Bosoins en matière de recherches sur la leptospirose

Memoranda Besoins en matiere de recherches sur la leptospirose * Tres re'pandue chez les animaux et chez l'homme, la leptospirosepeutposer desproblemes considerables tant sur le plan de la sante' publique qu'au point de vue economique. C'est une maladie professionnelle importante chez lespersonnes qui travaillent au contact d'animaux ou dans un milieu susceptible d'Wtre contamine par des animaux infectes. Au cours des dernieres annees, une attention conside'rable a etepretee a cette infection, mais les efforts deployes pour la combattre et l'deliminer, en particulier dans les foyers naturels, ont ete' entrave's par les lacunes de nos connaissances. Lepre'sent memorandum fait le point des progres recents et des problemes actuels de la recherche sur la leptospirose, touchant notamment la taxonomie, les m'thodes epidemiologiques et les mesures de lutte. Certains aspects de la biologiefondamen- tale des leptospires qui y ressortissent sont egalement traites. BIOLOGIE FONDAMENTALE DES LEPTOSPIRES Morphologie 1 Les leptospires sont des micro-organismes helicoi- daux Gram-negatifs, constituds d'un corps cytoplas- mique muni d'un <axistyle * subterminal insdrd a chaque extremite, et d'une gaine ou enveloppe qui recouvre le tout. L'axistyle se compose de deux filaments axiaux insdrds aux extrdmites du corps cytoplasmique au moyen de disques ou de renfle- ments terminaux, et dont 1'extremite libre ddbouche dans la region mediane du micro-organisme. Les filaments axiaux se trouvent donc entre la gaine et la paroi cellulaire. Des prdparations hautement purifides de filament axial ont ete obtenues au moyen de divers traite- * La liste des auteurs ayant particip6 it la redaction de ce memorandum figure en page 649. Les demandes de tirns i part doivent etre adressees au Chef du Service de la Sante publique veterinaire, Organisation mondiale de la Sante, 1211 Geneve 27, Suisse. 1 Deux points importants meritent d'etre signales. D'une part, plusieurs auteurs n'ont pu mettre en evidence certaines des structures morphologiques fines qui ont ett decrites. Par ailleurs, les termes employes pour les decrire pretent i confusion; en effet, un meme terme est quelquefois applique i des structures differentes, et une meme structure design6e sous des vocables divers. Une etude critique de la biblio- graphie et une normalisation de la nomenclature relative aux structures fines sont donc necessaires. Cette mise au point ne devrait pas se limiter au genre Leptospira mais inclure egalement d'autres genres appartenant i l'ordre des Spiroche- tales ainsi que les (( micro-organismes spirales )) qui ne peuvent encore etre rattaches i aucun genre connu. Les termes utilises dans ce memorandum sont ceux qui sont le plus couramment employes par divers auteurs, et leur emploi n'implique pas qu'ils soient recommandes i titre definitif. ments physiques et chimiques. Chang & Faine (1970) et Naumann et al. (1969) ont mis en evidence la similitude qui existe du point de vue de la morpholo- gie gdnerale, de la taille et des caractdristiques physi- co-chimiques, entre les filaments axiaux et les fla- gelles bacteriens. Ces observations dtayent l'hypo- these suivant laquelle l'axistyle des leptospires joue- rait un r6le dans la motilite de l'organisme et les filaments axiaux ne seraient que les equivalents, de localisation unique, des flagelles. Selon Chang & Faine (1970), les filaments axiaux contiennent des antigenes qui, bien qu'identifiables, poss'dent des caracteres sdrologiques ne rentrant pas tout a fait dans la classification des leptospires etablie au moyen des reactions classiques d'agglutination et d'agglutination croisee. II n'y a pas d'unanimite quant a la structure des leptospires et au nombre de couches de la membrane et de la paroi cellulaire. De la surface vers 1'interieur on a observe des structures concentriques distinctes disposees dans l'ordre suivant: 1) une enveloppe ou gaine; 2) une < couche perimurale)) dans laquelle est ancre l'axistyle et d'oui semblent partir les fibrilles mentionnees ci-dessous; 3) une paroi cellulaire qui semble etroitement associee a la membrane cyto- plasmique. La nature et la fonction de l'enveloppe n'ont pas encore ete elucidees. La plupart des auteurs y ont vu une structure 'a trois feuillets, mais certaines observa- tions en mentionnent jusqu'a cinq (Anderson & Johnson, 1968). Cette gaine est facilement endomma gee ou detruite lorsqu'on traite les leptospires avec de l'eau, des solutions de chlorure de sodium, de 2944 -641- MEMORANDA 1'ethanol, du formol, du thiomersal, du phenol ou de l'ox6tanone-2 (8-propiolactone). Sous I'action des anticorps et du compl6ment, l'enveloppe de certaines souches est 6galement d6truite (Anderson & John- son, 1968). Yanagawa & Faine (1966) ont observ6 que des cellules dont l'enveloppe avait ete partielle- ment eliminee a la suite d'un traitement par l'6thanol perdaient de leur pouvoir d'agglutination. II serait souhaitable de poursuivre les recherches sur les pro- priet6s de cette enveloppe. La couche fibrillaire perimurale d6crite par Yana- gawa & Faine (1966) a ete 6galement observee par Yanagihara & Mifuchi (1968). Nauman et al. (1969) ont observe, au microscope electronique, une couche opaque entre l'enveloppe et la paroi cellulaire. Plusieurs auteurs ont montr6 que la paroi cellu- laire des leptospires a la meme structure et la meme composition chimique que celle d'autres micro-orga- nismes Gram-negatifs (Anderson & Johnson, 1968; Pillot & Ryter, 1965; Yanagawa & Faine, 1966). Il semble que la paroi cellulaire n'ait qu'un faible pouvoir agglutinogene (Yanagawa & Faine, 1966). On a retrouve, lors d'etudes plus r6centes, des constituants intracytoplasmiques deji decrits - par exemple les regions nucl6aires et les structures ribo- somiennes et lamellaires. Katz et al. (1968) affirment que certaines des inclusions cellulaires opaques aux electrons seraient des polysaccharides. Le mode de reproduction par scission transversale a et confirme, mais la nature des structures kystoides et des orga- nites situes aux extr6mites de la cellule (Ritchie & Ellinghausen, 1965; Katz et al., 1968) reste obscure. L'etude du role des structures cellulaires dans l'antigenicite et la virulence des leptospires parait prometteuse. L'application de nouvelles methodes de coloration, la realisation de coupes fines et les tech- niques de cryodecapage utilisees en microscopie elec- tronique pourraient permettre d'elucider le probleme de l'ultrastructure de certains constituants hypotheti- ques. Il serait souhaitable de mettre au point des techniques histochimiques applicables en microsco- pie electronique afin de preciser la nature chimique des composants structuraux. Caracteristiques immunochimiques et antigeniques Les caracteristiques immunochimiques des compo- sants antigeniques et leurs relations avec les reactions serologiques et la virulence posent encore un certain nombre de problemes. Des observations preliminai- res (Chang & Faine, 1970; Chang et al., 1970) ont fait apparaitre la necessite d'etudier plus avant l'anti- genicite de certains composants structuraux. On sait qu'il existe dans la cellule des leptospires des anti- genes sp6cifiques d'un serotype particulier (par exem- ple les agglutinogenes) et des antigenes moins specifi- ques (par exemple les substances sensibilisant les erythrocytes et les antigenes de certaines souches du complexe biflexa donnant lieu i des reactions croi- sees). Les agglutinogenes ont, en particulier, fait l'objet d'etudes intensives au moyen des techniques classi- ques d'agglutination ou d'absorption des agglutini- nes, qui sont a la base de la classification actuelle des leptospires. Encore que la nature chimique de ces antigenes reste inconnue, Kmety (1967) a fait pro- gresser sensiblement l'analyse serologique des fac- teurs agglutinogenes. Borg-Petersen (1971) a recem- ment signale l'existence d'un agglutinogene thermo- labile rapidement detruit aL 56°C; on n'a pas encore examine si les changements de phase avait un effet sur cet antigene. En gen6ral, les cultures maintenues dans les condi- tions du laboratoire ne voient pas, semble-t-il, la stabilite biologique de leurs agglutinog6nes varier de faron sensible. Les variations discontinues observees de temps 'a autre dans les cultures meres n'entrainent que des differences mineures entre les lign;es paren- tales et les lign6es deriv6es. Il a toutefois W demon- tre 'a plusieurs reprises que des variants serologiques stables de pouvoir agglutinogene tres diff6rent peu- vent etre obtenus en cultivant des souches en pre- sence d'antiserums homologues ou d'antis6rums he- terologues apparentes. II semble donc qu'il existe dans les cultures de leptospires des mutants serologi- ques susceptibles d'etre selectionnes par l'introduc- tion d'antiserums dans le milieu. I1 serait souhaitable de poursuivre l'etude des proprietes biologiques et chimiques des souches parentales et derivees. On sait que l'agglutinabilite des cultures est sujette a variation. Stalheim (1966) a montre que pour que la souche acquiere une agglutinabilite convenable, il fallait lui fournir une quantite optimale d'acides gras. En elevant une souche virulente dans un milieu synthetique de teneur limitee en Tween 80, cet auteur a observe que les cellules n'etaient que peu agglutina- bles et agglutinogenes, et n'absorbaient qu'incomple- tement les agglutinines homologues. Apres passages dans un milieu complet, les cellules avaient retrouve toute leur agglutinabilite et leur agglutinogenicite, mais avaient perdu leur virulence. Les travaux de Stalheim (1966) ont conduit les taxonomistes a ac- corder une plus grande attention aux conditions dans 642 RECHERCHES SUR LA LEPTOSPIROSE lesquelles sont prepares d'une part les antigenes utilises pour l'absorption et l'agglutination, et d'au- tre part les immunserums de lapin. En outre, ils ouvrent la voie a de nouvelles recherches sur la nature des antigenes agglutinants. Le r6le des agglutinogenes et des autres facteurs cellulaires dans l'immunite devrait faire l'objet d'un nouvel examen. Pendant de nombreuses annees on a pense, en s'appuyant sur l'experience, que les agglu- tinogenes etaient apparentes aux substances immu- nogenes. II a ete maintes fois demontre que l'infec- tion par une souche ayant un serotype particulier protegeait contre une reinfection par d'autres sou- ches de meme serotype, mais non contre une infec- tion par des souches ayant un serotype de caracteris- tiques agglutinogenes differentes, mises en evidence au moyen d'immunserum de lapin. Les serotypes qui, bien que serologiquement hete- rologues, sont tout de meme apparentes conferent une protection croisee contre l'infection chez l'hom- me et chez quelques animaux (Babudieri, 1959). Jusqu'a une epoque recente, on n'avait pas encore etudie serieusement le degre de protection crois6e (c'est-a-dire d'attenuation des sympt6mes). Kemenes (1964) et, plus recemment, Plesko (1968) et Plesko & Lataste-Dorolle (1970a, 1970b) ont mis en evidence une protection croisee experimentale avec quelques serotypes plus ou moins apparentes par leurs caracte- res antigeniques (icterohaemorrhagiae, canicola, po- mona, grippotyphosa, australis, bataviae), mais pas avec d'autres serotypes non apparentes (sejroe et tarassovi). Il est interessant de noter qu'apres infec- tion, les differences de protection croisee entre des serotypes serologiquement heterologues correspon- dent a leur classification en groupes genetiques et biologiques. II serait utile, pour mieux comprendre la nature des antigenes, des reactions antigenes-anticorps, de l'immunite et de la persistance des infections de savoir a quelles classes appartiennent les immunoglo- bulines des anticorps secretes par les sujets immuns. D'un point de vue pratique, il serait bon de connaitre les composants immunoglobuliniques chez l'homme et chez plusieurs animaux infectes par diff6rents serotypes, ainsi que la reactivite specifique manifestee par ces immunoglobulines dans diverses epreuves serologiques. II faudrait egalement determiner les types d'immunoglobulines induites par divers sero- types chez des lapins hyperimmunises, selon qu'on applique differents schemas d'immunisation, ainsi que la reactivite homologue et croisee des consti- tuants immunologiques, et leur influence sur les techniques d'absorption des agglutinines. Ces infor- mations sont necessaires pour normaliser de faqon rationnelle les methodes de typage des souches. On devrait egalement prendre en compte, lors de l'inter- pretation et de l'evaluation des etudes d'immunisa- tion et d'infection experimentales, les differences, averees ou 6ventuelles, que peuvent presenter les immunoglobulines et les reactions d'un sujet immun a l'infection, selon qu'on a affaire ia telle ou telle souche d'animaux d'experience. Quelques etudes ont ete tentees en vue de determiner a quelles classes d'immunoglobulines correspond la reponse immuni- taire mais il faudrait poursuivre les recherches dans cette voie. L'etude de la lyse des leptospires sous l'action de facteurs presents dans le serum normal n'a pas permis de degager l'importance de ce phenomene en ce qui concerne la virulence du micro-organisme, ni de determiner le site d'action des facteurs seriques specifiques ou non specifiques. La encore, des recher- ches plus poussees sont necessaires. Compte tenu des resultats de Hoeden (1966), il faudrait etudier l'im- munologie comparee des substances anti-leptospires chez diverses especes non mammaliennes. Les resul- tats fournis par les divers laboratoires au sujet des effets lytiques des anticorps et du complement sur les leptospires ne sont pas necessairement contradictoi- res, car les conditions d'experimentation etaient, dans le cas particulier, differentes. La lyse par anti- corps en presence de complement, mise en evidence par Johnson & Harris (1968), a ete observee dans des conditions qui ne sont pas celles des epreuves habi- tuelles d'agglutination microscopique. Metabolisme et autres activites chimiques Sachant que les lipides constituent, pour les lepto- spires, une importante source d'energie, on a pu mettre au point le milieu dit <4 albumine-Tween 80 * pour la culture de leptospires pathogenes et sapro- phytes (Ellinghausen & McCullough, 1965), ainsi qu'un autre milieu, de composition chimique bien definie (Shenberg, 1967), qui permet d'entretenir la croissance de certaines souches. Les besoins des leptospires en acides gras de croissance sont mainte- nant mieux connus (Johnson et al., 1969, 1970), mais les travaux doivent etre poursuivis. On a observe des differences dans la sensibilite des souches aux acides gras libres presents dans le milieu de culture. De telles observations peuvent etre d'un grand secours pour la comprehension du metabolisme des lepto 643 MEMORANDA spires et pour les tentatives de culture, notamment en milieu synthetique. Pour l'isolement et la culture courants des leptospires, on peut etre amene a utiliser une serie de milieux synthetiques contenant divers acides gras en proportions variees. On ne sait rien de certain quant au role des metabolites autres que les acides gras dans le cycle 6nergetique des leptospires. II est desormais prouve que le cycle de l'acide citrique, la voie glycolytique et la voie des pentoses existent chez ces micro-orga- nismes (Green et al., 1967; Baseman & Cox, 1969a). On a etudie diverses enzymes et tente d'en relier la presence a des proprietes taxonomiques ou patho- genes, mais les resultats ne sont guere concluants. La possibilite d'un lien entre la teneur en cytochrome-a et la pathogenicite (Baseman & Cox, 1969b) merite- rait une etude plus poussee. La forte teneur du corps cellulaire des leptospires en lipides a ete clairement demontree. Certains des acides gras qui le constituent ont ete identifies (John- son et al., 1970; Livermore et al., 1969; Stern et al., 1969). L'un des principaux constituants lipidiques d'une souche ballum est un isomere de position inhabituel de l'acide hexadecenoique (Livermore et al., 1969); ce meme isomere est egalement l'un des principaux constituants lipidiques de la souche cani- cola elevee en presence d'oleate (Stern et al., 1969). La connaissance de la composition en acides gras des leptospires peut etre utile en taxonomie. L'activite lipolytique de diverses souches, patho- genes ou saprophytes, de leptospires a ete etudiee en detail par de nombreux chercheurs, dont les observa- tions sont remarquablement coherentes. Les souches saprophytes manifestent invariablement une activite lipasique tandis que les leptospires pathogenes ne la possedent pas toujours. Une correlation interessante et significative a etd observee entre l'activite lipasique et d'autres proprietes; Kemenes (1964) a attire l'at- tention sur l'existence possible d'une relation entre I'activite lipolytique et l'immunite croisee, et par ailleurs Bakoss & Chorvath (1965) ont observe des differences antigeniques entre les diverses lipases. L'activite lipolytique de toutes les souches parasitai- res dtudiees etait neutralisee totalement ou en partie par un antiserum dirige contre l'ensemble de la culture, mais les enzymes des souches parasitaires presentaient des caracteristiques antigeniques dis- tinctes de celles des souches saprophytes. On n'a pas observe de neutralisation croisee. Ces observations preliminaires ont par la suite conduit les auteurs a penser que les lipases des souches saprophytes com- portent au moins deux types antigeniques differents. II serait interessant de rechercher si la specificite serologique des lipases est liee aux differences geneti- ques observees entre les souches saprophytes. Du point de vue taxonomique, il existe une bonne correlation entre l'activite lipasique des souches pa- thogenes et leur sensibilite initiale 'a l'action inhibi- trice de la diamino-2,6 purine (DAP) sur la crois- sance. Selon l'activite de la trioleinase et la sensibilite aux analogues de la purine (DAP) et a l'aza-8 gua- nine, Johnson & Harris (1968) ont distingue trois groupes de leptospires. Les groupes 1 et 2 compren- nent les souches du complexe parasitaire tandis que le groupe 3 compreild les souches du complexe saprophyte. Les souches du groupe 1 produisent de la trioleinase et sont sensibles a la DAP (du moins au debut) ainsi qu'a l'aza-8 guanine (par exemple les souches des serotypes icterohaemorrhagiae, canicola et pomona). Le groupe 2 comprend les souches ne produisant pas de trioleinase, resistantes a la DAP et sensibles a l'aza-8 guanine (par exemple les souches des serotypes javanica, ballum et tarassovi). Les sou- ches du groupe 3 produisent de la trioleinase et sont resistantes tant a la DAP qu'a l'aza-8 guanine. Il existe en outre une souche (Kabura) du complexe parasitaire qui ne produit pas de trioleinase et se revele sensible a la fois a la DAP et a l'aza-8 guanine; cette souche pourrait representer un quatrieme grou- pe. Les trois groupes de Johnson & Harris (op. cit.) pourraient etre rapproches des quatre groupes gene- tiques decouverts par Haapala et al. (1969). 11 serait bon de determiner a quelles differences dans les voies metaboliques correspondent ces observations. Les recherches de Kasarov & Addamiano (1969) relatives a l'action lipolytique des leptospires sur les lipoproteines du serum de lapin ont fourni une preuve supplementaire des differences fondamentales existant entre les leptospires parasitaires et saprophy- tes. Les triglycerides des lipoproteines seriques ont ete totalement ou presque totalement hydrolyses par chacune des six souches saprophytes etudiees, tandis que 15 souches parasitaires sur 16 n'ont pratique- ment pas eu d'action. La seule souche parasitaire ayant eu un effet sur les triglycerides a produit de la lipase lorsqu'on l'a eprouvee sur les graisses de reserve animales. En prenant les phospholipides seri- ques comme substrats, on a pu mettre en evidence des differences d'activite lipolytique non seulement entre les souches parasitaires et saprophytes, mais aussi a l'interieur du groupe parasitaire. A premiere vue, les deux groupes (B et C) de souches parasitaires ne semblent pas correspondre 'a ceux qu'ont decrits Johnson & Harris (1967) ou Haapala et al. (1969). 644 RECHERCHES SUR LA LEPTOSPIROSE Les souches saprophytes (groupe A) agissaient sur la lecithine mais non sur la sphingomyeline, les souches parasitaires du groupe B agissaient a la fois sur la lecithine et sur la sphingomyeline, et les souches parasitaires du groupe C n'agissaient sur aucun de ces phospholipides. Kasarov (1970) n'a pas trouve de diffdrence fondamentale entre la degradation des phospholipides liUs aux lipoproteines du sdrum et celle des phospholipides lies a la membrane drythro- cytaire. Comme il existe des differences qualitatives et quantitatives entre les phospholipides des mem- branes erythrocytaires de diverses especes de mam- miferes, ces observations soulevent a nouveau la question de l'existence eventuelle d'une relation entre les phospholipases des leptospires et leur pathogeni- cite. Genetique Avant 1969, il n'y avait que peu de publications traitant de la genetique des leptospires. La selection apparente de mutants, obtenue en cultivant diverses souches dans un serum homologue, a deja ete men- tionnee. Faine & Hoeden (1964) ont separe un mu- tant non virulent de icterohaemorrhagiae. Ce change- ment de virulence etait lie a la morphologie coloniale et cellulaire. La transformation in vivo de la virulen- ce, des caracteres antigeniques ou des deux a la fois, chez des serotypes homologues ou etroitement appa- rentds a pu etre rdalisee avec succes (Bazovska & Kmety, 1968; Riel, 1964). Selon la composition en bases de I'ADN et son mode de duplication, Haapala et al. (1969) ont distingud quatre groupes genetiques de leptospires parmi les souches parasitaires et saprophytes selec- tionnees de divers serotypes. Les leptospires pathoge- nes peuvent se diviser en deux groupes d'apres leur pourcentage de guanine + cytosine (G + C) dans l'ADN; un groupe en contient 36% et l'autre 39%. Les souches saprophytes, qui contiennent 39% de G + C, ont ete ulterieurement separees en deux groupes d'apres les epreuves de recuit de 1'ADN. A l'interieur des groupes, les souches ont une forte capacitd de duplication (au mois 75% de liaisons). Il n'y a que peu ou pas de parente genetique entre les souches des quatre groupes (moins de 15% d'homo- logie). Les souches d'un meme groupe ne prdsentent pas necessairement des caracteres agglutinogenes voisins; cependant, des souches de meme serotype ou de serotype tres voisin appartiennent au meme grou- pe gdndtique. Comme on vient de le voir, les souches pathogenes forment deux groupes gendtiques independants qui se distinguent des deux groupes gen6tiques de souches saprophytes par un certain nombre de caracteres phenotypiques. 11 conviendrait d'examiner davantage de souches d'apres les methodes de groupage gene- tique. On peut raisonnablement predire l'existence d'autres groupes de leptospires genetiquement heterologues ou intermediaires. Les etudes genetiques necessitent l'emploi de clo- nes purs; les techniques de clonage devraient donc etre ameliordes. A l'heure actuelle, d'apres ce que l'on sait de la parentd phylogdnetique et des caracteristiques de I'ADN d'autres bacteries, il semble que les taxono- mistes aient de bonnes raisons de songer a conferer le rang d'espece aux groupes genetiques de leptospires. On peut maintenant envisager de classer les lepto- spires d'apres leurs caractdristiques tant genotypi- ques que phenotypiques. Les techniques genetiques ne sont toutefois pas encore suffisamment au point pour qu'on les utilise couramment en taxonomie et la differenciation des organismes est encore liee 'a 1'exis- tence de caracteres phenotypiques et de mecanismes regulateurs facilement reconnaissables. Toutefois, la mise en dvidence de divers groupes genetiques de leptospires et I'association de plusieurs caracteres phenotypiques a certains de ces groupes est un premier pas encourageant vers la mise au point d'un systeme taxonomique naturel et fonctionnel. Parmi les caracteres phenotypiques actuellement uti- lisables, ou en voie de 1'etre, pour differencier les groupes de leptospires on peut noter les antigenes, la croissance en presence de concentrations determinees de diamino-2,6 purine, d'aza-8 guanine, de sulfate de cuivre et de carbonate acide de sodium, la croissance a 130C, l'utilisation de divers acides gras pour la croissance, 1'activite des lipases (par exemple de la trioldinase) et leur specificite serologique, l'activite relative des oxydases, la production d'effets cytopa- thogenes en cultures tissulaires, l'activite de la leci- thinase et de la sphingomyelinase, la sensibilite au serum et aux facteurs seriques. La possibilite d'utili- ser le degre de sensibilite des leptospires aux antibio- tiques comme critere taxonomique devrait etre exa- minee. Parmi les differences phenotypiques, quel- ques-unes sont quantitatives, ce qui ne porte pas necessairement atteinte a leur validitd en tant que criteres d'identification. Les donndes concernant les marqueurs et les pro- portions entre paires de bases de I'ADN pourraient s'appliquer a l'etude des modifications genetiques qui se produisent en milieu naturel. Il faudrait pour- suivre les recherches sur le mdcanisme de ces modifi- 645 646 MEMORANDA cations. La decouverte de phages 1 de leptospires ou d'autres mecanismes de x transfection * pourrait ai- der aL elucider ces problemes. TAXONOMIE Espetces L'Index Bergeyana (Buchanan et al., 1966) enu- mere 40 especes et 5 varietes de Leptospira publiees et legitimees, et 53 serotypes sans designation d'espece. La plupart de ces taxa ont ete diff6rencies d'apres des criteres serologiques et pourraient maintenant etre consideres comme s6rotypes, c'est-'a-dire comme des formes infra-sous-specifiques. La plupart des sero- types ont deja et6 signales (voir Groupe OMS d'ex- perts des problemes actuels des recherches sur la leptospirose, 1967). Les signataires de ce memorandum approuvent le Groupe OMS d'experts des problemes actuels des recherches sur la leptospirose (1967) lorsqu'il recom- mande de considerer le genre Leptospira comme monospecifique jusqu'a ce qu'il soit possible de deli- miter les especes avec certitude. D'ici la, on peut continuer a utiliser l'epithete specifique # interro- gans *, car elle est la premiere en date, et, ce qui est plus important, ne peut etre confondue avec des epithetes designant d'autres groupements de lepto- spires tels que serogroupe et serotype, qui presentent un interet pratique pour les cliniciens et les epidemio- logistes. Des travaux recents ont montre que le genre Lep- tospira comprend plusieurs groupes biologiques qui se distinguent par leurs caracteristiques phenotypi- ques ou genetiques. Mais ni les groupes genetiques ni les autres groupes biologiques ne s'inserent nette- ment dans le schema actuel de classification, base sur les agglutinogenes. Le Sous-Comite de Taxonomie des Leptospires devrait prendre en consideration la proposition de Haapala et al. (1969) de conferer le rang taxonomi- que d'espece aux groupes genetiques; ces auteurs n'ont pas propose de noms. Le Sous-Comite devrait aussi se pencher sur les problemes de nomenclature qui pourraient se poser. Sirotype Le serotype reste le taxon de base. Kmety (1970) a propose cinq conditions devant etre remplies pour le typage des souches. Leur adoption pourrait reduire 1 Ritchie & Ellinghausen (1969) ont signal6 I'association d'une entit6 de type bact6riophagique avec Leptospira. le nombre des desaccords entre les resultats des differents laboratoires. II est propos6 au Sous-Comit6 de Taxonomie d'6tudier la possibilite d'inclure ces conditions dans la definition du serotype. Le Sous- Comite pourrait examiner si la presence d'un aggluti- nogene thermolabile dans certaines souches appelle une revision de la definition du < serotype *. Serogroupe On a maintenu le principe du groupement des serotypes ayant des relations agglutinogeniques voi- sines, r6velees par les reactions d'agglutination croi- see 'a titre eleve avec des antiserums de lapin. I1 a toutefois ete propose de subdiviser le grand sero- groupe Hebdomadis en plusieurs groupes plus petits car les souches de la liste actuelle ne produisent pas d'agglutination croisee 'a titre eleve avec tous les autres antiserums. I1 a egalement ete propose de subdiviser le serogroupe Autumnalis. Le Sous-Comi- te de Taxonomie pourrait examiner utilement ces propositions. METHODES DE DIAGNOSTIC Examens microscopiques Plusieurs auteurs ont applique les techniques d'im- munofluorescence a la recherche des leptospires dans les echantillons de tissus ou de liquides organiques, en particulier d'origine animale. Toutefois, aucune des methodes decrites n'a ete convenablement eva- luee et il est pour l'instant impossible de recomman- der en pratique courante l'une quelconque d'entre elles. L'existence d'un immunserum approprie permet- trait, par 1'epreuve d'immunofluorescence, d'identi- fier une leptospirose independamment du serotype de la souche infectante. I1 convient de poursuivre les recherches sur l'utilite potentielle d'un antiserum unique ou d'un melange d'antiserums dans le cas de souches a large spectre d'activite de certains seroty- pes (souche Patoc 1 (patoc), Andamana CH 11 (anda- mana), Jez Bratislava (bratislava), Poi (poi), par exemple). I1 faut souligner que les methodes d'immunofluo- rescence appliquees a la recherche des leptospires ont des limites qui sont, quoique en moins strict, celles que connaissent les autres methodes microscopiques de detection, en ce sens qu'elles exigent aussi une concentration suffisante des micro-organismes. Tous les diagnostics qui s'appuient sur l'epreuve d'immu- nofluorescence doivent, chaque fois qu'il est possible, etre corrobores par les methodes culturales et serolo- giques. RECHERCHES SUR LA LEPTOSPIROSE Isolement par culture directe Pour inhiber le developpement de bacteries conta- minantes dans les cultures et dans les isolats primai- res de leptospires obtenus a partir de preleVements effectues en l'absence d'asepsie, l'addition de fluoro- 5 uracile aux milieux donne, selon divers auteurs, toute satisfaction. Cependant, certains laboratoires ont constate que les milieux au fluoro-5 uracile inhi- baient totalement la croissance des leptospires. On peut eviter cet 6cueil liH a la solubilite du fluoro-5 uracile, en utilisant des solutions commerciales steri- les qui pourront etre ensuite diluees aseptiquement et stockees a 4°C. Turner (1970) a decrit un procede permettant de preparer les solutions de fluoro-5 uracile. Pour purifier des cultures contaminees ou isoler directement les leptospires saprophytes contenus dans l'eau et, dans certains cas, les souches patho- genes d'echantillons de sang, d'urine et de divers tissus, les milieux solides a 1% de g6lose repartis sur plaques (boites de Petri) rendent d'utiles services. Toutefois, les souches pathogenes ne cultivent pas toutes facilement sur ces milieux solides. Pour la culture directe des leptospires pathogenes obtenus de prelvements effectues aseptiquement, les milieux classiques (c'est-a-dire additionnes de serum) semi- solides ou liquides sont recommandes. Epreuve d'agglutination microscopique L'epreuve d'agglutination microscopique reste, pour le diagnostic serologique de la leptospirose chez l'homme et chez l'animal comme pour la classifica- tion serologique des leptospires, la methode type de reference. Sa sensibilite et sa specificite sont excellen- tes lorsqu'elle est appliqu&e en utilisant pour les suspensions antigeniques des serotypes judicieuse- ment choisis, qu'il s'agisse de depister une infection chez un sujet donne ou d'enquetes epidemiologiques. Les divers facteurs qui influent sur cette sensibilite et cette specificite ont ete etudies par le Groupe OMS d'experts des problemes actuels des recherches sur la leptospirose dans son rapport de 1967. On a deja appele l'attention sur certaines observations selon lesquelles les lipides et eventuellement d'autres nutri- ments des milieux de culture risquent d'affecter sensi- blement en qualite et en quantite, les agglutinogenes qu'elaborent les leptospires. Dans ces epreuves d'agglutination, il importe d'employer de bonnes cultures de leptospires a mor- phologie typique; il est en outre indique de verifier l'agglutinabilite des antigenes d'epreuve en pre- voyant dans chaque cas un temoin constitue par un antiserum homologue de lapin, convenablement di- lue. Quant aux antigenes a utiliser dans ces epreuves, la liste qu'en a donne le Groupe OMS d'experts des problemes actuels des recherches sur la leptospirose (1967), guide precieux pour bien des laboratoires, n'est peut-etre pas complete en ce qui concerne les serotypes presents dans certains pays. Une liste revi- see, comportant les additions qui, a l'experience, ont paru necessaires, est proposee en annexe. Les resultats des epreuves d'agglutination micro- scopique fournissent souvent des indices pour la determination du serotype infectant. Mais l'identifi- cation definitive de la souche infectante n'est possible que par l'isolement et le typage. Avec l'emploi de serums anti-facteurs varies, le typage des souches de certains serogroupes donnerait de bons resultats, mais la determination definitive des caiacteristiques serotypiques d'une souche repose toujours sur l'em- ploi des methodes d'absorption croisee. Autres methodes serologiques Les epreuves d'agglutination macroscopique sur lame utilisant des melanges d'antigenes formoles se sont revelees interessantes pour le diagnostic des infections en cours chez l'homme et chez l'animal. Cependant, les lots d'antigenes prepares presentent parfois des agglutinats non specifiques qui peuvent donner lieu a des r6sultats faussement positifs et par suite 'a des erreurs d'interpretation. Une agitation vigoureuse avant l'emploi peut faire disparaitre ces agglomerats. Ces epreuves doivent obligatoirement comporter des temoins positifs et negatifs. D'autres methodes serologiques ont ete proposees qui, telles les epreuves d'hemolyse ou de fixation du complement utilisant comme antigene la souche sa- prophyte Patoc 1 a large spectre, ont ete avantageu- sement utilisees pour detecter les anticorps chez l'homme; mais en ce qui concerne les serums d'ani- maux domestiques, leurs applications sont limitees. Il existe peut-etre une correlation significative entre les differences que presentent les constituants immuno- globuliniques des anticorps induits chez l'animal ou chez l'homme et la sensibilite des methodes serologi- ques. De nouvelles dtudes sur la reponse immunoglo- bulinique a l'infection par divers serotypes de lepto- spires chez differentes especes animales devraient permettre d'expliquer les difficultes rencontrees dans les epreuves serologiques utilisant le complement et fournir de nouvelles bases pour la mise au point et l'amelioration des reactifs sdrologiques de diag- nostic. 647 648 MEMORANDA Les laboratoires qualifies pour effectuer les epreu- ves de fixation du complement, mais qui ne le sont pas suffisamment pour les tests d'agglutination mi- croscopique, pourraient facilement appliquer la me- thode qu'ils utilisent en pratique courante au diag- nostic serologique de la leptospirose chez 1'homme en employant comme antigene la souche saprophyte Patoc 1. Mais lorsque differents laboratoires doivent comparer leurs resultats, l'adoption d'une methode normalisee est indispensable. Reactifs de reference et normalisation I1 est propose d'ajouter le critere enonce ci-apres a ceux auxquels est subordonnee l'acceptation de nou- veaux serums etalons anti-Leptospira: l'absorption des serums anti-Leptospira proposes par des antige- nes homologues doit eliminer les agglutinines decela- bles homologues et provoquant des reactions croi- sees. PATHOGIME On a fait etat d'effets cytopathogenes sur divers types de cellules et de tissus en culture. L'importance de ces observations tient principalement a l'utilisa- tion eventuelle des cellules de ces cultures comme indicateurs pour etudier la pathogenie ou la virulence en dehors de l'interference des facteurs immunitaires de l'h6te, les mecanismes et les facteurs internes aux leptospires et lies 'a leur virulence et enfin la nature et la cytopathologie des alterations que presentent les cellules infectees et qui sont peut-etre semblables aux effets pathologiques observes au cours de l'infection in vivo. Les differences eventuelles, qualitatives et quanti- tatives, dans la pathologie de l'infection chez l'ani- mal suivant le serotype, meriteraient de retenir da- vantage l'attention. Outre les facteurs inherents aux leptospires, ceux qui sont relatifs 'a l'hote devraient aussi etre consideres. Parmi ceux qui peuvent, isole- ment ou en association, influer sur la pathogenie et les manifestations de la maladie on peut citer: I'age et l'etat nutritionnel, l'esp'ece et la capacite genetique d'expression d'une reponse immunitaire. Les observations de plusieurs groupes de cher- cheurs tendent a prouver 1'existence, dans les extraits ou fractions acellulaires de leptospires, d'une activite pathogene rappelant celle des endotoxines des bacte- ries Gram-negatives. L'elucidation de son role de- mande une etude plus approfondie de la nature chimique et serologique des preparations purifiees ainsi que de leurs effets. On ne peut d'autre part ecarter la possibilite que des produits du metabolisme in vivo des leptospires (des lipides, peut-etre) soient toxiques. tPIDEMIOLOGIE Repartition geographique Des etudes epidemiologiques menees sans rel'ache ont permis de mieux connaitre la repartition de la leptospirose dans les diff6rentes parties du monde, mais pour bien des regions les donnees epid6miologi- ques manquent encore. Des renseignements sur la presence des differents serotypes devraient etre syste- matiquement recueillis et gardes 'a jour dans le mon- de entier.1 Re'servoirs animaux A part la decouverte continuelle d'autres hotes animaux, aucun fait nouveau n'a ete enregistre de- puis le rapport du Groupe OMS d'experts des pro- blemes actuels des recherches sur la leptospirose (1967). Les problemes et les questions examines dans ce rapport sont toujours d'actualite. Cycles e'pidemiques et enquetes Les enquetes ecologiques menees dans les zones d'endemie ont fourni d'interessants renseignements sur la dynamique de l'activite epizootique des foyers naturels. Les conditions locales: presence d'eau cou- rante ou stagnante, d'un sol humide ou sec, fr& quence des contacts entre les animaux sauvages por- teurs de germes, les animaux domestiques et l'hom- me, etc., prennent dans ce processus une importance considerable. Dans de nombreuses zones d'enzootie, l'infection se propage en chaine de 1'espece-h6te aux autres especes animales qui partagent la meme biocenose (phenomene dit d'irradiation). Le degre d'infectiosite de l'hote principal et celui de l'ensemble de la popu- lation animale fournissent une bonne indication sur l'activite d'un foyer. Des renseignements de cet or- dre, systematiquement recueillis, peuvent servir de base 'a l'organisation d'une surveillance de la maladie et de mesures destinees 'a prevenir les flamb6es epide- miques. Etant donne l'instabilite des conditions epi- d6miologiques, la surveillance systematique est le seul moyen qui permette desperer reunir des rensei- 1 Les renseignements concernant l'identification de nou- veaux serotypes ou de nouveaux hotes en quelque pays que ce soit doivent etre soumis a: Mrs Catherine Sulzer, Lepto- spirosis Unit, Center for Disease Control, Atlanta, Ga., Etats-Unis d'Amerique, en vue de leur utilisation lors des revisions des listes de repartition des serotypes de leptospires classes en fonction du pays et de F'h6te. RECHERCHES SUR LA LEPTOSPIROSE 649 gnements utiles sur les facteurs qui jouent un role dans les cycles epidemiologiques et sur l'opportunite de mettre en ceuvre des mesures preventives ration- nelles. Les methodes de surveillance doivent etre mises au point a l'dchelon national avant de s'inscrire dans le cadre d'une action internationale dans ce domaine. Les informations ainsi recueillies sur la leptospirose, quel que soit le secteur ou la periode consideree, ne seront sOrs que dans la mesure oiu les enquetes auront e menees sous un controle statistique rigoureux.1 IMMUNISATION ET THERAPEUTIQUE Vaccins Pour inactiver les leptospires on a tente soit l'irra- diation gamma soit l'addition de streptomycine a des cultures bien developpees. Ces leptospires inactives sont toujours mobiles mais ne sont plus infectants pour l'animal et ne peuvent plus se multiplier. A partir de ces germes, des vaccins ont ete prepares qui ont ete essayes sur des animaux de laboratoire et, 'a tres petite echelle, sur des bovins et des porcins. Ces vaccins sont satisfaisants quant 'a la securite d'emploi mais leur efficacite est douteuse. Pour l'instant, rien ne prouve qu'ils protegent plus efficacement que les vaccins formoles contre l'instauration de I'e'tat de porteur. L'emploi de vaccin vivant, avirulent, obtenu 'a partir de leptospires cultives dans des milieux spe- ciaux, a ete propose (Stahlheim, 1968), mais l'effica- cite de ces preparations demande encore 'a etre etu- diee. Il serait d'autre part utile de savoir si, et dans quelle mesure, l'efficacite des vaccins vivants est fonction de la croissance des leptospires in vivo. Les vaccins vivants presentent l'inconvenient de ne pas supporter la conservation et, une fois prdpares, de devoir etre utilises sans delai. Il faudrait autant que possible identifier l'antigene immunisant present dans les vaccins et, afin de per- mettre la comparaison et l'evaluation des prepara- tions de divers laboratoires, en mesurer la teneur en antigenes et l'activite par les methodes normalisees actuellement admises. Immunite croisee et vaccin polyvalent Dans les regions 'a leptospiroses multiples, il con- vient de poursuivre les efforts en vue de la prepara- tion de vaccins polyvalents ayant un large spectre antigenique mais contenant le moins possible de serotypes. 1 Des conseils sur l'organisation statistique des enquetes peuvent etre obtenus gratuitement aupres de l'OMS. Therapeutique L'hemodialyse, peritoneale ou autre, a montre son utilite dans le traitement des malades atteints d'in- suffisance renale. Mais pour mettre 'a profit les nou- veautes apparues dans le domaine des antibiotiques, il est indispensable que les recherches sur la thera- peutique de la leptospirose soient poursuivies. SUJETS DE RECHERCHE II est propose de poursuivre l'etude des sujets suivants: 1) Ultrastructure des leptospires et nature chimi- que de leurs divers constituants structuraux; 2) Caracteristiques immunologiques des compo- sants antigeniques des leptospires; 3) Mise au point de milieux de culture; 4) Immunite croisee conferee par les infections naturelles et par les vaccins; 5) Classes immunoglobuliniques des anticorps anti-leptospires chez 1'homme et chez divers ani- maux; 6) Lyse des leptospires par les divers facteurs presents dans les serums normaux et immuns; 7) Processus metaboliques, des souches pathoge- nes notamment; 8) Activite lipolytique des souches; 9) Genetique des leptospires; 10) Perfectionnement des techniques d'immuno- fluorescence et du materiel qu'elles utilisent; 11) Mise au point et evaluation d'epreuves serolo- giques, en particulier d'epreuves de depistage appli- cables aux serums de betail et d'autres animaux; 12) R6le des facteurs propres aux leptospires et 'a l'h6te dans la pathogenese et les manifestations des leptospiroses; 13) Epidemiologie des leptospiroses; 14) Organisation de programmes de surveillance; 15) Preparation et mise 'a 1'epreuve des vaccins; 16) Efficacite des nouveaux antibiotiques. * * Dr M. Abdussalam, Chef du Service de Sant6 publique veterinaire, Organisation mondiale de la Sant6, Geneve, Suisse Dr A. D. Alexander, Laboratoire OMS/FAO de reference pour la leptospirose, Walter Reed Army Institute of Research, Washington, D. C., Etats-Unis d'Amerique Professeur B. Babudieri, Laboratoire OMS/FAO de refe- rence pour la leptospirose, Istituto Superiore di Sanita, Rome, Italie 650 MEMORANDA Dr K. Bogel, Service de Sante publique veterinaire, Organisation mondiale de la Sante, Geneve, Suisse Dr C. Borg-Petersen, Statens Seruminstitut, Copenhague, Danemark Professeur S. Faine, Departement de Microbiologie, Monash University Medical School, Melbourne, Aus- tralie Professeur E. Kmety, Departement d'Epid6miologie, Uni- versite Komensky, Bratislava, Tch&coslovaquie Mme C. Lataste-Dorolle, Chef du Laboratoire des lepto- spiroses, Institut Pasteur, Paris, France Dr L. H. Turner, Laboratoire OMS/FAO de ref6rence pour la leptospirose, London School of Hygiene and Tropical Medicine, Londres, Angleterre. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Anderson, D. L. & Johnson, R. C. (1968) J. Bact., 95, 2293-2309 Babudieri, B. (1959) Vaccine against leptospirosis. In: Proceedings of the 5th International Meeting of Micro- biological Standardization, Jerusalem, pp. 313-336 Bakoss, P. & Chorvath, B. (1965) Arch. Inst. Pasteur Tunis, 42, 171-178 Baseman, J. B. & Cox, C. D. (1969a) J. Bact., 87, 992-1000 Baseman, J. B. & Cox, C. D. (1969b) J. Bact., 97, 1001-1004 Bazovska, S. & Kmety, E. (1968) Brat. lek. Listy, 47, 205-208 Borg-Petersen, C. (1971) Trop. geogr. Med., 23, 282-285 Buchanan, R. E. et al., ed. (1966) Index Bergeyana, Baltimore, Williams & Wilkins Chang, A. & Faine, S. (1970) Bull. Org. mond. Sante, 43, 571-577 Chang, A. et al. (1970) In: Abstracts ofthe 10th Internatio- nal Congress for Microbiology, Mexico, p. 77 Ellinghausen, H. C. & McCullough, W. G. 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