Ciguatera : une méthode rapide, simple et fiable de détection de la ciguatoxine

Bulletin de l'Organisation mondiale de la Sante, 62 (4): 639-645 (1984) (c% Organisation mondiale dc la Sant6 1984 Ciguatera: une methode rapide, simple et fiable de detection de la ciguatoxine A. POMPON, E. CHUNGUE,2 I. CHAZELET3 & R. BAGNIS2 La ciguatera, forme d'intoxication alimentaire consecutive a l'ingestion de poisson de reciffrais, a une incidence sanitaire et economique importante dans les re'gions insulaires ou elle sevit. Or il n'existe a ce jour aucune methode de detection de la ciguatoxicite' rMpondant aux crite'res de simplicite', rapidite et fiabilite' pr6conis&s par les experts de l'Organisation mondiale de la Sante et la Commission du Pacifique sud (Suva, Fidji, 1981). Les techniques biologiques, pharmacologiques, radio-immunologiques et immuno- enzymatiques d6veloppees jusqu'ici sont soit surtout des instruments de laboratoire, soit des outils encore limites dans leur utilisation commerciale par l'absence d'antise'rum commercialise. La methode mise au point dans les laboratoires de l'Institut de Recherches medicales <oLouis Malarde'>, a Papeete (Tahiti), vise notamment d reduire le temps d'extraction de la ciguatoxine, a diminuer le poids de chair de poisson d traiter, et d tirer parti d'un animal sensible de petite taille, commun dans les l^es et d'un elevage facile. Ind6pendamment de son interet au laboratoire, cette methode a une importante portee pratique. En effet, le ((test-moustique)), base sur une determination de la dose ldtale .moyenne (DL5o) et non plus sur une dose letale minimale comme pour le <test-souris>, permet, en choisissant quelques specimens d'un lot determine de poissons d'espece et de provenance d6termine'es, defournir rapidement des indications sur leur comestibilite en vue de leur commercialisation. Le test, dans ses deux phases d'extraction chimique et d'expe'rimentation animale, est entierement re'alis d l'Institut de Recherches medicales <Louis Malarde'>, par un aide-laborantin forme'a cet effet. INTRODUCTION Naturelle ou provoquee, la destruction des massifs coralliens peut favoriser la proliferation d'une algue unicellulaire, Gambierdiscus toxicus, decouverte par Bagnis et al. en 1977 (1). Les toxines qu'elle elabore se concentrent, avec ou sans modification, a travers l'ensemble de la chaine alimentaire pisciaire. L'inges- tion par l'homme des poissons porteurs, apparem- ment sains et appartenant a des especes reputees comestibles, provoque une intoxication, baptis6e <(ciguatera>> au XVIII' siecle (2, 3). Parfois mortelle, la ciguatera a une incidence severe sur la sante publique dans toutes les zones recifales tropicales du globe, hypothequant ainsi la nutrition et l'economie dans ces regions (comme l'a rappele le groupe de travail de l'Organisation mondiale de la Sante sur l'ichtyosarcotoxisme, reuni a Suva, Fidji, en fevrier 1981). Laboratoire de Chimie bioorganique, Universite de Mont- pellier, 2, rue de l'Ecole de Medecine, 34060 Montpellier, France. 2 Institut de Recherches medicales ((Louis Malarde, B.P. 30, Papeete, Tahiti. 3Faculte de Pharmacie, Universite de Lyon I, 8, avenue Rockefeller, 69373 Lyon, France. La diversite des symptomes observes est vrai- semblablement liMe a la multiplicite des toxines responsables. Parmi celles qui sont connues, un com- pose liposoluble, mis en evidence par Hashimoto en 1956, nomme «ciguatoxine>> (CTX) par Banner en 1958 et isole par Scheuer en 1967, est considere comme la cause principale de l'intoxication ciguaterique (4-7). Aucune des methodes de detection de la ciguatoxicite d'un poisson actuellement utilisees ne repond aux criteres recommandes par les comites d'experts de l'OMS: rapidite, simplicite, fiabilite. Les techniques in vivo sur chats (8), mangoustes ou souris (9), qui consistent soit a alimenter ces animaux avec la chair du poisson incrimine, soit A leur inoculer un extrait concentre en toxine(a), sont longues, onereuses et peu satisfaisantes sur le plan de l'ethique. Les techniques in vitro, bien que prometteuses, sont elles aussi limitees par la duree de preparation d'un extrait (experimentation pharmacologique sur organes isoles: 10, 11) ou conditionnees par la fabrication d'un serum specifique anti-CTX en vue d'une mesure radio-immunologique de la toxicite (12, 13). 4441 -639- A. POMPON ET AL. Quant aux techniques physico-chimiques (spectro- m'trie ou chromatographie), elles ne peuvent 'tre actuellement utilisees du fait de la meconnaissance de la structure et des proprietes de la CTX, et de la quantite infime A deceler, aucun traceur de CTX n'ayant encore ete mis en evidence. Les travaux visant A mettre au point un mode de detection ameliore ont recemment abouti, a l'Ins- titut de Recherches medicales «Louis Malarde>> (IRMLM), a des resultats interessants. D'une part, on a demontre la sensibilite de moustiques auxquels on inocule des extraits d'un poisson de l'espece Ctenochaetus striatus partiellement purifies en ciguatoxine (14): la mesure de la DL50 sur une population de 90 insectes s'effectue en deux heures. D'autre part, un procede rapide d'extraction et de purification de la CTX a et mis au point (15): une heure suffit pour traiter quelques grammes de chair et obtenir un extrait injectable aux moustiques. La complementarite de ces deux outils permet de proposer un «test-moustique>> presentant de nom- breux avantages par rapport au «test-souris>>, qui sert actuellement de reference. MATERIEL ET METHODES Pre6paration des extraits Le procede d'extraction rapide evoque plus haut est le suivant: 8 g de chair crue de poisson sont broyes, et homogeneises dans l'acetone. Apres cen- trifugation, le surnageant est concentre et percole sur une cartouche de terre d'infusoires, qui est lavee A l'hexane puis a l'ether. La fraction etheree est evapo- ree, et le residu est purifie par chromatographie rapide A basse pression en eluant successivement par du chloroforme et un melange chloroforme/ methanol (90/10). Apres evaporation de cette derniere fraction, le residu eventuellement toxique obtenu (1,0 ± 0,2 mg) est homogeneise dans IOOAI de diluant (gelatine 0,5%o, serum de veau decompl& mente 50/o, dans du tampon phosphate 0,001 mol/l, NaCl 0,15 mol/l, pH 7,5). On obtient une solution dite N, contenant l'equivalent de 80 mg de chair crue par microlitre. Par dilutions successives, on prepare les solutions N/2, N/4, ... N/128 et eventuellement N/256, qui servent A inoculer les moustiques. Si l'on ne dispose que de chair cuite, les quantites sont normalisees par rapport au poids correspondant de chair crue. On a utilise paralleement la methode d'extraction pratiqu&e en routine a l'IRMLM: 400 g de chair cuite sont traites par l'acetone; la solution est placee 12 heures A - 20°C, filtree et concentree. Le residu aqueux est traite par l'ether et la phase etheree est evaporee. On effectue un partage hexane/methanol aqueux du residu, la fraction alcoolique etant evapo- ree et retraitee 3 heures a 20°C dans l'acetone. Apr's filtration a froid et evaporation, on preleve des ali- quotes- equivalentes a 8 g de chair- pour effectuer le test-moustique. Le reste est utilise pour determiner la DL5o sur souris. Tests de toxicite de re6f6rence La toxicite d'un poisson est estimee d'apres le resultat du test-chat (8): I'animal est alimente avec la chair cuite (1007o de son poids), et on note pendant 48 heures son comportement selon une echelle allant de 0 (absence de trouble) a 5 (deces). En l'absence de trouble, on renouvelle l'alimentation du chat et on l'observe encore pendant 48 heures. La toxicite est evaluee en fonction du poids de chair consommee. Le test-souris sert de reference pour mesurer la toxicite. Selon Chungue et al. (14), une aliquote du residu provenant de l'extraction de 400 g de chair est homogeneisee dans le diluant (0,1 Wo de Tween 60 dans 0,15 mol/l NaCl), et l'equivalent de 40 g de chair dans 0,5 ml est inocule par voie intra- peritoneale chez une souris de 20 g. Suivant l'inten- site des troubles ou le temps letal, on estime une valeur approximative de la dose letale. Cinq lots de cinq souris pesant de 17 g A 20 g sont inocules A des dilutions encadrant cette valeur, et la toxicite du poisson est determinee par la DL5o, calculee selon Bliss (16), normalisee en poids de chair crue et expri- mee en grammes de chair dont l'extrait tue la moitie d'une population de souris de 20 g en 24 heures (g/souris). Test-moustique Les moustiques de l'espece Aedes aegypti sont eleves A l'Insectarium de Paea (Tahiti). On selec- tionne les femelles adultes (poids moyen: 1,6 mg). Chacune des dilutions N, N/2, ... N/128 est injectee intrathoraciquement A des lots de dix moustiques anesthesies au froid, A raison de 0,51l par insecte selon la methode de Rosen et Gubler (17), soit des doses croissantes de 0,31 A 40 equivalents de mg de chair crue par moustique (mg/moustique). Les lots ainsi qu'un lot temoin de dix moustiques anesthesies sont places dans des chambres de reanimation, et l'on note le nombre de moustiques inanimes une heure apres l'injection. La DL50 est exprimee en milligrammes de chair dont l'extrait tue la moitie d'une population de moustiques de 1,6 mg en une heure (mg/moustique). Poissons Quatre especes de poissons appartenant A des niveaux trophiques differents ont et etudiees; il s'agit d'un herbivore microphage: Scarus gibbus 640 CIGUATERA: UNE METHODE DE DETECTION DE LA CIGUATOXINE 641 (Ruppel) UHU RAEPUU; d'un herbivore: Naso uni- cornis (Forskal) UME; et de deux carnivores ichtyo- phages: Plectropomus leopardus (Lacepede) TONU, et Epinephelus microdon (Bleeker) HAPUU.a Pour chaque esp6ce, deux poissons toxiques ont ete selectionnes d'apres les resultats du test-chat, afin de couvrir un large eventail de toxicite. Pour chaque poisson, deux portions de 400 g de chair cuite sont traitees par la technique de reference, et plusieurs portions de 8 g (ou 25 g) sont extraites par la tech- nique rapide. Par ailleurs, quatre lots de dix poissons herbivores de l'espece Ctenochaetus striatus (Quoy & Gaimard) MAITO, peches en differents endroits de l'atoll de Hao et de toxicite inconnue, ont e testes sur mous- tiques (extraction rapide de 8 g de chair crue). Les chairs de toxicite comparable ont e regroupees pour etre testees sur chats. RESULTATS ET DISCUSSION Comparaison du test-moustique et du test-souris Chungue et al. (14) ont constate que la correlation entre le test-moustique qu'ils proposent et le test- souris de reference est significative pour une espece de poisson (n = 80; r = 0,72; P < 0,01). II est a noter que, dans le premier cas, on determine une valeur statistique de la toxicite, alors que dans le second, on n'estime que la dose letale minimale sur un petit nombre de souris, avec tous les aleas dus a la reponse individuelle de l'animal. On a compare la DL5o sur moustiques et sur souris pour une serie de huit poissons appartenant a quatre especes. Le procede d'extraction rapide n'etant pas adapte pour traiter les fortes quantites necessaires au test-souris, on a effectue cette etude sur des extraits obtenus par la technique de reference de Chanteau (these, 1978, Universite de Clermont-Ferrand, France). Les resultats sont representes sur la figure 1. Pour chaque poisson, deux extraits ont et testes sur souris et sur moustiques. On a porte en outre les valeurs des DL5o-moustique mesurees sur les extraits obtenus par le procede rapide, en prenant pour abscisse la moyenne des DL5o-souris correspondantes. La correlation (n = 40, r = 0,89, P<0,01) est tout a fait significative et l'on retrouve a peu pres les resultats de Chungue et al. sur MAITO. La correlation est amelior&e grace a la plus grande precision du test- souris. On peut en deduire que les poissons testes corres- pondent a trois classes de toxicite: e Ces especes, designees ici a la fois par leur nom scientifique et par leur nom vernaculaire (en petites capitales), ne le seront dans la suite de I'article que par ce dernier nom; il en est de meme pour les autres especes mentionnees. 1) fortement toxiques (DL5o-souris < 20 g/souris; DLso-moustique < 3 mg/moustique); ces chiffres concordent avec les resultats du test-chat (3 ou 4 sur 1'e'chelle de toxicite'); 2) moyennement toxiques (les DL5o sont comprises entre 20 g et 40 g/souris et entre 1,5 mg et 5 mg/ moustique); les chats testes presentent des symp- tomes correspondant aux degres de toxicite 1, 2 ou 3; 3) faiblement toxiques (les DL50 sont comprises entre 40 g et 80 g/souris et entre 4,5 mg et 7 mg/ moustique); il est A noter que les deux chats nourris avec le poisson UME ont presente des signes d'intoxi- cation ciguaterique (degre 2): comme ce poisson est herbivore, il pourrait contenir d'autres poisons que la ciguatoxine; une grande prudence s'impose donc dans l'estimation de la toxicite des especes appar- tenant aux premiers maillons de la chalne alimentaire pisciaire. L'analyse de la figure 1 montre en outre que, rapportees au meme poids d'animal teste, les DL50 sont sensiblement les memes pour le moustique et la souris. Le rapport de poids de ces deux animaux permet donc theoriquement un gain considerable sur les quantites d'extraits A injecter (facteur 1/10 000), donc de chair a traiter, en pratiquant le test- moustique. En realite, a nombre egal d'animaux testes, ce facteur est ramene a 300 pour des raisons de precision dans les dilutions et volumes injectes. 6 - Ody o*0 0 020406f20 0 20 40 60 DL,O souris Wg/sowuis de 20g) iff.t1 Fig. 1. Comparaison du test-moustique et du test- souris. Les DL50 sont d6termin6es sur des extraits obte- nus par le procede de reference. Les DLso-moustique sont calculees sur des residus provenant des deux procedes d'extraction. Pour chaque espece ( OTONU; *UHU RAEPUU; A HAPUU; M UME), deux poissons sont testes. (Sdy = erreur type d'estimation de la droite de regression) A. POMPON ET AL. La duree totale du test-moustique, qui est au maximum de 2 heures, est a comparer aux dizaines d'heures necessaires pour mesurer la DL50 sur souris. aspect different de la solution standard N dans le diluant d'injection (jaune et translucide pour les poissons tres toxiques, blanc et laiteux pour les pois- sons atoxiques). Comparaison des deux methodes d'extraction Pour les huit poissons en cause, on a compare les mesures des DL5o-moustique effectuees d'une part sur les 16 extraits obtenus par le procede de reference (19 mesures), d'autre part sur les 21 extraits obtenus par le procede rapide. Les moyennes correspon- dantes ont e portees sur la figure 2. Le tres bon alignement des points sur une droite voisine de la premiere diagonale confirme les premiers resultats et permet d'affirmer que le procede d'extraction rapide est au moins aussi quantitatif et fiable que le procede de reference, tout en etant beaucoup plus simple et rapide a mettre en ceuvre, et ceci pour des poissons d'especes differentes. Sur l'ensemble des poissons etudies, traites par le procede d'extraction rapide, on a retrouve les carac- teristiques des extraits deja annoncees: constance du poids de residu (1,0 ± 0,2 mg a partir de 8 g de chair crue, quelles que soient l'espece et la toxicite) et 6/ DL50 moustique (mg/moustique) / T~~~~ 4 / _4-- //~~~~// n-----/ 0,9 2 4 6 ProcWde de rftgrence WO81i Fig. 2. Comparaison des deux procedes d'extraction. Les valeurs moyennes et extremes des DLso-moustique sont de&termine&es sur des extraits obtenus par le pro- ceded rapide (21 mesures) et par le procede de reference (19 mesures). Huit poissons sont testess, appartenant a quatre especes ( O TONU; * UHU RAEPUU; A HAPUU; Ml UME)- (Sdy = erreur type d'estimation de la droite de regression) Precision et limites du test-moustique On a melange, dans differentes proportions, les chairs de deux HAPUU, l'un fortement toxique, l'autre atoxique d'apres les resultats du test-chat. Les extraits obtenus par le procede rapide ont e testes sur moustiques; les resultats sont portes sur la figure 3. La correlation entre la toxicite des melanges- exprimee comme l'inverse de la DL5o-et le pour- centage de poisson fortement toxique indique la pre- cision et les limites du test-moustique. En effet, sur les onze chats qui ont et nourris avec ces diff& rents melanges, cinq ont et fortement intoxiques (degre 3 ou 4; DL5o < 3,5 mg/moustique), deux l'ont ete moyennement (degres 1 et 2; 3,5 mg/mous- tique < DL50 < 7 mg/moustique), tandis que quatre n'ont pas et intoxiques (DL5o> 7 mg/moustique). Les resultats d'une etude identique effectuee sur des melanges de deux TONU ont donne des resultats analogues aux precedents (n = 7; r = 0,90). A partir de ces resultats et de ceux dej'a publies, il est propose d'interpreter le test-moustique de la facon suivante: DL50 < 7 mg/moustique = poisson toxique 7 mg/moustique < DL50 < 10 mg/moustique = poisson douteux DL50 > 10 mg/moustique = poisson atoxique. 1,0 r 0,8 -0 n= 1l r = 0.84 0 o L 0 I I I I I a I I I 20 40 60 80 100 Pourcentage de poisson fortement toxique w>aJIN Fig. 3. Relation toxicite/dose. Les chairs de deux HAPUU, I'un fortement toxique, I'autre atoxique, sont melan- g6es en proportions differentes. Les DLso-moustique sont mesurees sur des extraits obtenus par le procede rapide a partir de ces melanges, dont la toxicite-chat est estimee (O nulle; 0 faible; 0 forte). 642 I I CIGUATERA: UNE METHODE DE DETECTION DE LA CIGUATOXINE Pour les poissons toxiques, l'incertitude quant A la determination de la DL50 est comprise entre la moitie et le double de la valeur mesuree. Ces estimations ont et controlees sur quatre lots de dix MAITO de toxicite inconnue. Les chairs de toxicite comparable ont et reunies et ont servi A alimenter douze chats. Seuls ceux ayant consomme les melanges estimes toxiques ont presente des signes de ciguatera. Par ailleurs, quelques poissons appartenant A des especes considerees <<A haut risque>> ont et testes sur moustique. Trois d'entre eux ont e consideres atoxiques -une perche A tache noire Lutjanus monostigmus (Cuvier & Valenciennes) TAIVAIVA, DL50 = 18 mg/moustique; un bec-de-cane A mu- seau long Lethrinus miniatus (Forster) OEO, DL50 = 12,2 mg/moustique; un lutjan rouge, Lutja- nus bohar (Forskal) HAAMEA, DL5o = 12,1 mg/ moustique-et consommes par l'un des collabora- teurs de l'etude sans qu'il presente de signe d'intoxi- cation! CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES Une nouvelle methode de detection in vivo de la ciguatoxicite des poissons a ete mise au point grace A la complementarite de deux techniques recemment proposees: 1) un procede nouveau est utilise pour extraire en une heure, A partir de quelques grammes de chair crue de poisson, un residu toxique quantitatif, suffi- samment purifie pour etre utilise dans les tests biolo- giques habituels, et qui de plus est reproductible en poids et en qualite, quelles que soient l'espece et la toxicite du poisson traite; 2) l'extrait obtenu, homogeneise dans un diluant adequat, est injecte par voie intrathoracique, A diverses dilutions, A des lots de moustiques A. aegypti. Une heure suffit pour inoculer 90 insectes, le nombre de survivants etant compte une heure apres l'injection. La mesure de DL5o etant reproductible et precise, il est donc possible de determiner avec une marge de securite convenable si le poisson teste est comestible ou toxique, et de calculer son degre de toxicite avec une precision satisfaisante. Le test-moustique propose presente de nombreux avantages par rapport aux tests couramment prati- ques: outre l'economie en temps, en main-d'oeuvre et en materiel, la faible quantite de chair necessaire permet de tester un poisson sans le detruire, meme dans le cas de petits specimens. Sous l'angle des moyens A mettre en oeuvre, il necessite simplement un petit elevage de moustiques bien isole et protege, ainsi que la formation d'un(e) laborantin(e) aux techniques particulieres de prepa- ration et d'injection de l'extrait de ciguatoxine. Quant a l'emploi d'A. aegypti, il ne constitue pas une condition indispensable A la realisation du test. Celui-ci peut etre indifferemment effectue avec A. polynesiensis, Culex pipiens et Toxorhynchites amboinensis. 11 suffit alors d'ajuster A l'espece choisie le bareme de toxicite mis au point pour A. aegypti. I1 est hors de question, en effet, d'intro- duire A. aegypti, vecteur potentiel de viroses severes notamment, dans une region oui il n'existe pas. Si cette espece a e choisie pour l'etude, c'est qu'elle est endemique et abondante en zone urbaine A Tahiti, peu fragile et tres facile A elever. Le test-moustique est applique en routine a l'IRMLM; les test-chat et test-souris utilises jusqu'A present, du fait de leur assez bonne correlation empi- rique avec les donnees cliniques humaines, ne seront dorenavant employes que pour controler les poissons douteux, ce qui permettra de reduire le volume et les activites de l'animalerie. Un manipulateur peut tester de 25 a 30 poissons par semaine, chaque reponse pouvant etre donnee dans les trois heures. D'autres applications pratiques peuvent etre faci- lement envisagees. Sur le plan medical, l'analyse des reliefs d'un repas permettra d'etayer rapidement un diagnostic dans le cas d'intoxication alimentaire ambigue. Sur le plan de la peche, s'il n'est evidem- ment pas encore possible de tester individuellement chaque poisson propose a la vente, I'analyse d'un nombre significatif d'echantillons d'un lot de pois- sons d'espece et d'origine determinees permettra la commercialisation eventuelle d'especes actuellement interdites A la vente simplement en fonction de don- nees empiriques. Enfin, ce test, par sa facilite d'exe- cution, peut aider A l'actualisation de la carte du risque ciguaterique en Polynesie franqaise. REMERCIEMENTS Les auteurs remercient le D' J.M. Klein ainsi que MM. F. Riviere, M. Barsinas, J. Bennett, M. Chebret et R. Thirel de leur collaboration technique. Ils expriment en outre leur gratitude au Ministere de la Recherche et de l'Industrie ainsi qu'aux autorites du Territoire de la Polynesie franqaise pour leur aide financiere, qui a permis la realisation de ce travail. 643 644 A. POMPON ET AL. SUMMARY CIGUATERA: A RAPID, SIMPLE AND RELIABLE METHOD FOR DETECTING CIGUATOXIN A rapid biological method of determining ciguatoxicity (by a mosquito test) is described. An 8 g sample of raw fish is ground up and homogenized in acetone. After centrifu- gation, the supernatant is concentrated, allowed to perco- late through a filter cartridge containing infusorial earth and rapidly chromatographed on silica. The amount of lipo- soluble residue obtained is 1.0 ± 0.2 mg, irrespective of the fish species and toxicity. The toxicity of the extracts is measured by means of a technique based on the sensitivity of Aedes aegypti mosquitos to ciguatoxin, in which nine batches of ten mosquitos are injected intrathoracically with these extracts at different dilutions. The LD50 for mosquitos can then be determined, i.e., the weight of fish (in mg) in the extract which kills half a given mosquito population (mg/mosquito). Comparison of the LDsos for mosquitos and for mice of extracts from eight fish belonging to four species showed a close correlation between them (n = 40; r = 0.89; P < 0.01). In addition, for a particular fish, the LD5o for mosquitos obtained by the rapid method was correlated with that obtained by the routine procedure used in the Louis Malarde Institute of Medical Research, Papeete, Tahiti (8 fish, 40 measurements). This showed that the extraction procedure was at least as quantitative and reliable as the reference procedure. It is also much simpler and quicker to carry out. An extract ready for injection into mosquitos can be obtained in one hour; another hour is required for injecting 90 mosquitos, and the LD5o can be determined one hour later. The accuracy of this new rapid method of determining ciguatoxicity can be checked by measuring the LD5o for mosquitos of extracts derived from mixtures of varying proportions of two fish of the same species, one highly toxic and the other non-toxic when tested on cats. The correlation between the toxicity of such mixtures-expressed as the reciprocal of the LD5o-and the percentage of highly toxic fish indicates the limits of the mosquito test. On the basis of the empirical correlation between the results of tests on mice and cats with the effects in man, it is suggested that the results of the mosquito test should be interpreted as follows: LD5o of < 7 mg/mosquito = poisonous fish; LDso of 7-10 mg/mosquito = fish of doubtful toxicity; LD5o of > 10 mg/mosquito = non-poisonous fish. These limits were checked by testing four batches of 10 fish of unknown toxicity, using cats and mice. A total of 12 cats were fed on fish whose toxicity had been determined by the mosquito test, and signs of ciguatera were shown only by those that had consumed mixtures considered to be toxic (LDso for mosquitos < 7 mg/mosquito). The proposed mosquito test has many advantages as compared with the usual biological tests: it is more economical in time, man- power and equipment, and is now being used routinely at the Louis Malarde Institute of Medical Research. A trained laboratory worker can test 25-30 fish per week, and the results are available within three hours at the most. Tests on cats and mice will, in future, be used only for fish of doubtful toxicity. BIBLIOGRAPHIE 1. BAGNIS, R. ET AL. Decouverte d'un agent etiologique vraisemblable de la ciguatera. Comptes rendus de I'Academie des Sciences (Paris), 28 (1): 105-108 (1977). 2. HASHIMOTO, Y. Marine organisms which cause food poisoning. In: Marine toxins and other bioactive marine metabolites, Tokyo, Japan Scientific Societies Press, 1979, p. 91. 3. BAGNIS, R. L'ichtyosarcotoxisme de type ciguatera: ph6nom6ne complexe de biologie marine et humaine. Oceanologica Acta, 4 (3): 375-387 (1981). 4. HASHIMOTO, Y. A note on the poison of a barracuda Sphyraena picuda (Bloch & Schneider). Bulletin of Japanese Society of Fisheries, 21 (11): 1153-1157 (1956). 5. BANNER, A. H. & BOROUGHS, H. Observations on toxins of poisonous fishes. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 98 (4): 776-778 (1958). 6. SCHEUER, P. J. ET AL. Ciguatoxin: isolation and chemical nature. Science, 155 (No. 3767): 1267-1268 (1967). 7. HALSTEAD, B. W. & SCHANTZ, E. J. L'intoxication paralytique par fruits de mer. Geneve, OMS, 1984 (Publication offset No. 79). 8. BAGNIS, R. & FEVAI, G. La ciguatera feline experi- mentale a Tahiti. Revue mOdicale vWt&rinaire, 122 (6): 629-637 (1971). 9. BANNER, A.H. ET AL. Observations on ciguatera-type toxin in fish. Annals of the New York Academy of Sciences, 90 (3): 770-787 (1960). 10. MIYAHARA, J. T. ET AL. Effects of ciguatoxin and maitotoxin on the isolated guinea pig atria. Research communications in chemical pathology and pharma- cology, 25 (1): 177-180 (1979). 11. OHIZUMI, Y. ET AL. Mode of the excitatory and inhibitory actions of ciguatoxin in the guinea-pig vas deferens. Journal of pharmacology and experimental therapeutics, 217 (2): 475-480 (1981). 12. KIMURA, L. H. ET AL. Evaluation of the radio- immunoassay (RIA) for detection of ciguatoxin (CTX) in fish tissues. Journal offish biology, 21 (6): 671-680 (1982). CIGUATERA: UNE METHODE DE DETECTION DE LA CIGUATOXINE 645 13. CHANTEAU, S. ET AL. Essai de detection de la cigua- toxine par une methode immunoenzymatique. Bulletin de la SociMtM' de Pathologie exotique et de ses filiales, 74 (2): 227-232 (1981). 14. CHUNGUE, E. ET AL. The use of mosquitoes Aedes aegypti to detect crude ciguatoxin in surgeon-fishes (Ctenochaetus striatus). Toxicon, 22 (1): 161-164 (1984). 15. POMPON, A. & BAGNIS, R. Ciguatera: un proc6de rapide d'extraction de la ciguatoxine. Toxicon, 22 (sous presse). 16. BLISS, C. I. The calculation of the dosage-mortality curve. Annals of applied biology, 22: 134-167 (1935). 17. ROSEN, L. & GUBLER, D. The use of mosquitoes to detect and propagate dengue viruses. Americanjournal of tropical medicine and hygiene, 23 (6): 1153-1160 (1974).