licence, vous pouvez copier, redistribuer et adapter le travail à des fins non commerciales, à condition que le travail soit cité de façon appropriée, tel qu’indiqué ci-dessous. Pour toute utilisation de ce travail, il ne devrait pas y avoir de suggestion que l’OMS appuie toute organisation spécifique, produits ou services. L’utilisation du logo de l’OMS n’est pas autorisée. Si vous adaptez le travail, alors vous devez conduire votre travail sous la même licence Creative Commons ou équivalente. Si vous faites une traduction de ce travail, vous devez ajouter l’avertissement suivant avec la citation suggérée : « Cette traduction n’a pas été créée par l’Organisation mondiale de la Santé (OMS). L’OMS n’est pas responsable du contenu ou de l’exactitude de cette traduction. L’édition originale en anglais est la version authentique et obligatoire ». Toute médiation relative aux litiges découlant de la licence doit être menée conformément aux règles de médiation de l’Organisation mondiale de la Propriété intellectuelle. Citation suggérée. Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre : Mise à jour 2017 New Delhi : Organisation mondiale de la Santé, Bureau régional pour l’Asie du Sud-Est ; 2017. Licence : CC BY-NC-SA 3.0 IGO. Données de catalogage avant publication (CIP). Les données CIP sont disponibles à l’adresse http://apps.who.int/iris. Les ventes, les droits et les licences. Pour acheter les publications de l’OMS, voir http://apps.who.int/bookorders. Pour soumettre des demandes d’utilisation commerciale et des questions sur les droits et les licences, voir http://www.who.int/ about/licensing. Documents provenant de tiers. Si vous souhaitez réutiliser le contenu de ce travail qui est attribué à un tiers, tel que des tableaux, des figures ou des images, il est de votre responsabilité de déterminer si une autorisation est nécessaire pour cette réutilisation et d’obtenir la permission du détenteur du droit d’auteur. Le risque de réclamations résultant de la violation de tout élément appartenant à des tiers dans le travail incombe exclusivement à l’utilisateur. Limitation de responsabilité. Les désignations employées et la présentation adoptée dans ce rapport ne saurait être interprétées comme exprimant une prise de position de l’OMS sur le statut juridique ou le régime d’un pays, d’un territoire, d’une ville ou d’une région quelconque, non plus que sur le tracé de ses frontières ou limites. La ligne en relief segmentée ou pointillée sur les cartes représentent des lignes de frontière approximatives pour lesquelles il n’y a pas encore d’accord complet. La mention de sociétés spécifiques ou de certains produits de fabricants n’implique pas qu’ils sont approuvés ou recommandés par l’OMS de préférence à d’autres de nature similaire qui ne sont pas mentionnés. Sauf erreurs et omissions, les noms des produits exclusifs sont distingués par des majuscules initiales. Toutes les précautions raisonnables ont été prises par l’OMS pour vérifier les informations contenues dans cette publication. Toutefois, les données publiés sont diffusées sans aucune garantie d’aucune sorte, expresse ou implicite. La responsabilité de l’interprétation et de l’utilisation des données incombe au lecteur. En aucun cas, l’OMS ne sera responsable des dommages résultant de son utilisation. Photos de couverture : M. Masanori Matsuoka Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 2017 iii Table des matières Auteurs .......................................................................................................................... iv Sigles et acronymes ......................................................................................................... v Résumé analytique ....................................................................................................... vii 1. Objectifs de ce guide et sa population cible ...........................................................1 2. Contexte ................................................................................................................2 3. Justification de l’élaboration du guide ....................................................................3 4. Stratégie mondiale de Lutte contre la Lèpre 2016–2020 en bref .............................4 5. Vu d’ensemble du système de surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre...................................................................................5 5.1 Objectifs .......................................................................................................5 5.2 Définitions ....................................................................................................5 5.3 Résistance parmi les nouveaux cas ...............................................................6 5.4 Résistance parmi les cas de retraitement .......................................................7 5.5 Schémas pour la surveillance de la résistance antimicrobienne dans la lèpre .................................................................................................8 6. La mise en place ou l’expansion d’un système de surveillance au niveau national ......................................................................................................9 6.1 Sélection des laboratoires biologiques ou microbiologiques ...........................9 6.2 Sélection des laboratoires de contrôle de qualité .........................................10 6.3 Identification des établissements sanitaires collectant des échantillons ........11 6.4 Calcul de la taille de l’échantillon ................................................................12 6.5 Collecte systématique des échantillons ........................................................13 6.6 Examens faits au laboratoire ........................................................................16 6.7 Enregistrement systématique de l’information .............................................20 6.8 Monitorage de la résistance aux antimicrobiens ...........................................21 7. Bibliographie .......................................................................................................22 Annexes 1. Laboratoires internationaux de référence .............................................................25 2. Registre national de la Résistance aux Médicaments Anti-lépreux .........................26 3. Formulaire 1. Formulaire du rapport clinique pour les cas de lèpre MB à tester pour la résistance aux antimicrobiens .......................................................27 4. Formulaire 2. Rapport du laboratoire de biologie ................................................29 5. Formulaire d’information sur le traitement des cas résistants .................................32 6. Protocoles du laboratoire .....................................................................................33 7. Protocole pour la surveillance sentinelle ...............................................................42 8. Prise en charge clinique des cas résistants détectés ...............................................45 Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 2017iv Ce guide a été préparé par le Professeur Emmanuelle Cambau de l’Université Paris Diderot, France; le Docteur Laura Gillini du Programme mondiale de Lutte contre la Lèpre (GLP), Bureau régional de l’OMS pour l’Asie du Sud-est, New Delhi, Inde; et le Docteur Matsuoka Masanori du Musée national de la Lèpre, Jukanbo, Japon. Les personnes suivantes ont aussi contribué : Dr Bertrand Cauchoix, Fondation Raoul Follereau, Paris, France Professeur Stewart Cole, École Polytechnique Fédérale de Lausanne, Suisse Dr Erwin Cooreman, GLP, Bureau régional de l’OMS pour l’Asie du Sud-est, New Delhi, Inde Dr Anil Kumar, Programme national Éradication de la Lèpre, New Delhi, Inde Dr V R R Pemmaraju, GLP, Bureau régional de l’OMS pour l’Asie du Sud-est, New Delhi, Inde Dr Rupali Roy, Programme national Éradication de la Lèpre, New Delhi, Inde Dr Paul Saunderson, American Leprosy Missions, Norvège Dr David Scollard, National Hansen Disease Program, Baton Rouge, Etats-Unis Dr Sirenda Vong, Health Emergency Information and Risk Assessment Department, Bureau OMS régional de l’Asie du Sud-est, New Delhi, Inde Professeur Aditama Tjandra Yoga, Adviseur au Directeur Regional, Bureau OMS régional de l’Asie du Sud-est, New Delhi, Inde M. Rakesh Mani Rastogi, Health Systems Development, Bureau OMS régional de l’Asie du Sud-est, New Delhi, Inde La version finale du document a été révisée après un atelier tenu à Hyderabad, en Inde, du 10 au 11 août 2017 pour discuter d’un modèle de résistance aux antimicrobiens dans la lèpre en Inde. Les participants de cet atelier comprenaient du personnel du Programme national d’Éradication de la Lèpre (Inde), les coordonnateurs au niveau de l’état et du district, le personnel de l’OMS, les experts de l’Institut Jalma de la lèpre et d’autres maladies mycobactériennes (Agra), la Fondation pour la Recherche médicale de Mumbai, le personnel des départements dermatologiques des hôpitaux de référence, des représentants des ONG (The Leprosy Mission, Netherlands Leprosy Relief, Lepra Royaume-Uni, American Leprosy Missions). Ils ont pris en compte les défis et les approches discutés avec les représentants des pays. Auteurs Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 2017 v ADN acide déoxyribonucléique AITA Association Internationale de Transport Aérien BAAR bacille acido-alcoolo resistant DRDR Région déterminant la résistance à la dapsone GLASS Système mondial de Surveillance de la Résistance aux Antimicrobiens (Global Antimicrobial Resistance Surveillance System) GLP Programme mondial de Lutte contre la Lèpre (Global Leprosy Programme) IB index bacillaire (bacillary index) ILEP Fédération internationale des associations anti-lèpre (International Federation of Anti-Leprosy Associations) MB multibacillaire MTN maladie tropicale négligée OMS Organisation mondiale de la Santé ONG organisation non-gouvernementale PB paucibacillaire PBS solution saline tamponnée au phosphate (phosphate buffered saline) PCR réaction en chaîne par polymérase (polymerase chain reaction) PCT polychimiothérapie QRDR région déterminant la résistance aux quinolones RLEP élément répétitif spécifique à M. leprae RRDR région déterminant la résistance à la rifampicine TB tuberculose WHA Assemblée mondiale de la Santé (World Health Assembly) Sigles et acronymes
Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 2017 vii L’émergence de la résistance aux médicaments antimicrobiens est une préoccupation et une menace pour de nombreux programmes d’intervention des maladies infectieuses, en particulier ceux qui font de la prévention secondaire (chimiothérapie) comme composant principal de leur stratégie de contrôle. La lutte contre la lèpre a été un grand succès, en grande partie grâce au développement de la polychimiothérapie (PCT) en 1981. Le déploiement de la PCT à la fin des années 1980 a été un facteur majeur pour réduire considérablement le fardeau de la lèpre jusqu’en 2005, après quoi un plateau a été observé dans le nombre de cas traités et une réduction beaucoup plus lente de la notification. Étant donné que la rifampicine est l’ossature du régime de la PCT, il est important de surveiller l’émergence de souches résistantes à la rifampicine, car des rapports et des publications récents ont indiqué l’existence d’une résistance à la rifampicine dans plusieurs régions endémiques. Avant l’introduction de la PCT, les patients étaient traités avec une monothérapie par la dapsone pendant plusieurs années. La résistance à la dapsone a été signalée depuis le début des années 1960. En cas de résistance à la rifampicine, les fluoroquinolones deviennent la catégorie préférée des anti-lépreux de seconde ligne. Malheureusement, les souches résistantes aux quinolones de Mycobacterium leprae ont également été signalées dans plusieurs pays, probablement en raison de l’utilisation intensive des quinolones pour traiter plusieurs types d’infections. La résistance à la clofazimine est encore rare mais cet antimicrobien ne peut pas être administré seul. Pour relever le défi de maîtriser la maladie et être en mesure de répondre à une augmentation de la circulation des souches résistantes aux anti-lépreux, il est essentiel de surveiller la sensibilité aux anti-lépreux dans le monde, ainsi que de détecter la résistance parmi les deux nouveaux et les cas de retraitement. Résumé analytique
Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 2017 1 Ce document vise à guider les pays sur les moyens d’évaluer la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre. Il met en évidence les mécanismes de soutien clinique, de terrain et de laboratoire qui doivent être mis en place pour entreprendre cette activité. La résistance aux antimicrobiens est l’un des principaux domaines d’intervention de la Stratégie mondiale de Lutte contre la Lèpre 2016−2020, dans le cadre de son deuxième pilier « Mettre fin à la lèpre et ses complications ». Dans le cadre de cette stratégie, tous les pays qui détectent la lèpre doivent mettre en place un système permettant de tester la résistance aux antimicrobiens dans un laboratoire national ou dans un laboratoire situé à l’étranger. Ce guide vise à promouvoir l’utilisation d’une double approche uniforme : (1) Pour détecter la résistance primaire et secondaire aux médicaments antilépreux, à savoir, la rifampicine, la dapsone et l’ofloxacine; (2) standardiser les rapports relatifs aux résultats des tests biologiques effectués et sur les résultats du traitement des patients. La disponibilité des données sur la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre permettra la surveillance mondiale, nationale et locale de la résistance aux anti-lépreux de façon continue en différenciant les nouveaux cas et les cas de retraitement de la lèpre (voir les définitions dans la section 5.2). Cela aiderait également à identifier les facteurs de risque de résistance aux anti-lépreux (âge, sexe, lieu de résidence, catégorie / type de patient). Le public cible de la mise à jour du guide de surveillance de la résistance aux anti- lépreux concerne les directeurs des programmes de lèpre nationaux, les cliniciens et le personnel dans les centres de référence et des sites sentinelles, des coordonnateurs et techniciens de laboratoire de lèpre, ainsi que des consultants travaillant dans le domaine de la lèpre et des maladies tropicales négligées (MTN). Objectifs de ce guide et sa population cible 1 Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 20172 Le réseau actuel de surveillance de la résistance aux anti-lépreux a été mis en œuvre conjointement par l’OMS et la Fondation Nipponne, suivi par un financement de la Fédération internationale des associations contre la lèpre (ILEP) entre 2008 et 2016. Les pays ci-dessous sont ceux ayant participé au réseau de surveillance sentinelle : le Bénin, le Brésil, le Burkina-Faso, la Chine, la Colombie, l’Éthiopie, la Guinée, l’Inde, l’Indonésie, le Madagascar, le Mali, le Mozambique, la Birmanie, le Népal, le Niger, le Pakistan, les Philippines, le Viet Nam et le Yémen. En 2016 le Sri Lanka a commencé à faire des essais sur des échantillons. Les pays qui font partie du réseau testent les échantillons dans des laboratoires nationaux, comme c’est le cas du Brésil (deux laboratoires d’essais), la Chine, la Colombie, l’Inde (quatre laboratoires d’essais), l’Indonésie et le Népal, ou envoient des échantillons dans les quatre laboratoires ci-après : National Hansen’s Disease Program Laboratory Research Branch, Baton Rouge, Louisiane, États-Unis ; l’Institut de Santé globale de l’École Polytechnique Fédérale de Lausanne, Suisse ; le Centre national de référence sur les mycobactéries et la résistance aux médicaments antituberculeux, Hôpital Lariboisière, Paris, France ; et le Leprosy Research Centre, National Institute of Infectious Diseases, Tokyo, Japon. Ces laboratoires sont considérés comme des laboratoires de référence au niveau international pour la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre. Les laboratoires de référence qui font partie du réseau en 2017 sont listés dans l’annexe 1. Certains laboratoires nationaux sont situés dans des hôpitaux et / ou des institutions publiques, tandis que d’autres sont situés dans des hôpitaux gérés par des organisations non gouvernementales (ONG). Le soutien de l’OMS / ILEP aux laboratoires consiste à financer certains laboratoires internationaux (Lausanne et Paris) et à financer une réunion biannuelle organisée par l’OMS pour discuter des résultats et des méthodes de laboratoire. Le coût des essais au niveau national est supporté par les gouvernements nationaux ou par les ONG internationales. Le réseau est devenu opérationnel en 2008 suite à l’identification de mutations associées à la résistance aux anti-lépreux dans des loci génomiques spécifiques de Mycobacterium leprae, conférant une résistance à la dapsone, à la rifampicine et à l’ofloxacine. Initialement, les essais étaient recommandés uniquement pour les cas de rechute afin d’évaluer le niveau de résistance secondaire et les résultats correspondants ont été publiés dans le Relevé épidémiologique hebdomadaire de l’OMS (la publication la plus récente date de juin 2011 : Relevé épidémiologique hebdomadaire 2011 ; 23 (86) : 2334). Les premières lignes directrices sur la surveillance de la résistance aux médicaments dans la lèpre ont été publiés en 2009 (Lignes directrices pour la surveillance mondiale de la résistance aux médicaments dans la lèpre. New Delhi : Bureau régional de l’OMS pour l’Asie du Sud-Est ; 2009). Contexte2 Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 2017 3 Ce guide a été préparé par le Programme mondial de Lutte contre la Lèpre (GLP) de l’OMS en coordination avec les principaux acteurs de la lutte contre la lèpre. Depuis 2011, certains pays ont déjà commencé à tester des nouveaux cas de lèpre pour la résistance aux anti- lépreux en plus des cas de rechute afin d’être en mesure d’évaluer le niveau de la résistance primaire aux ani-lépreux. En outre, la difficulté de répondre à la définition de la rechute a été un obstacle à la mesure de résistance secondaire. Cela pourrait changer à la lumière des nouvelles définitions de cas de lèpre incluses dans la Stratégie mondiale de Lutte contre la Lèpre 2016−2020 : Guide de suivi et d’évaluation (voir également la section 5.2). Les laboratoires participant au réseau ont été évalués pour la qualité de l’amplification génomique par le laboratoire international de référence du Japon en 2009 et 2011 avec une bonne concordance. Chacun des laboratoires participants utilise ses propres techniques, telles que le séquençage direct des produits de la réaction en chaîne de la polymérase (PCR), l’hybridation d’ADN, l’analyse par fusion à haute résolution ou le séquençage du génome entier. La détection de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre n’a pas été standardisée jusqu’à ce jour. Les échantillons collectés étaient des frottis de peau (selon les directives de 2009) ; des années plus tard, des biopsies cutanées dermiques ont également été recueillies et analysées. Toutes les données recueillies à l’échelle mondiale entre 2010 et 2015 ont été synthétisées lors de la consultation mondiale sur la surveillance de la résistance aux antimicrobiens en octobre 2016. Des rapports formels ont été reçus sur un total de 1086 cas de rechute et 776 nouveaux cas testés dans le monde avant la fin de 2015, parmi lesquels 57 cas de rechute (5,2 % de résistance secondaire) et 16 nouveaux cas (2,1 % de résistance primaire). Ces résultats ont souligné la nécessité d’étendre le réseau de surveillance non seulement en termes de laboratoires et de pays concernés, mais aussi en termes de portée, en augmentant le nombre d’échantillons testés sur le total des cas détectés et en mettant en œuvre un modèle de surveillance continue. Ceci est également en accord avec l’importance qui a été donnée à la surveillance aux antimicrobiens dans la lèpre dans le cadre de la Stratégie mondiale de Lutte contre la Lèpre de 2016−2020. L’Assemblée mondiale de la Santé a publié une résolution sur la résistance aux antimicrobiens en 2015 (WHA 68.20) ainsi qu’un plan d’action mondial ; par conséquent, cette importance accordée dans le cadre de la Stratégie mondiale de Lutte contre la Lèpre s’inscrit dans une attention mondiale générale à la résistance aux antimicrobiens. Pour ces raisons, GLP, en collaboration avec ses principaux partenaires et parties prenantes, a préparé ce guide en tant que mise à jour des orientations de surveillance de 2009. 3 Justification de l’élaboration du guide Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 20174 4 Stratégie mondiale de Lutte contre la Lèpre 2016–2020 en bref Zéro cas de lèpre Zéro cas de transmission de l’infection Zéro cas d’incapacité due à la lèpre Zéro stigmatisation et zéro discrimination VISION u n m o n d e s a n s l è p re STRATEGIE MONDIALE DE LUTTE CONTRE LA LEPRE 2016-2020 Réduire davantage le fardeau mondiale et locale due à la lèpre BUT CIBLES INDICATEURS Cibles d’ici 2020 Nombre de nouveaux cas pédiatriques présentant des difformités visibles 0 Pourcentage de nouveaux cas présentant des difformités visibles <1 par million Nombre de pays dont la législation autorise la discrimination fondée sur la lèpre 0 PILIERS ET COMPOSANTES 1. Renforcer l’appropriation par les autorités, ainsi que la coordination et le partenariat • Veiller à l’engagement politique et doter les programmes de lutte contre la lèpre de ressources suffisantes. • Contribuer à la couverture sanitaire universelle en accordant une attention particulière aux enfants, aux femmes, aux populations mal desservies, notamment les migrants et les personnes déplacées. • Encourager les partenariats avec les acteurs étatiques et non étatiques et promouvoir la collaboration intersectorielle, ainsi que les partenariats au niveau international et dans les pays. • Faciliter et mener des travaux de recherche fondamentale et opérationnelle sur l’ensemble des aspects liés à la lèpre et tirer le meilleur parti de la base de données factuelles en vue d’orienter les politiques, les stratégies et les activités. • Renforcer la surveillance et les systèmes d’information sanitaire pour le suivi et l’évaluation des programmes (y compris les systèmes d’information géographique). 2. Mettre fin à la lèpre et à ses complications • Sensibiliser davantage les patients et la communauté à la lèpre. • Promouvoir le dépistage précoce des cas, par le biais de la recherche active des cas (telles que les campagnes) dans les zones de forte endémicité, ainsi que par la prise en charge des contacts. • Veiller à la mise en route rapide du traitement et à son observance, en intensifiant notamment les efforts visant à améliorer les schémas thérapeutiques. • Améliorer la prévention et la prise en charge des incapacités. • Renforcer la surveillance de la résistance aux antimicrobiens, notamment le réseau de laboratoires. • Encourager les approches novatrices pour la formation, l’orientation-recours des patients et maintenir l’expertise en matière de lèpre, telle que la cybersanté. • Promouvoir les interventions ayant trait à la prévention de l’infection et de la maladie. 3. Mettre fin à la discrimination et promouvoir l’inclusion • Promouvoir l’inclusion dans la société en s’attaquant à toutes les formes de discrimination et de stigmatisation. • Favoriser l’autonomisation des personnes touchées par la lèpre et renforcer leur capacité à participer activement aux services de prise en charge de cette maladie • Impliquer les communautés dans l’action visant à améliorer les services de prise en charge de la lèpre • Favoriser la mise en place de coalitions entre les personnes touchées par la maladie et encourager l’intégration de ces coalitions ou de leurs membres dans d’autres organisations communautaires • Favoriser l’accès aux services de soutien social et financier, par exemple pour faciliter les sources de revenus pour les personnes touchées par la lèpre et leur famille. • Soutenir la réhabilitation dans les collectivités des personnes souffrant d’incapacités liées à la lèpre. • Œuvrer à l’abrogation des lois discriminatoires et promouvoir les politiques qui favorisent l’inclusion des personnes touchées par la lèpre. Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 2017 5 5.1 Objectifs L’objectif du système de surveillance consiste à détecter avant tout la résistance à la rifampicine parmi les cas de lèpre, qu’elle soit seule ou associée à la résistance à la dapsone et / ou à l’ofloxacine parmi les nouveaux cas (un indicateur de la résistance primaire) et, parmi les cas de retraitement (un indicateur de résistance secondaire) et de surveiller les taux de résistance au fil du temps. Il faudrait également fournir des informations individuelles afin qu’une association possible entre la résistance et des groupes spécifiques d’âge et de sexe et / ou de la localisation géographique des cas de lèpre puisse être identifiée. 5.2 Définitions Nouveau cas (de lèpre) : patient diagnostiqué pour la lèpre et qui n’a jamais reçu de traitement contre cette maladie. Cas de retraitement (de la lèpre) : patient diagnostiqué pour la lèpre qui a déjà reçu un traitement contre cette maladie. Les cas de retraitement sont en outre classés dans les groupes suivants : • Retraitement après avoir été perdu de vue : un patient diagnostiqué pour la lèpre qui a abandonné le traitement avant son achèvement et qui retourne à l’établissement de santé pour achever le traitement. • Rechute : un patient qui a déjà terminé un cycle de traitement complet contre la lèpre et qui revient avec des signes et des symptômes de la maladie qui selon le clinicien ne seraient pas dus à une réaction lépreuse. • Transfert entrant : patient qui a commencé un traitement dans un établissement et se présente dans un autre pour poursuivre son traitement. • Autre cas de retraitement : tout cas de lèpre qui n’entre pas dans l’une des catégories ci-dessus et nécessite un traitement. Les nouveaux cas et les cas de retraitement peuvent être classés comme suit : • Cas de lèpre paucibacillaire (PB) : un cas de lèpre présentant 1 à 5 lésions cutanées et sans présence manifeste de bacilles lépreux (ou bacilles acido-alcoolo résistants, BAAR) après un frottis cutané. • Cas de lèpre multibacillaire (MB) : un cas de lèpre présentant plus de 5 lésions cutanées ; avec implication nerveuse (névrite pure ou un certain nombre de lésions cutanées et névrite) ; ou avec présence avérée de BAAR dans un frottis cutané, indépendamment du nombre de lésions cutanées. 5 Vu d’ensemble du système de surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 20176 5.3 Résistance parmi les nouveaux cas Les échantillons à tester. Frottis dermiques ou biopsies cutanées. Agents antimicrobiens à étudier. Les échantillons sont testés pour détecter des mutations connues pour être associées à la résistance à la rifampicine, à la dapsone et à l’ofloxacine. Critères d’inclusion. Pour détecter la résistance primaire, un certain pourcentage de nouveaux cas de lèpre doivent être testés par an. Afin d’être efficace ou coût-efficace (avoir une PCR positive et des essais réussis pour la résistance aux antimicrobiens), seuls les cas de MB à bacilloscopie positive avec un index bacillaire (IB) ≥ 2+ seront testés, car ils ont plus de chances d’obtenir une PCR positive. Définir la méthode de surveillance. La surveillance de la résistance aux antimicrobiens primaire dans la lèpre peut être effectuée sur la base de : • un système de surveillance continue qui teste tous les nouveaux cas MB (recommandé pour les pays ayant une capacité de laboratoire élevé, des ressources adéquates et un petit nombre de cas SEULEMENT) ; • une enquête transversale (recommandée pour les pays ne disposant pas de données de base représentatives et ayant des ressources financières suffisantes) ; • un système de surveillance sentinelle dans le but de surveiller les tendances de la résistance à la rifampicine chez les nouveaux cas de lèpre sur une période donnée dans diverses zones géographiques (recommandé pour les pays ayant des données de référence nationales / après une enquête nationale). Un système sentinelle après une enquête nationale pourrait être une approche raisonnable pour générer des données constantes et être en mesure d’analyser les tendances • mise en place d’une taille d’échantillon arbitraire, en calculant une proportion cible de tous les nouveaux cas MB cas à tester en fonction de la capacité / des ressources. Cela ne devrait PAS être inférieure à 10% du nombre total de nouveaux cas MB notifiés l’année précédente (recommandé pour les pays ne disposant pas de données de référence nationales et des ressources nécessaires pour effectuer une enquête nationale). Des laboratoires nationaux ou internationaux seront identifiés pour effectuer les essais. Des échantillons cutanés seront prélevés dans des établissements sélectionnés (sites d’étude pendant des enquêtes ou des sites de surveillance sentinelle) après avoir obtenu le consentement du patient et transportés vers le laboratoire national ou international correspondant désigné. Lorsque les échantillons sont envoyés à l’étranger par avion, ils doivent être expédiés conformément aux règlements de l’Association internationale du Transport aérien (AITA). Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 2017 7 Sélection des établissements pour le santé pour le prélèvement d’échantillons. Comme les frottis ou les biopsies cutanés ne sont pas systématiquement prélevés dans les petits établissements de santé (ex. dispensaires, ...) les patients qui seront testés devront être identifiés parmi ceux qui consultent dans des établissements plus spécialisés où des frottis de peau et / ou des biopsies sont systématiquement pratiqués. Dans les installations sélectionnées, tous les nouveaux patients pour lesquels un prélèvement sera positif avec un index bacillaire ≥ 2+ seront testés pour la résistance aux médicaments. Système d’information. Les dossiers des patients seront conservés à l’établissement collectant les échantillons, au laboratoire et au niveau national en utilisant un registre national de résistance aux antimicrobiens (exemple en Annexe 2). 5.4 Résistance parmi les cas de retraitement Échantillons à tester. Suc dermique obtenu par frottis de peau ou biopsies cutanées Agents antimicrobiens à étudier. Les échantillons sont testés pour des mutations connues pour être associées à la résistance à la rifampicine, à la dapsone et à l’ofloxacine. Critères d’inclusion. Pour détecter la résistance secondaire, tous les cas de lèpre de retraitement doivent être testés à l’exception des cas transférés (sauf si ces cas sont jugés à risque d’être resistant en raison d’un traitement irrégulier). Dans ce cas, ils doivent être définis comme « autres retraitements » dans la fiche d’inclusion. Afin d’avoir une PCR positive et un test de résistance aux médicaments réussi, seuls les cas MB confirmés positifs au frottis avec un index bacillaire (IB) ≥ 2+ devraient être testés, car ceux-ci ont une plus grande chance d’être positifs en PCR. Conception du système. La surveillance de la résistance aux antimicrobiens parmi les cas de retraitement de la lèpre devrait être effectuée par une méthode de surveillance continue, puisque les essais couvrent tous les cas de retraitement (avec IB ≥ 2+) au fil des années. Des laboratoires nationaux ou internationaux seront identifiés pour effectuer les essais. Des échantillons de peau (biopsies ou frottis cutanés) seront prélevés dans des centres cliniques identifiées pour le prélèvement d’échantillons afin de tester la résistance aux antimicrobiens et, transportés vers le laboratoire d’essai national ou international correspondant désigné. Lorsque les échantillons sont expédiés par avion, les règlements de l’AITA doivent être suivis (ceux-ci peuvent être trouvés à l’adresse http://apps.who.int/iris/ bitstream/10665/254788/1/WHO-WHE-CPI-2017.8-eng.pdf?ua=1). Pour mettre en place la surveillance selon cette méthodologie, tous les cas de retraitement suspects devraient être référés à ces centres cliniques spécifiques pour confirmer leur diagnostic et collecter des échantillons aux fins de surveillance de la résistance antimicrobienne. Cela aurait l’avantage indirect d’améliorer la qualité du diagnostic des cas de lèpre suspects de retraitement et Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 20178 d’améliorer éventuellement la prise en charge des réactions, étant donné que certains de ces patients pourraient en effet être des lépreux ayant déjà achevé un traitement mais subissant encore des réactions immunitaires extrêmement risqué capable de développer des handicaps et / ou d’aggraver une déficience déjà existante. Système d’information. Les dossiers des patients seront conservés à l’établissement collectant les échantillons, au laboratoire et au niveau national en utilisant un registre national de résistance aux antimicrobiens (un exemple est présenté à l’annexe 5). 5.5 Schémas pour la surveillance de la résistance antimicrobienne dans la lèpre Fig. 1. Schéma pour la surveillance de la résistance antimicrobienne dans la lèpre Programme mondial de Lutte contre la Lèpre de l’OMS Publier le rapport annuel sur la lèpre dans le Relevé épidémiologique hebdomadaire de l’OMS Ministère de la Santé Compiler les données dans le registre national de résistance aux antimicrobiens Soumettre des données à l’OMS à travers la collecte des données annuelles du rapport mondiale de lutte contre la lèpre Laboratoire de référence/ laboratoire de référence mondial Fournit des échantillons pour le contrôle de la qualité pour les pays et fait subir un contrôle de qualité par le Laboratoire mondial de référence Renforcement des capacités des laboratoires nationaux Stockage des données, y compris des mutations détectées Laboratoire (soit dans le pays ou à l’étranger) PCR + Séquençage pour les mutations du gène folP1, rpoB et gyrA Rapporter les résultats au centre de prélèvement des échantillons, au ministère de la Santé et au de la Santé et au laboratoire de référence national ou mondial Établissement collectant des échantillons (sites sentinelles / sites d’étude) Pour tous les nouveaux cas MB et de retraitement, prélever des échantillons (frottis cutané ou biopsie). S’il est trouvé BI≥ 2+ envoyer des échantillons au laboratoire pour les essais de résistance aux antimicrobiens Institut de Sante globale, Lausanne, Suisse Dépôt des mutations détectées Source : Table développée par le professeur E. Cambau, le Dr M. Matsuoka et le Dr L. Gillini Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 2017 9 Plusieurs activités sont nécessaires pour mettre en place et / ou étendre le système de surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre : (1) identifier le(s) laboratoire(s) chargé(s) de réaliser des essais moléculaires pour la résistance à la rifampicine, à la dapsone et à l’ofloxacine. Ces laboratoires pourraient être situés dans le pays ou à l’étranger (l’un des quatre laboratoires de référence) et pourraient être plus d’un par pays, selon les besoins ; (2) identifier un laboratoire hors du pays parmi l’un des quatre laboratoires internationaux (pour les pays effectuant des essais dans des laboratoires nationaux uniquement). Une partie des échantillons devrait être envoyée périodiquement au laboratoire externe ; (3) identifier les établissements sanitaires pouvant collecter des échantillons afin de tester la résistance des antimicrobiens dans les nouveaux cas MB avec un IB ≥2+ ; (4) calculer l’échantillon (nombre de nouveaux cas MB à tester) pour chaque centre clinique participant ; (5) mettre en place un système de transport pour envoyer des échantillons au laboratoire d’essai ; (6) collecter systématiquement les informations relatives aux patients testés et aux résultats correspondants, y compris les résultats du traitement (qui pourraient être réalisés par le Programme national, par un institut national de santé publique/de recherche ou par l’un des laboratoires nationaux de contrôle si l’informatique/ les ressources humaines disponibles sont adéquats) ; (7) surveiller les tendances de la résistance dans le temps et par zone géographique, sexe, âge, catégorie / type de patient et, si possible, par facteurs socioéconomiques. 6.1 Sélection des laboratoires de microbiologie pratiquant les tests La capacité actuelle des laboratoires devrait être renforcée pour mener les activités de surveillance de la lèpre. La surveillance de la résistance aux antimicrobiens parmi les nouveaux cas serait une activité permanente et les centres participants - nationaux et internationaux - devraient prendre en compte la nécessité de maintenir la capacité pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens sur une période de temps, à moins que le modèle adopté soit une enquête nationale pour une période précise. Cependant, même dans ce dernier cas, le travail effectué pour réaliser l’enquête conduira plus tard à la mise en place d’un système de surveillance 6 La mise en place ou l’expansion d’un système de surveillance au niveau national Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 201710 sentinelle de routine pour assurer la disponibilité des données dans le temps ou mener un suivi par une nouvelle enquête après 3 à 5 ans. Un laboratoire national ou international est suffisant pour les essais dans les pays à faible charge de lèpre, tandis que les pays avec un grand nombre de cas par an devraient identifier plus d’un laboratoire pour pouvoir tester tous les cas de retraitement et une partie des nouveaux cas MB. Les laboratoires pourraient être gérés par le gouvernement ou par une ONG. Dans le cas où une ONG ou un laboratoire international est identifié, le Programme National de Lutte contre la Lèpre devrait élaborer un protocole d’entente (MoU) pour assurer l’accès aux données de résistance par le Programme. Les laboratoires d’essais nationaux et internationaux devraient tester les échantillons tout au long de l’année jusqu’à ce que le nombre indiqué d’échantillons à tester soit atteint. Bien que la réalisation pratique des essais est la responsabilité du laboratoire, la disponibilité d’un réseau pour la collecte, le transport, le stockage des échantillons et l’expédition, ainsi que la collecte et la transmission des données pour permettre la surveillance des données de résistance doivent être assurés par le Programme national de Lutte contre la Lèpre. La possibilité d’établir des essais dans un laboratoire de tuberculose (TB) ou dans un laboratoire qui sert de référence à l’agence nationale chargée de la résistance aux antimicrobiens lors de la mise en place du système de surveillance devrait être envisagée. 6.2 Sélection des laboratoires de contrôle de qualité Dans le cadre du renforcement des capacités et pour assurer la fiabilité des données nationales, chaque pays qui teste des échantillons au niveau national devrait identifier un laboratoire de référence pour effectuer un contrôle de qualité. Les programmes nationaux de lutte contre la lèpre devraient élaborer un protocole d’entente pour garantir l’accès aux services liés au contrôle de la qualité. Si le contrôle international de la qualité est un devoir du laboratoire international de référence, l’envoi régulier d’échantillons aux fins du contrôle de qualité, l’enregistrement et la communication des informations connexes, ainsi que le stockage et la révision des résultats des activités de contrôle qualité sont des tâches du Programme national de Lutte contre la Lèpre. Le contrôle de la qualité des laboratoires nationaux sera effectué sous la supervision du laboratoire international de référence identifié comme partenaire (Baton Rouge, États-Unis ; Tokyo, Japon ; Paris, France et Lausanne, Suisse, voir annexe 1). Pour préparer du matériel standard avec l’aide du laboratoire international de référence, on enverrait des échantillons représentatifs d’ADN et de bacilles (sans mutation, mutation connue) une fois par an. En outre, le laboratoire de référence mènera des missions dans le pays une fois tous les 1 à 3 ans afin d’accroître la capacité des laboratoires nationaux et dans le cadre de l’évaluation du contrôle de la qualité. Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 2017 11 Tous les échantillons positifs et négatifs de chaque cas doivent être archivés aux fins de conduire des essais pour assurer la qualité ainsi que d’autres essais. Les échantillons doivent être congelés dans le laboratoire pendant au moins 10 ans. En cas de nécessité, un dépôt peut être organisé dans un laboratoire de référence, notamment pour les souches présentant de nouvelles mutations. Ceux-ci devraient être partagés avec les laboratoires de référence. Les laboratoires internationaux de référence devraient également être soumis à un système de contrôle de la qualité une fois par an grâce à une surveillance coordonnée par le laboratoire du Centre de Recherche sur la Lèpre, Institut national des Maladies Infectieuses, Tokyo, Japon. Bien que la tâche pratique de se conformer aux protocoles de contrôle de la qualité est la responsabilité des laboratoires nationaux et internationaux, assurer que les ressources et les mécanismes sont en place pour le contrôle de la qualité est un devoir du Programme national de Lutte contre la Lèpre. 6.3 Identification des centres cliniques collectant des échantillons Les établissements sanitaires sont identifiées pour la collecte des échantillons des nouveaux cas MB et des cas de retraitement MB à tester pour la résistance aux antimicrobiens. Pour des raisons pratiques, il est suggéré que les centres sélectionnés soient des centres de niveau secondaire et tertiaire où des frottis / biopsies de peau sont faits de manière régulière pour évaluer / classifier les patients. Cela permettrait de prélever une bonne qualité des échantillons et d’éviter le renvoi des nouveaux patients vus dans un centre périphérique pour un centre de référence uniquement à des fins de surveillance des antimicrobiens. Tous les cas suspects de retraitement doivent être référés dans un établissement de niveau secondaire pour confirmer le diagnostic. Pour les grands pays comme l’Inde et le Brésil, au moins un établissement sanitaire collectant des échantillons devrait être identifié dans chaque zone parmi toutes les établissements de niveau secondaire / tertiaire qui fournissent des services de lutte contre la lèpre, qu’il s’agisse d’un établissement gouvernemental ou d’une ONG. Le cas échéant, une formation devrait être dispensée aux techniciens de laboratoire dans les hôpitaux de district. L’établissement au niveau du district devrait être choisie au hasard si plus d’un centre de niveau secondaire / tertiaire est disponible. Pour les pays avec moins de cas, les centres de collecte d’échantillons doivent être sélectionnés uniquement dans les grandes juridictions administratives (état / province / région). Pour de tels pays, la sélection des centres de santé de collecte d’échantillons par état / province / région devrait être faite au hasard parmi les centres de niveau secondaire / tertiaire disponibles dans cet état / cette province / région. Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 201712 Dans chaque établissement sanitaire de collecte d’échantillons, les formulaires appropriés doivent être remplis pour accompagner l’envoi des échantillons ; l’information du patient doit être enregistrée pour permettre la communication des résultats et la prescription d’un traitement adéquat en cas de détection d’une résistance. Les centres de prélèvement d’échantillons devraient demander le consentement écrit de chaque patient (ou des parents dans le cas d’un mineur) après une brève séance d’information sur la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre. Si l’un des établissements sanitaires sélectionné est une institution / hôpital d’ONG (qu’il s’agisse d’un centre de prélèvement d’échantillons ou d’un laboratoire d’essai), le Programme national de Lutte contre la Lèpre devrait élaborer un protocole d’entente pour garantir l’accès aux services et la communication des informations relatives à la résistance aux antimicrobiens. Tandis que la tâche pratique de collecte et d’expédition des échantillons est la responsabilité de chaque centre de collecte d’échantillons, assurer l’expédition régulière des échantillons pour les essais, l’enregistrement et la notification des informations connexes, ainsi que superviser pour assurer que les protocoles standards sont respectés, sont des devoirs des programmes nationaux de lutte contre la lèpre. 6.4 Calcul de la taille de l’échantillon Pour chaque établissement de collecte d’échantillons (un site d’étude dans une enquête ou un site sentinelle dans un modèle de surveillance), un calcul de la taille de l’échantillon doit être effectué conformément à la formule donnée dans l’annexe 7. Pour les pays ne disposant pas de données de référence locales sur la résistance, la taille de l’échantillon pour chaque établissement de collecte d’échantillons doit être déterminée avec le but de tester au moins 10 % du nombre total de nouveaux cas MB détectés l’année précédente. Pour tous les cas suspects de retraitement, un système devrait être mis en place pour assurer leur référence vers des établissements secondaires / tertiaires où leurs échantillons seront prélevés si les cas de retraitement étaient confirmés (les cas transférés où il n’y a aucune suspicion de résistance ne doivent pas être inclus). 6.5 Collecte systématique des échantillons Pour tous les cas répondant aux critères d’inclusion, l’échantillonnage des prélèvements se fera avec le consentement du patient selon la pratique clinique et le traitement en laboratoire : Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 2017 13 • soit deux échantillons de suc dermique obtenu par frottis de la peau de la lésion avec un IB ≥ 2+ devraient être pris, avec le lobe de l’oreille qui est le site d’échantillonnage préféré conjointement avec la lésion de la peau la plus importante ; ou • soit une biopsie cutanée (par exemple, biopsie à l’emporte-pièce de 4 mm) prélevée sur une lésion proéminente avec un IB ≥ 2+. Pour les nouveaux cas, la collecte systématique (régulière) d’échantillons doit se poursuivre sur chaque centre clinique jusqu’à ce que le nombre d’échantillons à collecter soit atteint, tel que défini dans le calcul de la taille de l’échantillon (section 6.4) ou jusqu’à atteindre un nombre de 10 % des cas MB détectés dans cette établissement au niveau du district ou de l’état au cours de l’année précédente. L’accord du patient doit être obtenu conformément aux directives éthiques du pays. Pour les patients de moins de 18 ans, le consentement des parents doit être sollicité. 6.5.1 Échantillons de suc dermique obtenu par frottis cutanés Les échantillons de suc dermique obtenu par frottis cutanés sont prélevés de la même manière que les frottis cutanés pour examen microscopique, à l’aide d’une lame jetable en acier inoxydable. Des précautions doivent être prises pour éviter la contamination croisée. La lame en acier inoxydable contenant les raclures de suc dermique doit être rincée dans un tube de centrifugeuse de 1,8-2 ml (avec bouchon à vis) pré-rempli avec 1 ml d’éthanol à 70 % (éthanol absolu de biologie moléculaire à 70 % v / v + eau déminéralisée stérile MilliQ ou de qualité d’injection humaine de 30 % v / v, le mélange étant préparé dans le laboratoire), en assurant que les raclures de tissu sont lavées à partir de la surface de la lame et sont mises en suspension dans la solution. Cela signifie qu’à partir de chaque cas, deux échantillons de frottis de peau seront collectés et marqués conformément à la pratique nationale (certains pays utilisent le numéro d’enregistrement de la lèpre). Des échantillons de suc dermique obtenu par frottis cutané peuvent également être conservés sur une carte Whatman® FTA®. Faire un frottis de l’échantillon aussi petit que possible sur la carte. Les deux matériaux peuvent être stockés à température ambiante. Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 201714 6.5.2 Biopsie de la peau Une biopsie de peau est prélevée de préférence en utilisant un emporte-pièce à usage unique (punch) de 4 mm pour les nouveaux cas. Pour les cas de retraitement, une biopsie chirurgicale de 6 mm est préférable, surtout si la IB est proche de 2+. La biopsie est ensuite placée dans un tube de centrifugeuse stérile de 1,8-2 ml (avec bouchon à vis), pré-rempli avec 1 ml de 70 % d’éthanol (éthanol absolu de qualité biologie moléculaire à 70% v / v + eau déminéralisée stérile de MilliQ ou de la qualité d’injection humaine de 30% v / v, le mélange étant préparé en laboratoire) comme décrit ci-dessus. Si cela ne peut pas être préparé dans l’établissement sanitaire, les biopsies peuvent rester dans un tube de centrifugeuse stérile vide de 1,8 ml (avec bouchon à vis) sans aucun conservateur. Les échantillons peuvent être conservés à température ambiante jusqu’à leur envoi au laboratoire, éventuellement par lots, en fonction du coût du transport et du nombre d’échantillons par mois. Les bacilles sont rapidement inactivés, ce qui signifie que les échantillons peuvent être envoyés par transport de routine sans avoir à contrôler la température pendant le transport, ou prendre des précautions supplémentaires pour le contrôle des risques biologiques. Pour les cas où la détection moléculaire est négative (PCR négative en raison d’une inhibition ou d’une petite quantité d’ADN), il peut être nécessaire de prélever des échantillons supplémentaires à partir d’une autre lésion. Cela devrait être fait après avoir discuté avec le laboratoire d’essai des problèmes éventuels qui se seraient posés et ceci au cas par cas. Fig. 2. L’examen de frottis cutané et le tube de centrifugeuse avec 1 mL d’éthanol à 70 % pour la collecte d’échantillons de tissus Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 2017 15 Fig. 3. Échantillonnage d’une biopsie cutanée prélevée et du tube pour le transport (photo offerte : Dr Béatrice Flageul) Le personnel de l’établissement de référence et ceux des centres sentinels devraient être formés à la collecte appropriée d’échantillons et au transport. Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 201716 6.6 Examens microbiologiques au laboratoire Une fois que le laboratoire de microbiologie, soit national ou international, aura reçu les échantillons, les étapes suivantes devront être entreprises : Amplification de régions déterminant la résistance aux antimicrobiens des gènes rpoB, folP1 et gyrA Chaque laboratoire peut choisir la technique qu’il applique, sous réserves que ce soit une des techniques valides (voir annexe 6): séquençage des produits amplifiés par la PCR ou hybridation avec des sondes spécifiques (la méthode d’hybridation peut être appliquée dans des laboratoires sans séquenceur. Les laboratoires de référence utilisent souvent des séquenceurs.) Distinction entre séquence de type sauvage et vérification de la présence de substitution d’acides aminés (mutation) Rapport des résultats L’ADN de M. leprae présent dans les échantillons cutanés est amplifié par PCR et les mutations sont recherchées par séquençage ou par hybridation, selon la technique utilisée par le laboratoire. Plusieurs techniques - toutes montrant de bonnes performances - peuvent être utilisées. Trois techniques sont présentées à titre d’exemple dans l’annexe 6 : PCR + séquençage, trousse diagnostique commercialement disponible associant une PCR spécifique + un kit d’hybridation et enfin le séquençage du génome entier. En cas de PCR négative pour les gènes folP1, rpoB ou gyrA, il est recommandé d’effectuer une PCR ciblant une autre séquence d’ADN, telle que l’élément répétitif spécifique de M. leprae (RLEP) pour l’amplification. Cela permet de vérifier la présence de l’ADN de M. leprae dans l’échantillon. Quelles que soient les techniques utilisées par le laboratoire, il est obligatoire de pouvoir détecter les mutations connues pour conférer une résistance (voir Fig. 4 et le Tableau 1). D’autres recherches seront nécessaires pour identifier des mutations supplémentaires qui confèrent une résistance. Pour cette raison, une partie de la raison d’être du réseau de surveillance est de créer une « banque » mondiale des mutations détectées qui sera gérée par l’Institut de Santé globale de Lausanne. À partir de 1993, le séquençage des gènes a été fait pour les souches de M. leprae connues pour résister aux antimicrobiens au cours à des expérimentations de croissance dans les coussinet plantaire de souris, ces souches ayant été isolées à partir des cas dont le traitement a échoué. Ceci montre clairement que certaines mutations faux-sens (mutations Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 2017 17 conférant un changement d’acide aminé) confèrent une résistance à la dapsone (mutation dans le gène folP1), à la rifampicine (mutation dans le gène rpoB) et aux quinolones (mutation dans le gène gyrA). Comme ces mutations sont groupées dans chaque gène respectif, les régions déterminant la résistance aux antimicrobiens ont été décrites comme la région déterminant la résistance à la dapsone (DRDR), la région déterminant la résistance à la rifampicine (RRDR) et la région déterminant la résistance aux quinolones (QRDR) (voir Bibliographie). Le séquençage du génome de M. leprae a récemment conduit à une modification du système de numérotation utilisé précédemment. Fig. 4. Séquences de nucléotides et d’acides aminés des régions déterminant la résistance aux antimicrobiens. Les codons connus pour être le plus souvent impliqués dans la résistance sont mis en évidence dans des rectangles. La rifampicine se lie à la sous-unité β (codée par le gène rpoB) de l’ARN polymérase et certaines mutations dans le gène rpoB conduisent à la résistance à la rifampicine chez M. leprae et M. tuberculosis. Des mutations faux-sens conduisant à la substitution de l’un des acides aminés suivants (positions 438, 441, 451, 456 et 458) ou à l’insertion de nucléotides entre les positions 439 et 440 confèrent une résistance à la rifampicine à M. leprae (Tableau 1). Les mutations observées à d’autres positions (de 432 à 437) doivent être signalées avec prudence et discutées avec un microbiologiste de l’un des quatre laboratoires de référence internationaux. Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 201718 Tableau 1. Mutations au sein des gènes cibles des antilépreux qui confèrent une résistance à Mycobacterium leprae Gène Substitution d’acides aminés due à une mutation génétique Modification de nucléotide (5’ 3’) rpoB Gln438Val cag gtg Asp441Tyr gat tat Asp441Asn gat aat His451Asp cac gac His451Tyr cac tac Ser456Leu tcg ttg Ser456Met tcg atg Ser456Phe tcg ttc Ser456Trp tcg tgg Leu458Val ctg gtg Leu458Pro ctg ccg folP1 Thr53Ala acc gcc Thr53Arg acc agc Thr53Ile acc atc Pro55Arg ccc cgc Pro55Leu ccc ctc Pro55Ser ccc tcc gyrA Gly89Cys ggc tgc Ala91Val gca gta Remarque. Les acides aminés mutants en gras sont des mutations à haute fréquence de M. leprae associées à la résistance aux antilépreux. Le système de numérotation est celui du génome de la souche TN de M. leprae (GenBank AL583923 ; [1]) Des mutations faux-sens dans la région déterminant la résistance aux sulfones du gène folP1 (codant la dihydroptéroate synthase) et entraînant des substitutions d’acides aminés aux positions 53 et 55 confèrent une résistance à la dapsone à M. leprae à un niveau intermédiaire et élevé dans l’essai du coussinet plantaire de souris. La corrélation entre la résistance à l’ofloxacine et la mutation faux-sens dans le gène gyrA a été confirmée aux positions 91 (Ala91Val) et 89 (Gly89Cys). Les mutations impliquant les codons 92 et 95 peuvent être considérées comme conférant éventuellement une résistance à l’ofloxacine selon les résultats de M. tuberculosis, mais doivent être signalées avec prudence et discutées avec un microbiologiste de l’un des quatre laboratoires de référence internationaux. Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 2017 19 Une fois que les essais de laboratoire ont été effectués, pour rendre compte des résultats, il faut se référer à l’organigramme ci-dessous: Est-ce que la PCR spécifique pour les gènes de résistance aux antimicrobiens est positive ? Si la PCR est négative, vérifier si l’échantillon contient suffisamment d’ADN de M. leprae (par PCR RLEP ou une autre PCR spécifique) ; Si les PCR sont toutes négatives, demandez un autre échantillon IB + Si la PCR est positive, déterminer la séquence ou hybrider avec des oligonucléotides de type sauvage et mutés – s’il n’y a pas de mutation : signaler comme sensible – s’il y a une présence de mutation: – Est-ce que c’est une mutation silencieuse ? (sans changement de l’acide aminé codé) Si oui, ne pas signaler – Est-ce que c’est une mutation faux-sens ? (il confère un changement / substitution d’acide aminé) Si oui, indiquez la substitution des acides aminés avec le système de numérotation indiqué dans le tableau 1. – Est-ce que c’est une substitution qui confère une résistance aux antimicrobiens dans la lèpre tel que décrit dans le tableau 1 ? Si oui, déclarez la souche comme résistante. Si non, discutez la façon de le signaler avec le laboratoire de référence international. Envoyer le formulaire de rapport du laboratoire à l’établissement de référence et au responsable du programme national de lutte contre la lèpre. Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 201720 6.7 Enregistrement systématique de l’information Les résultats des examens biologiques de résistance seront utilisés par le centre de collection / d’étude / site sentinelle de l’échantillon pour la prise en charge appropriée des patients et par le Programme national de Lutte contre la Lèpre pour une surveillance appropriée. Par conséquent, les résultats des essais du laboratoire doivent parvenir à la fois à l’établissement qui gère le patient et au Programme national de Lutte contre la Lèpre, pour être inscrits au Registre national de Résistance aux Anti-lépreux (Annexe 2). Pour y parvenir, des formulaires d’information clinique standards ont été développés pour enregistrer les données qui seront envoyées aux laboratoires de référence et renvoyées aux établissements sanitaires (Annexes 3, 4 et 5). À la fin du traitement des cas détectés avec une résistance, une copie de la carte du patient doit être envoyée au Programme national de Lutte contre la Lèpre pour permettre l’enregistrement des résultats du traitement (Annexe 5). Le programme national de Lutte contre la Lèpre devra rendre compte chaque année à l’OMS : (1) nombre de nouveaux cas MB testés, et nombre et proportion de cas résistants (pour un antibiotique (mono-résistance) et pour plus d’un antibiotique [multi- résistance]) ; (2) nombre de cas MB de retraitement testés, et nombre et proportion de cas résistants (mono- et multi-résistants). Les résultats de la transmission des données mondiales sont publiés dans le Relevé épidémiologique hebdomadaire de l’OMS, qui à partir de 2017, incluront des données sur la résistance aux anti-lépreux, conformément à l’importance accordée à cet aspect dans la Stratégie mondiale de Lutte contre la Lèpre 2016−2020. À l’échelle mondiale, certains pays mettent en œuvre une plate-forme en ligne pour signaler et surveiller la résistance aux antimicrobiens, appelée Système mondial de Surveillance de la Résistance aux Antimicrobiens (GLASS). À l’heure actuelle, GLP étudie la possibilité d’intégrer les données sur la résistance aux médicaments contre la lèpre dans la plateforme en ligne GLASS. Pour les pays qui comptent sur un programme national de santé publique ou un institut de recherche et/ou avec des centres collaborateurs pour la lutte contre la lèpre avec un système informatique et des outils de santé publique adéquats, y compris les ressources humaines, l’analyse et la collecte des données pourraient être faits par un tel centre au nom du Programme national de Lutte contre la Lèpre. Cependant, même dans le cadre d’un tel arrangement, le Programme national de Lutte contre la Lèpre reste responsable de la surveillance des tendances en matière de résistance aux anti-lépreux. Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 2017 21 6.8 Monitorage de la résistance aux antimicrobiens Les programmes nationaux de lutte contre la lèpre devront surveiller les tendances de la résistance parmi les nouveaux cas et les cas de retraitement, ainsi que le suivi de la proportion des patients testés. Les résultats du retraitement devraient être analysés par type de retraitement, tout en essayant d’identifier les facteurs de risque de résistance tels que le manque de suivi. Une proportion croissante de cas résistants à la rifampicine serait particulièrement préoccupante, en particulier si ces cas sont nouveaux, et si le nombre total de nouveaux cas de lèpre reste stable au fil du temps. Il est suggéré de remplir correctement le Registre de Résistance aux Anti-lépreux afin de pouvoir analyser les données entre les différentes catégories et surveiller les résultats du traitement. Cela aiderait à identifier les groupes à risque de résistance selon l’âge, le sexe, le lieu de résidence et / ou les facteurs socioéconomiques et la catégorie de patients (par exemple, retraitement après perte de vue), ainsi que les facteurs de risque d’échec thérapeutique. Pour les pays fortement touchés par la lèpre, une base de données nationale informatisée devrait être établie et périodiquement partagée avec le laboratoire de référence afin d’identifier les mutations plus fréquentes et les modes de transmission possibles à travers des études, y compris le séquençage du génome entier fait par le laboratoire à l’École Polytechnique Fédérale de Lausanne. Les pays pourraient également utiliser la base de données comme outil pour mener périodiquement des recherches opérationnelles et scientifiques afin d’identifier d’autres facteurs de risque potentiels tels que le retard au diagnostic, la consultation dans le secteur privé, les maladies concomitantes, etc. Les facteurs associés au recours aux antilépreux de deuxième intention pourraient également être identifiés. Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 201722 (1) Adams LB, Job CK, Krahenbuhl JL. Role of inducible nitric oxide synthase in resistance to Mycobacterium leprae in mice. Infect Immun. 2000; 68: 5462–5. (2) Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence sata. Bioinformatics. 2014; 30: 2114-20. (3) Cambau E, Perani E, Guillemin I, Jamet P, Ji B. Multidrug-resistance to dapsone, rifampicin, and ofloxacin in Mycobacterium leprae. Lancet. 1997; 349: 103–4. 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A mutation at codon 516 in the rpoB gene of Mycobacterium leprae confers resistance to rifampin. Int J Lepr Other Mycobact Dis. 2004; 72: 468–72. Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 201724 Documents de l’OMS (1) Stratégie mondiale de Lutte contre la Lèpre 2016–2020. « Parvenir plus rapidement à un monde exempt de lèpre ». New Delhi : Bureau régional de l’OMS pour l’Asie du Sud-Est ; 2016. (2) Stratégie mondiale de Lutte contre la Lèpre 2016–2020. « Parvenir plus rapidement à un monde exempt de lèpre » – Manuel opérationnel. New Delhi : Bureau régional de l’OMS pour l’Asie du Sud-Est ; 2016. (3) Stratégie mondiale de Lutte contre la Lèpre 2016−2020 « Parvenir plus rapidement à un monde exempt de lèpre » - Guide de suivi et d’évaluation. New Delhi : Bureau régional de l’OMS pour l’Asie du Sud- Est ; 2017. (4) Organisation mondiale de la Santé. Actualisation de la situation mondiale de la lèpre, 2016: accélération de la réduction des charges de la maladie. Relevé eépidémiologique hebdomadaire. 2017 ; 35: 501–19. (5) Résolution WHA67.25. Résistance aux antimicrobiens. Dans: Soixante-Septième Assemblée mondiale de la Santé, Genève, 19–24 Mai 2014. Résolutions et décisions, annexes. Genève : Organisation Mondiale de la Santé; 2014 (WHASS1/2014WHA67/2014/REC/25). (6) Surveillance de la Résistance aux Médicaments contre la Lèpre : 2009. Relevé épidémiologique hebdomadaire 2010;85(29):281–4. (7) Directives pour la surveillance mondiale de la résistance aux médicaments contre la lèpre. New Delhi : Bureau régional de l’OMS pour l’Asie du Sud-Est; 2009 (http://www.searo.who.int/entity/leprosy/ documents/SEA-GLP-2009.2/en/, consulté le 6 Juillet 2017). (8) Plan d’action mondial sur la résistance aux antimicrobiens. Genève : Organisation mondiale de la Santé; 2015 (http://www. who.int/antimicrobial-resistance/global-action-plan/en/, consulté le 6 Juillet 2017). Autres publication (1) Executive summary: Global antimicrobial resistance alerts and implications. Clin Infect Dis. 2005;41 (Suppl 4): S221–S3. Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 2017 25 Annexes Annexe 1 Laboratoires internationaux de référence Centre national de référence sur les mycobactéries et la résistance aux médicaments, antituberculeux, Assistance publique-Hôpitaux de Paris (APHP) En-charge : Professeurr Emmanuelle Cambau Hôpital Lariboisière 2 rue Ambroise Paré 75010 Paris France Téléphone : +33-1-49956554 ; Fax : +33-1-49958537 Email: emmanuelle.cambau@aphp.fr Global Health Institute En-charge : Professeur Stewart Cole École Polytechnique Fédérale de Lausanne Station N° 15 CH-1015 Lausanne Suisse Téléphone : +41-919-6817760; Fax: +41-919-6817748 Email: stewart.cole@epfl.ch Leprosy Research Centre Dr Yuji Miyamoto National Institute of Infectious Diseases 4-2-1 Aoba-cho, Higashimurayama-shi Tokyo 189-0002 Japon Téléphone : +81-42-3918211 ; Fax : +81-42-3949092 Email: yujim@niid.go.jp National Hansen’s Disease Program Laboratory Research Branch En-charge : Dr Rahul Sharma Department of Health and Human Services Health Resource Administration, Health Systems Bureau SVM-LSU, RM 3517W, Skip Bertonma Dr. Baton Rouge, LA 70803 États-Unis d’Amérique Téléphone : +1-225-5789839 ; Fax : +1-225-5789856 Émail : RSharma1@hrsa.gov Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 201726 Annexe 2 Registre national de la Résistance aux Anti-lépreux Prénom Nom Numéro dans le registre de la lèpre Type de patient (nouveau / retraitement) Type de retraitement Date du début du traitement PCT Nom et lieu de l'établissement du traitement Date de la collecte de l'échantillon Établissement (et adresse) de la collecte de l'échantillon Site de la peau de la collecte de l'échantillon Index bacillaire du frottis cutané dans le laboratoire d’essai Résultats du laboratoire national Résultats de la PCR du laboratoire national Laboratoire de référence: résultats PCR Résultats de la séquence pour de la rifampicine du labo national Résultats de la séquence pour de la rifampicine du labo de référence Résultats séq de la dapsone du labo national Résultats séq de la dapsone du labo de référence Résultats séq de l'ofloxacine du labo national Résultats séq de l'ofloxacine du labo de référence Regime de traitement (pour les cas résistants) Début du traitement (pour les cas résistants) Fin du traitement (pour les cas résistants) Résultat du traitement Remarques Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 2017 27 Annexe 3 Formulaire 1. Formulaire du rapport clinique pour les cas de lèpre MB à tester pour la résistance aux anti-lépreux I. Communication des données Numéro de registre de la lèpre: _________________________________ Nom du pays: _______________________________________ Type d’établissement: de rapport: centre de soins de santé primaire / autre : nom et adresse: ______________________ Site sentinelle : nom et adresse: ________________________________ Date du rapport (JJ/MM/AAAA): ____/____/_______ Date de prélèvement d’échantillons (JJ/MM/AAAA): ____/____/_______ II. Démographie et antécédents médicaux du cas Date de naissance: _____________ Sexe: M / F Nationalité ou résidence du patient: ___________________ Pays d’origine: _______________________________ Consentement du patient à participer : Oui / Non (Si non, ignorez les étapes suivantes) Chimioprophylaxie : Oui / Non Si oui, quel médicament a été administré: __________________________ Traitement antérieur de TB : Oui / Non Traitement antérieur par l’ofloxacine ou d’autres quinolones pour une periode de plus d’un mois : Oui / Non III. Classification des cas Nouveau Retraitement: Retraitement après perte de vue Rechute Transféré dans Autre retraitement Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 201728 IV. Histoire du traitement (uniquement pour les cas de retraitement) Traité avec PCT, année : Traité avec de la rifampicine, de la dapsone, de la clofazimine (pas dans un emballage PCT), année : Traité avec d’autres médicaments : spécifiez V. Présentation clinique au moment de la référence pour un test de résistance Caractéristiques cliniques: _______________________________________________ ___________________________________________________________________ Nombre de lésions cutanées: ___________ Resultats des frottis cutanés provenant des sites spécifiques (le cas échéant, avec la date du test) : 1. Site: _____________ IB: ________ Date du frottis: ___/___/______ 2. Site: _____________ IB: ________ Date du frottis: ___/___/______ 3. Site: _____________ IB: ________ Date du frottis: ___/___/______ Classification de la maladie: A: (MB/PB) B: Ridley–Jopling – (BB/BT/TT/BL/LL) VI. Type d’échantillon Biopsie, nombre d’échantillons: __________ site de la collecte: __________ Frottis cutané, nombre d’échantillons: ________ site de la collecte: __________ Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 2017 29 Annexe 4 Formulaire 2. Rapport du laboratoire d’essai Nom du laboratoire d’essai: ______________________________________________ _______________________________________________________________________ Adresse: _______________________________________________________________ _______________________________________________________________________ Téléphone: ___________________ Fax: ___________________ Émail: ___________________ Identification de cas Numéro de registre de la lepre: Initiales du patient: Age: Sexe: Nom du centre médical envoyant l’échantillon: _____________________________________ Adresse: ________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ Téléphone: ________________ Fax: ______________ Email: _____________________________ Type de cas: Nouveau Retraitement Date de consentement: _____/_____/________ (JJ/MM/AAAA) Type d’échantillon reçu : frottis cutané / biopsie (Encercler les deux si plus d’un type d’échantillon est reçu) Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 201730 Résultats du séquençage Gène rpoB PCR négative (autre PCR testée: __________________) Aucune mutation (ne signalez pas de mutation silencieuse) Présence d’une mutation connue pour conférer une résistance aux anti-lépreux mutation nucléotidique (X à Y au nucléotide Z*) ____________________ substitution d’acide aminé (A à B en position C*) : __________________ Présence d’une autre mutation (A à B en position C*) Gène folP1 PCR négative (autre PCR testée: __________________) Aucune mutation (ne signalez pas de mutation silencieuse) Présence d’une mutation connue pour conférer une résistance aux anti-lépreux mutation nucléotidique (X à Y au nucléotide Z*) ____________________ substitution d’acide aminé (A à B en position C*) : __________________ Présence d’une autre mutation (X à Y en position Z*) Gène gyrA PCR négative (autre PCR testée: __________________) Aucune mutation (ne signalez pas de mutation silencieuse) Présence d’une mutation connue pour conférer une résistance aux anti-lépreux mutation nucléotidique (X à Y au nucléotide Z*) ____________________ substitution d’acide aminé (A à B en position C*) : __________________ Présence d’une autre mutation (X à Y en position Z*) *système de numérotation du génome de la souche TN de M. leprae (numéro d’accès NCBT AL4550380.1) Nom du biologiste correspondant (et signature) Signature Date du rapport: ___/___/________ (JJ/MM/AAAA) Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 2017 31 Remarque: La présence ou l’absence de mutations connues pour conférer une résistance aux médicaments doit être signalée : • « Aucune mutation connue pour conférer une résistance » si ces mutations ne sont pas trouvées et que la séquence présente des codons de type sauvage ; • « Présence de mutations connues pour conférer une résistance » si au moins une de ces mutations est observée. La substitution (par exemple Ser456Leu) doit être indiquée sur la base du système de numérotation du génome de M. leprae de la souche TN (voir Tableau 1 et Fig. 4) ; • « Autre mutation faux-sens »: il pourrait s’agir d’une nouvelle mutation ou d’une mutation précédemment décrite mais pas connue pour conférer une résistance. La mutation doit être écrite en ce qui concerne la substitution (par exemple Lys411Asn), le changement de nucléotide entre parenthèses (par exemple aaa à aac) sur la base du système de numérotation du génome de M. leprae de la souche TN (voir Fig. 4). Les séquences d’ADN correspondantes et les données concernant la description de nouvelles mutations seront également envoyées pour une base de données commune située à l’École Polytechnique Fédérale de Lausanne ; • ne signalez pas de mutations silencieuses, c’est-à-dire des mutations qui ne modifient pas l’acide aminé. Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 201732 • Traitement achevé • Perte de vue au cours du suivi • Transfert sortant • Décédé • Réponse clinique insuffisante/non satisfaisante au traitement Annexe 5 Formulaire pour rapporter les résultats du traitement des cas résistants Communication des données • Numéro de registre de la lèpre: • Initiales : sexe : M / F / âge (en chiffres) • Type de cas : Nouveau Retraitement (type de retraitement) • Date du rapport :__ / __ / ____ (JJ/MM/AAAA) • Date d’achèvement du traitement :__ / __ / ____ (JJ/MM/AAAA) Type de résistance • Uniquement à la rifampicine • Uniquement à la dapsone • Uniquement à l’ofloxacine • rifampicine + dapsone • rifampicine + dapsone + ofloxacine • rifampicine + ofloxacine • dapsone + ofloxacine Traitement prescrit par : Dr: ______________________________ Nom de l’établissement: ________________________ Régime de traitement prescrit • MB-PCT Option A : 400 mg d’ofloxacine + 100 mg de minocycline + 50 mg de clofazimine, tous les jours pendant 6 mois suivi de 400 mg d’ofloxacine + 50 mg de clofazimine, tous les jours pendant 18 mois ou Option B : 400 mg d’ofloxacine + 100 mg de minocycline + 50 mg de clofazimine, tous les jours pendant 6 mois suivi de 100 mg de minocycline + 50 mg de clofazimine par jour pendant 18 mois, tous les jours pendant 18 mois • Autre traitement (préciser): _____________________________________________ Résultats du traitement Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 2017 33 Annexe 6 Protocoles du laboratoire 1. Extraction d’ADN Protocole A pour les frottis cutanés: méthode du tampon de lyse (adapté à partir de Wit 1991, J Clin Microbiol. 1991; 29: 906–10) • Centrifuger pendant 10 à 20 min à la vitesse maximale (doit être supérieure à 15 000 x g). • Jeter la fraction surnageante. Remettre en suspension le précipité dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Laisser reposer pendant plus de 30 minutes avant de suspendre dans du PBS. • Centrifuger pendant 10-20 min à la vitesse maximale. • Remettre en suspension le sédiment dans 50 µL de tampon de lyse*. Superposer l’huile minérale pour éviter l’évaporation du tampon. • Incuber pendant une nuit à 60 °C. • Chauffer pendant 10 min à 97 °C pour inactiver la protéinase K. • Transférer dans un tube à faible liaison d’ADN tel que l’ADN du produit Eppendorf LoBind. *Tampon de Lyse Solution mère I : protéinase K 1 m/ml dans 100 mM Tris-HCl, pH 8,5 Solution mère II : 0,5 % Tween 20 Mélanger 1 volume de stock I et 1 volume de stock II Diluer 5 fois avec du 100 mM Tris-HCl, pH. 8,5 ou de l’eau distillée Habituellement 100 µL de solution mère I et II sont mélangées avec 800 µL de 100 mM Tris-HCl, pH 8,5 ou avec de l’eau distillée. Protocole B pour l’échantillon de biopsie : méthode de congélation-ébullition (adapté de Woods 1989) • Si stockés dans de l’éthanol à 70 %, placez les tubes sous une hotte de sécurité pour que l’éthanol s’évapore, jusqu’à ce que la biopsie soit sèche (24-48 h). Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 201734 • Émincer la biopsie de la peau et broyer avec des billes de verre pour obtenir une suspension de biopsie dans une solution de Hanks ou d’un autre tampon / eau stérile. • Après l’inactivation à 95 °C pendant 30 min, l’ADN est extrait comme suit : 200 µL de la suspension de la biopsie sont soumis à cinq séries de chocs thermiques, alternativement en ébullition (1 min à 100 °C) et en congélation (1 min en neige carbonique ou en glace +/- alcool). Puis incuber à 95 °C pendant 15 min, puis par immersion dans un bain à ultrasons (Branson) pendant 15 min si possible. Protocole C pour l’échantillon de carte FTA • Retirer un disque d’échantillon de 3 mm du centre du frottis en utilisant un punch à biopsie. • Transférer dans un tube de 1,5 ml. • Ajouter 500 µL de l’eau stérile dans le tube et pulser immédiatement 3 fois au vortex, pour un total de 5 secondes. • En utilisant une technique stérile, transférer immédiatement le disque dans un tube de microcentrifugeuse de 0,5 mL contenant 30 µL de l’eau stérile. Assurez-vous que le disque est complètement immergé dans l’eau en centrifugeant brièvement le tube pendant 10 secondes. • Transférer le tube dans un bloc chauffant à 95 °C pendant 15-30 min. • À la fin de la période d’incubation, retirer l’échantillon du bloc et faites une impulsion du vortex, ou tapoter doucement l’échantillon environ 60 fois. Protocole D pour l’échantillon d’un frottis cutané ou d’une biopsie par le kit DNA easy Blood and Tissue (Qiagen) • Les échantillons mis en suspension dans de l’éthanol à 70 % sont centrifugés pendant 10-20 min à la vitesse maximale (devrait être plus de 15 000 x g). • Jeter la fraction surnageante. Remettre en suspension le précipité dans 500 µL de PBS. Laisser reposer pendant plus de 30 minutes et remplacer l’éthanol par du PBS. • Centrifuger pendant 10-20 min à la vitesse maximale. • Suspendre un culot d’échantillon dans 180 µL de tampon de lyse enzymatique. • Incuber pendant au moins 30 minutes à 37 °C. • Ajouter 25 µL de protéinase K et 200 µL de tampon AL (sans éthanol). Mélanger au vortex. Incuber à 56 °C pendant 30 min. Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 2017 35 • Ajouter 200 µL d’éthanol (96-100 %) à l’échantillon et homogénéiser avec soin au vortex. • Introduire à la pipette le mélange dans la colonne de MiniSpin DNeasy placée dans un tube collecteur de 2 ml. Centrifuger à > 6000 x g pendant 1 min. Jetez le tube d’écoulement et de collecte. • Placer la colonne DNeasy Minispin dans un nouveau tube collecteur de 2 mL, ajouter 500 µL de tampon AW1 et centrifuger pendant 1 min à > 6000 x g. Jetez le tube d’écoulement et de collecte. • Placer la colonne DNeasy Minispin dans un nouveau tube collecteur de 2 mL, ajouter 500 µL de tampon AW2 et centrifuger pendant 3 min à 20 000 x g pour sécher la membrane DNeasy. Jetez le tube d’écoulement et de collecte. • Placer la colonne DNeasy minispin dans un tube de microcentrifugeuse propre de 1,5 mL ou de 2 mL et introduire à la pipette 200 µL de tampon AE directement sur la membrane DNeasy. Incuber à température ambiante pendant 1 min, puis centrifuger pendant 1 min à> 6000 x g pour éluer. 2. Séquençage PCR (a) Protocole interne pour le séquençage PCR Mélange de PCR : 2,5 µL de mélange maître PCR (2x) 0,5 µL de Taq polymérase 1,25 µL d’amorce directe à une concentration finale de 0,5 µM 1,25 µL d’amorce inverse à une concentration finale de 0,5 µM 5,0-7,5 µL d’eau jusqu’au volume final 25 µL 2,5-5,0 µL de la matrice ADN Cycle thermique : Dénaturer à 95 °C pendant 30s Dénaturer à 95 °C pendant 15s Hybridation à 57 °C pendant 15 s 40 cycles Extension à 72 °C pendant 60 s Extension finale à 72 °C pendant 7 min Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 201736 Source: Guidelines for global surveillance of drug resistance in leprosy. New Delhi; WHO Regional Office for South-East Asia, 2009 (Drawn by Dr M. Matsuoka) Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 2017 37 Protocole de réaction de séquençage interne Mélanger pour la réaction de séquençage PCR 1-3 µL (1-3 ng de 100-200 pb) de produits purifiés PCR 20 µl d’eau distillée ajoutée au volume total 4 µL Bigdye terminator Ver 1.1 2µL 5XSEQ tampon 1 µL 3.3 M amorce (la même amorce utilisée pour la PCR est diluée 6X) Programmation du thermocycleur Cycle 1 : 96 °C pendant 30 s Cycle 2 : 96 °C pendant 10 s Cycle 3 : 50 °C pendant 10 s Cycle 4 : 60 °C pendant 3 min Répéter Cycles 2–4 25 fois Purification des produits de réaction de séquençage (par exemple par une cartouche de filtration sur gel Performa DTR) Préparation des échantillons pour le séquençage. Ajouter 25 µL de réactifs HI (Applied Biosystems) dans les tubes à échantillon pour résoudre les produits séchés de séquençage. Agiter calmement le Vortex vers le bas. Transférer l’échantillon dans des tubes à échantillon pour le séquençage. Chauffer pendant 2 min à 95 °C, puis refroidir rapidement dans de l’eau glacée ; agiter doucement. Prêt à appliquer au séquenceur après remise en suspension dans le tampon de chargement. b) Kit commercial standardisé GenoType LepraeDR v1.0 pour séquençage PCR (fabriqué par Hain Lifesciences, http://www.hain- lifescience.de/en/) Après extraction de l’ADN (voir protocoles ci-dessus), la procédure est une amplification multiplex de régions déterminant la résistance aux anti-lépreux dans rpoB, folP1 et gyrA avec des amorces biotinylées suivie d’une hybridation inverse (DNA strip test ou Line probe assay). Le kit contient tous les réactifs pour la PCR multiplex et l’hybridation, incluant les contrôles de qualité internes, mais l’ADN polymérase HotstartTaq thermostable doit être fournie séparément. Le mélange des amorces nucléotidiques contient des amorces biotinylées pour l’amplification de régions spécifiques du génome bactérien. Les membrane de nitrocellulose sont recouvertes de sondes spécifiques complémentaires des acides nucléiques amplifiés. Après dénaturation chimique, les amplicons à un seul brin se lient aux sondes (hybridation). La liaison hautement Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 201738 spécifique des brins d’ADN complémentaires est assurée par des conditions rigoureuses résultant de la combinaison de la composition du tampon et d’une certaine température. Ainsi, les sondes discriminent de manière fiable plusieurs variations de séquence dans les régions de gènes examinées. La phosphatase alcaline conjuguée à la streptavidine se lie à la biotine des amplicons par le fragment streptavidine. Enfin, la phosphatase alcaline transforme un substrat ajouté en un colorant qui devient visible sur les bandelettes de membrane sous la forme d’un précipité coloré. Un modèle assure l’interprétation facile et rapide du motif des bandes obtenues. Chaque bande d’ADN comprend six zones de contrôle : • une zone de contrôle conjugué (CC) pour vérifier la liaison du conjugué sur la bande et une réaction chromogène correcte • une zone de contrôle universelle (UC) qui détecte, pour autant que l’on sache, toutes les mycobactéries et les membres du groupe des bactéries à Gram positif avec une forte teneur en G+C • une zone de contrôle permettant de vérifier la présence d’ADN de Mycobacterium leprae • trois zones de contrôle de locus (rpoB, gyrA et folP1) qui vérifient la sensibilité optimale de la réaction pour chacun des locus de gènes testés. Fig. 5. Bande d’ADN du kit GenoType LepraeDR. (A) Schéma de la bande. (B) Exemples des bandes ADN (A) Schéma de la bande et détails des sondes Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 2017 39 Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 201740 (B) Exemples des résultats des tests GenoType Leprae DR c) Séquençage du génome entier pour trouver des mutations de résistance aux médicaments Pour le séquençage, l’ADN peut être extrait des biopsies cutanées humaines avec index bacillaire positif en utilisant le protocole suivant qui élimine la plus grande partie de l’ADN humain, suivi de la lyse des bactéries et de la purification de l’ADN de M. leprae sur les colonnes de silice. La biopsie (6 mm) mise dans de l’éthanol à 70% est d’abord réhydraté dans 500 µL de solution équilibrée de Hank, puis émincé finement avec des ciseaux ou perturbé par le battage des billes en utilisant 2,8 mm de perles de zirconium (Bertin Technologie, France). Chaque extraction exécutée pourrait inclure un lot de 5 à 9 échantillons et un contrôle à blanc. Pour digérer la peau et les tissus humains, l’échantillon est incubé avec un mélange de 0,5 U de collagénase et de dispase (Roche, Suisse) pendant 30 minutes à 37 °C ; les cellules libérées sont recueillies dans un tube séparé et le tissu restant est digéré par incubation avec de la trypsine dans du PBS (10 mg / ml) à 56 °C jusqu’à ce que la digestion soit complète. Les cellules libérées sont regroupées et centrifugées pendant 10 min à 10 000 g avant la remise en suspension dans 1 mL de PBS. Les cellules sont lysées avec 500 µL de tampon AHL (kit QIAmp microbiome, Qiagen) pendant 30 min à température ambiante avec rotation de bout en bout. Le mélange est ensuite centrifugé pendant 10 min à 10 000 g et remis en suspension dans 190 µL de tampon RDD. Ensuite, 2,5 µL de benzonase sont ajoutés pour éliminer l’ADN hôte (QIAmp microbiome kit, Qiagen) en incubant à 37° C pendant 30 min. Ensuite, le mélange est traité avec de la protéinase K (20 mg/ml) à 56° C pendant 30 minutes pour inactiver la DNAase. Les cellules bactériennes sont ensuite lysées mécaniquement par battage des billes et enzymatiquement utilisant un traitement à la protéinase K (20 mg/mL) Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 2017 41 selon les recommandations du fabricant avant la purification de l’ADN sur des colonnes à base de silice (kit QIAmp microbiome, Qiagen). Ensuite, les échantillons d’ADN sont soniqués pour obtenir des fragments de 400 pb en utilisant un instrument de laboratoire Covaris S220. Les collections Illumina sont préparées à l’aide du kit Prep Kapa Hyper (Kapa Biosystem, MA, USA) et PentAdpters (Pentabases, Danemark) ou par des adaptateurs indexés Illumina. Les fragments sont sélectionnés avant l’amplification en utilisant des perles AMPUre avec un rapport de 0,5x pour le premier et 0,2x pour la seconde sélection. La concentration des adaptateurs indexés et le nombre de cycles d’amplification sont adaptés par rapport à la concentration initiale de l’ADN selon les instructions du fabricant (Kapa Biosystem, MA, USA). Après le contrôle qualité (la concentration et la taille de la librairie sont déterminées à l’aide d’un analyseur de fragments), les collections peuvent être multiplexées et séquencées en 100 lectures simples de base sur un instrument Illumina HiSeq 2500 (https://www.illumina.com). Les lectures brutes sont ensuite ajustées avec l’adaptateur et la qualité à l’aide de Trimmomatic v0.33 (Bolger et al. 2014) et mappées sur le génome de référence de M. leprae TN (numéro d’accès NCBI AL450380.1) avec Bowtie2 (version 2.2.5, Langmead et Salzberg 2012) suivi d’un appel de variante en utilisant VarScan v2,3,9 (Koboldt et al. 2012) ou par d’autres programmes de modélisation. Des polymorphismes de nucléotides individuels (SNP) peuvent être appelés après l’application des contrôles de qualité, soit une couverture globale minimale de cinq lectures non dupliquées, un minimum de trois lectures non dupliquées supportant le SNP, un score de qualité de cartographie > 8, un score de qualité de base > 15 et une fréquence SNP supérieure à 80 %. Ces seuils sont choisis pour éviter les résultats faux positifs. Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 201742 Annexe 7 Protocole pour la surveillance sentinelle Calcul de la taille de l’échantillon. La taille de l’échantillon (n) sera calculée sur la base du niveau de résistance attendu selon la formule et les explications connexes ci-dessous : n ou : N = nombre annuel moyen de nouveaux cas de lèpre MB enregistrés sur le site sentinelle au cours des cinq dernières années Z = valeur z (à partir de la distribution normale standard) qui correspond au niveau de confiance souhaité (réduire l’intervalle de confiance de 95 à 90 % entraînera des réductions de la taille de l’échantillon, si l’intervalle de confiance est de 95 %, alors z = 1,96 et à 90 %, z=1.65) ; d = précision absolue (en décimal 0,01 ou 0,02, ce qui signifie une erreur de 1 % ou 2 % de la proportion vraie) ; g = estimation précédente de la proportion de nouveaux cas avec résistance à la rifampicine x (1 + changement anticipé dans l’estimation précédente). Le changement anticipé peut être considéré comme le changement que le système sentinelle devrait être capable de détecter. Cette modification est exprimée en décimal, avec un préfixe négatif (-) si une diminution est anticipée et un préfixe positif (+) si une augmentation est anticipée. Par exemple, une augmentation de 4 % par rapport à l’estimation précédente serait exprimée par un changement anticipé de +0,04; donc g = estimation antérieure x (1 + 0,04) = estimation antérieure x 1,04. De même, si une réduction de 10 % est prévu au niveau de la résistance précédente dans l’année en cours, alors g = estimation précédente x (1 – 0,04) ou g = estimation antérieure x (0,96). Il est suggéré de doubler la taille de l’échantillon calculée avec la formule. Ceci est fait pour neutraliser l’effet de conception et d’augmenter la précision du système d’échantillonnage (une taille de l’échantillon suffisamment grand pour détecter les changements prévus à plus grande échelle, compte tenu de l’incertitude du niveau de référence de la résistance et l’absence de tendance connue dans la majorité des pays). Pour les pays où le niveau de résistance de référence n’est pas du tout connu, 10 % du total des nouveaux cas de lèpre détectés par an seront testés soit dans un laboratoire national ou international. Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 2017 43 Sélection des échantillons. Après avoir déterminé la taille de l’échantillon, l’etape suivante est la sélection de l’échantillon des nouveaux cas MB. La première étape consiste à identifier le nombre de districts endémiques desservis par les sites sentinelles, puis d’attribuer le nombre d’échantillons à sélectionner dans chacun de ces districts en fonction du nombre moyen de nouveaux cas MB enregistrés au cours des cinq dernières années. Après avoir calculé le nombre d’échantillons à prélever dans chaque district d’endémie, les échantillons doivent être sélectionnés par le système systématique. Un guide détaillé est donné ci-dessous : • Supposons que la formule mentionnée ci-dessus renvoie une taille d’échantillon de 20; ensuite, après avoir augmenté la taille de l’échantillon de 50 %, c’est-à-dire 50 % de 20 = 10, la taille totale de l’échantillon sera de 20 + 10 = 30. • En outre, supposons que le site sentinelle couvre uniquement deux districts, A et B, avec un nombre moyen de nouveaux cas MB de 150 et 250 (respectivement 37,5 % et 62,5 % du nombre total de cas MB). Maintenant, un total de 30 échantillons doit être réparti entre ces deux districts proportionnellement à leur nombre moyen de nouveaux cas MB. Cela implique que dans le district A, 11 échantillons doivent être testés alors que dans le district B, 19 échantillons doivent être testés. • Pour dessiner un échantillon circulaire systématique du district A, nous devons trouver l’entier k le plus proche, qui peut être obtenu comme ci-dessous : k = 150 = -------- 11 = 13.66 = 14 (approximativement) • Maintenant, sélectionnez un nombre aléatoire entre 1 et 14. Dites que c’est 12; sélectionnez ensuite chaque douzième patient de la liste des nouveaux patients MB enregistrés dans l’année en cours et ce sera votre premier échantillon du district A; maintenant, sélectionnez le second échantillon en lui ajoutant k (14), c’est-à-dire 12 + 14 = 26, le numéro de série du patient 26 sera le deuxième et le numéro de série du patient 40 sera le troisième échantillon. De même, le numéro de série du patient 124 sera le neuvième et le numéro de série 138 sera le dixième échantillon. Cependant, maintenant 138 + 14 = 152, et il n’y a que 150 patients. Ensuite, le onzième échantillon sera de 152 - 150 = 2, c’est-à-dire que le patient avec le numéro de série 2 au début sera le onzième échantillon. De la même façon, un échantillon pour le district B peut être tiré. Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 201744 Un autre exemple illustré d’un schéma d’échantillonnage systématique circulaire est donné avec N = 14 et n = 5. Alors k = nombre entier le plus proche. Que le premier nombre sélectionné au hasard à partir de 1 à 14 soit 7. Ensuite, l’échantillon systématique circulaire est constitué d’unités avec les numéros de série 7, 10, 13, 16 – 14 = 2, 19 – 14 = 5. Veuillez noter que la conclusion tirée au sujet de la résistance ne concerne que les zones couvertes par le site sentinelle. Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre: Mise à jour 2017 45 Annexe 8 Prise en charge clinique des cas résistants détectés Tous les cas inclus dans la surveillance doivent immédiatement être traités par une polychimiothérapie (PCT) standard après la collecte des échantillons sans attendre les résultats du laboratoire de référence sur l’état de la pharmacorésistance. Bien que GLP soit en train de préparer des lignes directrices sur le traitement de la lèpre, y compris pour les cas résistants, à ce jour, les seules indications sur le traitement des cas résistants se trouvent dans le rapport de la huitième réunion du Comité d’Experts pour la Lèpre tenue à Genève en 2010. Selon ce rapport, ce qui suit est un guide sur la prise en charge clinique possible des cas résistants. • Si les résultats montrent une souche sensible, le traitement MB-PCT doit être poursuivi. • Pour les patients déclarés être résistants uniquement à la dapsone, la MB-PCT standard peut être poursuivie, mais le patient doit être suivi à la fin du traitement et régulièrement examiné pour une éventuelle rechute. • Pour les patients qui sont uniquement résistants aux quinolones, la PCT doit être poursuivie. • Dans le cas où le laboratoire de référence signale la présence de M. leprae résistant à la rifampicine, l’un des schémas thérapeutiques suivants doit être prescrit : 400 mg d’ofloxacine + 100 mg de minocycline + 50 mg de clofazimine, tous les jours pendant 6 mois ; suivi par 400 mg d’ofloxacine OU 100 mg de minocycline + 50 mg de clofazimine par jour pendant 18 mois. Le schéma thérapeutique susmentionné est obligatoire chez les patients porteurs de M. leprae résistant à la rifampicine et à la dapsone. Pour les cas résistants à la rifampicine mais sensibles à la dapsone, le schéma thérapeutique ci-dessus est également suggéré. Alternativement, un régime de traitement qui inclut la dapsone pourrait être discuté avec le centre national de référence. Il est obligatoire de déclarer les résultats du traitement des patients atteints de la lèpre détectés avec des résistances aux anti-lépreux en utilisant le formulaire décrit dans l’Annexe 5 (soit sur support papier ou électronique) et de l’envoyer au Programme national de Lutte contre la Lèpre afin que l’information puisse être intégrée dans le registre de la pharmacorésistance. Le réseau actuel de surveillance de la pharmacorésistance de la lèpre est dirigé depuis 2008 par l'Organisation mondiale de la Santé (OMS) avec le soutien financier de la Fondation Nippone initialement et de l'American Leprosy Missions et la Fondation Raoul Follereau ces dernières années. Ce guide a été préparé par le Programme mondial de Lutte contre la Lèpre (GLP) de l'OMS. Il élargit le champ de la surveillance pour inclure également les nouveaux cas de lèpre. Les nouvelles définitions de cas du Guide de Suivi et d'Évaluation de la Stratégie mondiale de Lutte contre la Lèpre 2016–2020 ont également été incorporées. Le guide de surveillance antimicrobienne favorise une couverture beaucoup plus large des tests en fonction de l'importance globale accordée à la résistance antimicrobienne, comme l'indique la Stratégie mondiale de Lutte contre la Lèpre 2016–2020. En 2015, l'Assemblée mondiale de la Santé a adopté la Résolution WHA68.20 pour lutter contre la résistance aux antimicrobiens, de sorte que le besoin d'une attention accrue et de meilleurs systèmes de surveillance, y compris pour la lèpre, a été identifié. Pour ces raisons, GLP, en collaboration avec les principaux partenaires et parties prenantes, a préparé ce guide en tant que mise à jour des Directives pour la surveillance mondiale de la pharmacorésistance de la lèpre (2009). 9 7 8 9 2 9 0 2 2 6 4 2 0 ISBN 978-92-9022-642-2 Guide pour la surveillance de la résistance aux antimicrobiens dans la lèpre Mise à jour 2017 World Health House Indrprastha Estate Mahatma Gandhi Marg New Delhi, India www.searo.who.int