Le rôle de la caractérisation génétique et moléculaire des virus en ce qui concerne la surveillance et l'épidémiologie de la grippe : mémorandum OMS

Memoranda are state- Les Mimorandums ments concerning the exposent les conclu-M1KlCr1emnoran ta conclusions or recom- sions et recomman- mendations of certain dations de certaines WHO scientific meet- reunions scientifiquesMlvlemoranaums ings; they are signed de l'OMS; ils sontby the participants in signes par les partici- the meeting. pants a ces reunions. Bulletin de l'Organisation mondiale de la Sante, 60 (2): 193 - 198 (1982) Le rOle de la caracterisation genetique et moleculaire des virus en ce qui concerne la surveillance et l'epidemiologie de la grippe: Memorandum OMS* Un certain nombre de techniques d'analyse recemment mises au point ont e6te utilise&es dans de nombreux laboratoires pour tenter de ddtfinir plus compltement les structures gedndtiques et antige6niques des virus grippaux. L'applicabilite' de certaines de ces techniques et la valeur des resultats qu'elles permettent d'obtenir sont examindes dans ce Mdmorandum. Les techniques considdre'es sont de complexite variable, allant de l'Plectrophorese comparative des ARN viraux en gel de polyacrylamide a la de6termination des sequences des acides nucMiques des genes viraux et des se'quences d'acides amines des protmines correspondantes. L'isolement et l'identification des virus grippaux A et B est la tache principale du programme interna- tional OMS de surveillance de la grippe. Les virus isoles dans les centres nationaux de la grippe sont identifies localement dans la plupart des cas a l'aide de reactifs fournis par l'Organisation mondiale de la Sante. Tout virus grippal suspect qui ne peut pas etre facilement identifie est potentiellement le membre d'un nouveau sous-type ou un variant ayant une importance epidemiologique, et il est immediatement expedi' A l'un des deux Centres collaborateurs OMS de reference et de recherche pour la grippe, de Londres et d'Atlanta, en vue d'une analyse antige- nique plus poussee. En meme temps, les laboratoires nationaux s'efforcent d'obtenir toutes les donnees possibles A propos des circonstances de ces isole- ments de virus, et notamment des renseignements epidemiologiques et serologiques sur l'infection humaine. Les virus requs dans les centres collaborateurs OMS sont habituellement caracterises par des methodes classiques telles que l'inhibition de * Ce Memorandum a et prepare par les signataires dont les noms figurent a la page 197, a l'occasion d'une reunion OMS qui s'est tenue a Geneve les 17- 19 fevrier 1981. La version originale en anglais a e publiee dans le Bulletin de l'Organisation mondiale de la Sante, 59: 875 - 879 (1981). Les demandes de tires a part doivent etre adressees a: Chef du Service des Maladies a Virus, Organisation mondiale de la Sante, 1211 Geneve 27, Suisse. l'hemagglutination et l'inhibition de la neuramini- dase a l'aide d'une batterie d'immunserums speci- fiques. Cependant, il existe maintenant, en outre, une large gamme de techniques moleculaires qui peuvent etre utilisees pour une caracterisation plus poussee d'isolements choisis. Ce Memorandum examine les avantages relatifs et la facilite d'application de certaines de ces methodes analytiques et evalue l'importance des renseigne- ments qu'elles fournissent pour les programmes de surveillance. tLECTROPHORtSE EN GEL DE POLYACRYLAMIDE DES ARN DES VIRIONS Les virus grippaux de types A et B contiennent 8 segments de genome constitues d'ARN qui portent l'information relative a 8 proteines virales au moins, designees par PI, P2, P3, H (hemagglutinine), NP (nucleoproteine), N (neuraminidase), MP (proteine matricielle), et NS (proteine non structurale). L'electrophorese des segments d'ARN du virion (ARNv) en gel de polyacrylamide est un precieux instrument pour comparer les virus grippaux A et B. Pour ces experiences, on peut marquer I'ARN en cultivant le virus en culture de tissu en presence de 4165 -193 MEMORANDUM OMS 32p ou 3H-uridine ou le marquer in vitro avec du 1251 ou par addition enzymatique de 32P aux extremites 5' ou 3'; un autre moyen d'identifier les ARN des virus grippaux apres separation electrophoretique est de les colorer avec du bromure d'ethidium. Ces methodes ont e passees en revue par Palese (1). La comparaison des modes de migration des ARN des differents virus revele souvent des differences dans les taux de migration des segments d'ARN correspondants. Cela permet de determiner assez rapidement les genomes des virus recombinants provenant de parents connus, par simple compa- raison des taux de migration des ARN provenant des recombinants et des ARN provenant des parents. Les differences dans les taux de migration entre des segments equivalents d'ARN appartenant A diff& rents virus dependent probablement de differences de conformation entre les ARN et peuvent donc ne pas refleter le degre de parente des sequences de differents segments d'ARN. Ainsi, il est peu probable que l'analyse electro- phoretique de l'ARNv puisse fournir des preuves concluantes en ce qui concerne la similitude genetique d'isolements faits sur le terrain. Cela a e confirme A diverses occasions lorsqu'on a observe que, chez des virus tres proches les uns des autres, les modes de migration de l'ARNv etaient differents. De ce fait, la valeur de la methode pour des etudes epidemiologiques reside dans la demonstration de ressemblances possibles entre des isolements inhabituels et des virus de reference de laboratoire, et dans l'identification de virus recombinants, ce qui peut etre ensuite confirme par des methodes plus definitives. L'electrophorese est egalement utilis6e pour l'isolement de segments d'ARN destines A servir de reactifs et de «sondes)) dans l'hybridation d'acides nucleiques, 1'etablissement de cartes d'oligonucleotides ou des methodes de determina- tion des sequences. COMPARAISON DES PROTEINES PAR DES METHODES ELECTROPHORETIQUES ET CHROMATOGRAPHIQUES Les proteines du virus grippal peuvent etre compa- rees par electrophorese en gel de polyacrylamide (PAGE), en presence du detergent ionique dodecyl- sulfate de sodium (SDS). Lorsque cette methode a et& originellement appliquee A des virus desintegres par le detergent, il y avait certaines discordances dans les resultats obtenus avec differentes souches etudiees dans differents laboratoires. Ces discor- dances ont neanmoins et en grande partie eliminees et on a obtenu une meilleure resolution grace A l'utilisation de systemes tampons discontinus (2). Des difficultes persistent cependant encore pour la resolution des composants P I, P2 et P3 et pour l'identification du polypeptide neuraminidasique, ainsi que pour la detection du petit polypeptide NS2. Bien que, par la technique SDS-PAGE, on distingue les polypeptides principalement sur la base de differences dans la masse moleculaire relative, les taux de migration relatifs peuvent etre modifies par des facteurs tels que la concentration d'acrylamide ou le type de systeme tampon utilise. Cela implique que la charge ou que la conformation du polypeptide peut egalement affecter les taux de migration, et parce que ces proprietes peuvent etre modifiees par un relativement petit nombre de changements dans les sequences d'acides amines ou des modifications dans le nombre ou l'emplacement des sites de glyco- sylation, la comparaison des taux de migration rela- tifs des polypeptides pour les differents isolements de virus a peu de chances d'etre un moyen fiable de comparer leur similitude structurale. Cependant, la methode SDS-PAGE est precieuse pour les etudes comparatives en vue de la determina- tion indirecte de la composition du genome de recombinants obtenus au laboratoire (egalement designes comme virus reassortis), ainsi que pour l'isolement des polypeptides en vue d'une compa- raison supplementaire par l'etablissement de la carte des peptides. Bien que l'analyse du genome des recombinants ne soit generalement pas entreprise dans les programmes de surveillance de la grippe, l'existence de recombinaison naturelle entre des souches grippales A(HIN1) et (H3N2) au cours de leur co-circulation en 1978 - 79, en a fait un domaine qui retient l'interet. Une methode simple comme celle-ci pour la determination du genotype des isole- ments peut donc ere utile. De meme, cette methode peut servir pour la comparaison initiale entre des virus prototypes de laboratoire et des isolements effectues sur le terrain lorsqu'il existe une possibilite de contamination de laboratoire, car cette methode exige des moyens moins complexes que l'analyse des ARN. Les etudes des cartes des peptides peuvent etre facilitees par l'utilisation de la technique SDS-PAGE pour isoler les proteines. Les polypeptides speci- fiques de virus, soit colores, soit radiomarques, iden- tifies par SDS-PAGE, peuvent etre recuperes A l'tat semi-purifie si l'on decoupe le fragment de gel contenant le polypeptide; on peut alors les digerer partiellement ou- compltement A l'aide d'enzymes proteolytiques, soit in situ, soit apres elution A partir du gel. Les peptides obtenus par cette methode ou par d'autres peuvent etre analyses par des techniques telles que la chromatographie en phase liquide haute performance, la chromatographie sur colonne A phases inversees ainsi que l'electrophorese et la chro- 194 CARACTERISATION GENETIQUE ET MOLECULAIRE DES VIRUS GRIPPAUX matographie bidimensionnelles sur papier ou en couche mince. Les methodes d'etablissement des cartes des pep- tides, particulierement celles qui font appel a une digestion proteolytique complete plutot que par- tielle, donnent des resultats directement en rapport avec la sequence des acides amines et ce sont montrees utiles, par exemple, pour comparer les hemagglutinines de virus differant au point de vue antigenique (3). Les avantages de ces methodes sont notamment a) la possibilite de comparer une grande fraction de n'importe quel polypeptide (tous les peptides solubles), b) la possibilite de comparer des proteines sans avoir recours a des isotopes radioactifs, par exemple dans le cas de polypeptides tels que H, NP, et MP, qui peuvent etre purifies en grande quantite a partir de virus cultives en oeufs, et puis detectes par coloration. Les inconvenients sont notamment la difficulte d'obtenir certains polypeptides, en particu- lier P1, P2, et P3 en quantite suffisante et dans un etat de purete satisfaisant. HYBRIDATION DES ACIDES NUCLEIQUES L'hybridation est une methode rapide pour evaluer l'homologie des sequences de bases entre les ARN viraux. Quatre methodes differentes ont e utilisees. Electrophorese de l'ARN bicatenaire De l'ARN complementaire marque (ARNc), pro- venant de cellules infectees traitees par le cyclohexi- mide, est hybride avec de I'ARN non marque du virion (ARNv); ensuite, les hybrides bicatenaires ARNc/ARNv sont traites par la S,-nuclease et l'on procede a l'analyse par electrophorese en gel de polyacrylamide. Cela permet de deceler de tres legeres differences, c'est-a-dire des mutations ponc- tuelles, dans les genes que l'on compare. En cas d'homologie complte entre les molecules d'ARNv et d'ARNc, les complexes bicatenaires sont complete- ment resistants au traitement par la S,-nuclease et leurs mobilites electrophoretiques n'en sont pas modifiees. Si l'homologie est incomplete, la mobilite electrophoretique du segment hybride peut changer ou bien ce segment peut ne plus etre du tout dece- lable (4, 5). Hybridation directe ARN-ARN De l'ARNc non marque est extrait a partir de cellules infectees de virus grippal et est utilise pour proteger des segments d'ARNv, au moyen de l'hybri- dation, contre la digestion par la RNase. En cas d'hybridation homologue, la protection avoisine 100%; lorsque l'hybridation est heterologue, le degre de protection depend de l'etendue de l'homologie des sequences de bases, de meme que de la distribution des sequences homologues dans les molecules d'ARN (6). Hybridation competitive ARN-ARN De l'ARNv radiomarque est hybride avec de l'ARNc homologue isole de cellules infectees. L'ARNv homologue est deplace par chauffage de l'ARN bicatenaire avec un exces d'ARNv non marque (7). Comme dans les methodes precedentes, l'ampleur de la competition depend de l'homologie des sequences et de sa distribution moleculaire. Hybridation ADN-ARN De l'ADNc radiomarque est prepare par transcrip- tion de l'ARN viral au moyen d'une transcriptase inverse en presence d'actinomycine D. L'ADNc monocatenaire marque est hybride avec l'ARNv non marque et les regions monocatenaires sont digerees par la S,-nuclease. L'application de ces methodes d'hybridation a permis notamment de demontrer la parente gene- tique etroite des virus HIN I isoles en 1950 et 1977, et d'estimer le degre de parente de virus de differents sous-types. Les quatre methodes ont &te utilisees pour comparer la composition genetique des virus grip- paux, mais les mutations ponctuelles echappent par- fois a ces quatre methodes et seules les trois dernieres fournissent des donnees quantitatives. Les homologies des sequences de bases determi- nees peuvent etre sous-estimees en comparaison avec celles qui sont deduites des donnees de sequences. En regle generale, les resultats obtenus par l'hybridation ADN-ARN sont plus faibles que ceux que donne l'hybridation ARN-ARN. CARTE DES OLIGONUCLEOTIDES L'Utablissement de la carte des oligonucl&otides («fingerprints>> de I'ARN) d'ARN radiomarques comporte un clivage enzymatique specifique des segments d'ARN, suivi par une separation bidimen- sionnelle des produits de ce clivage (8). On peut obtenir une activite specifique elevee par le radio- marquage effectue in vitro. Les inconvenients de la technique sont notamment le fait que l'analyse est axee sur l'identification d'oligonucleotides uniques contenant un minimum d'environ 7 bases. Par consequent, seule une petite partie de 1'ARN est representee dans les oligonucleo- 195 MEMORANDUM OMS tides qui sont compares. Un autre inconvenient de la technique se manifeste lorsque l'on compare deux ARN dont l'homologie de sequences est inferieure a environ 90%o. Dans de tels cas, et si les modifications sont reparties dans tout le genome, les cartes des oligonucleotides des deux ARN n'auront en commun, au mieux, qu'un petit nombre d'oligo- nucleotides uniques malgre l'existence d'une homo- logie dans les sequences des bases pouvant aller jusqu'a environ 90% (9). Les applications de cette methode sont notamment l'analyse des relations entre genomes de virus etroite- ment apparentes (10). Par exemple, il a e montre par l'etablissement de cartes des oligonucleotides que les huit ARN etudies, qui provenaient d'isolements HINI de 1977, etaient tous tres similaires a ceux des souches qui avaient circule en 1950 (11) et que certains virus du sous-type HIN I, isoles depuis 1977, etaient des recombinants entre des virus des sous- types HINI et H3N2 (12). DETERMINATION DES SEQUENCES DES ACIDES NUCLEIQUES ET DES PROTEINES Les methodes les plus concluantes pour comparer les virus grippaux comportent la determination des sequences des acides nucleiques des genes viraux et celle des sequences des acides amines des proteines correspondantes. Par des methodes classiques, on a determine des sequences etendues d'acides amines des hemagglutinines representatives des sous-types H2 et H3 (13, 14). Les analyses des sequences de nucleotides termi- naux des ARN viraux ont e faites directement par des methodes comportant une digestion partielle, par des nucleases specifiques, des ARN marques en posi- tion terminale ou le clivage d'ARN A marquage terminal apres une modification chimique limitee. D'autre part, les sequences compltes des nucleotides de plusieurs ARN viraux ont et obtenues, soit par la determination des sequences de copies ADN des genes apres clonage dans des bacteries, soit grace a l'utilisation de fragments specifiques d'ADN de ce type comme amorces dans des analyses de sequences de nucleotides comportant la synthese d'ADN. Les deux methodes de determination des sequences d'ADN utilisees comportent, soit le clivage de mo1e- cules d'ADN a marquage terminal specifiquement modifiees et la separation des fragments ainsi obtenus par electrophorese en gel de polyacrylamide (15), soit l'utilisation d'une ADN-polymerase, d'amorces monocatenaires d'ADN et d'inhibiteurs specifiques arretant I'allongement des chaines afin de fournir des collections similaires d'oligodesoxy- nuclkotides de differentes longueurs qui sont, eux aussi, analyses par electrophorese en gel de polyacryl- amide. Outre les sequences compltes des nucleo- tides, on a egalement obtenu des donnees sur les sequences terminales A l'aide de modifications de la derniere methode. Grace A ces procedes, les sequences compltes des nucleotides des genes des hemagglutinines de quatre sous-types (HI, H2, H3 et H7) ont e determinees, notamment celles de trois representants du sous-type H3 (16). De meme les sequences des nucleotides des septieme et huitieme ARN viraux les plus gros, codant les proteines MP et NS, respectivement, ont et determinees A partir de virus du sous-type HI dans le premier cas et de trois virus des sous-types H1, H3 et H7 pour le dernier. I1 est clair que si elle fournit des renseignements definitifs, la determination des sequences des acides nucleiques exige I'application de plusieurs techniques et qu'elle est plus complexe que les autres methodes decrites. ANALYSE ANTIGENIQUE AU MOYEN D'ANTICORPS MONOCLONAUX La capacite de cloner des cellules productrices d'anticorps fournit la possibilite d'utiliser des anti- corps monoclonaux pour une analyse detaillee des virus grippaux d'apres les sites antigeniques indivi- duels, et de telles preparations ont et utilisees pour caracteriser les antigenes H, N et NP d'un certain nombre de virus (17). Ces dernieres annees, des anticorps monoclonaux ont et evalues par les centres collaborateurs OMS de reference et de recherche pour la grippe de Londres et d'Atlanta A des fins d'identification de virus grip- paux, par comparaison de ces anticorps avec des immunserums de furet obtenus apres infection. A I'heure actuelle, ils ne sont pas utilises comme moyen principal de caracterisation des souches, mais des preparations choisies peuvent etre utiles comme complement A l'emploi d'immunserums animaux specifiques, particulierement pour differencier des variants tres etroitement apparentes. CONCLUSIONS II est hors de doute que, dans les recherches sur la structure et la replication des virus grippaux, I'appli- cation des methodes decrites ci-dessus a et d'une valeur immense; la determination des sequences totales des nuclkotides des genes des hemagglutinines est d'un interet particulier, car elle a fourni le fonde- ment de la connaissance de la variation antigenique. 196 CARACTERISATION GENETIQUE ET MOLECULAIRE DES VIRUS GRIPPAUX 197 De meme, ces methodes ont presente une valeur epi- demiologique immediate permettant de determiner la composition genetique des virus du sous-type HINI qui sont reapparus en 1977 et de comparer cette composition avec celle des souches de 1950, de deceler les genomes reassortis dans les isolements HINI de 1978-79, et de demontrer la parente de virus isoles pendant la periode 1933 - 57, lesquels ont tous e reconnus maintenant comme des membres du sous-type HI NI. De telles applications devraient se poursuivre. En dehors des methodes d'etablissement des sequences des acides nucleiques et des proteines, toutes les autres methodes decrites peuvent etre utili- sees pour comparer la composition genetique des isolements de virus a celle des souches prototypes; elles demandent toutes une experience considerable tant en ce qui concerne 1'execution qu'en ce qui concerne l'interpretation des resultats. Pour la comparaison courante, les procedes comportant l'electrophorese en gel de polyacrylamide des poly- peptides specifiques des particules virales ou des cellules infectees, ou celle des ARN viraux peuvent etre les plus simples a appliquer. Cependant, les ren- seignements qu'ils fournissent sont souvent de valeur limitee. De meme, les comparaisons a l'aide de l'ana- lyse des hybrides ARN-ARN par electrophorese en gel de polyacrylamide ou a l'aide de cartes des oligo- nucleotides peuvent reveler des differences entre les ARN des virus compares, mais les renseignements obtenus sont de nature qualitative. On peut obtenir egalement des donnees qualitatives par les autres methodes d'hybridation des acides nucleiques de- crites ci-dessus. Du fait de ces inconvenients, on utilise, pour I'ana- lyse des virus ayant un interet particulier, differentes combinaisons de ces methodes en fonction de 1'expe- rience des chercheurs et de la disponibilite de reactifs. Les centres collaborateurs OMS de reference et de recherche pour la grippe a Londres et Atlanta ont activement applique les techniques moleculaires au programme OMS de surveillance de la grippe. La publication de ce Memorandum suscitera, on l'espere, d'autres echanges d'information, de virus et de reactifs entre les centres collaborateurs OMS et les chercheurs individuels travaillant sur ces methodes genetiques et moleculaires. La valeur de tels echanges, tant pour le programme OMS que pour ces scientifiques, ne saurait etre surestimee. * * F. Assaad, Maladies a Virus, Organisation mondiale de la Sante, Geneve, Suisse P. Bres, Maladies a Virus, Organisation mondiale de la Sante, Geneve, Suisse F. Ennis, Bureau of Biologics, National Institutes of Health, Bethesda, MD, Etats-Unis d'Amerique K. Esteves, Maladies a Virus, Organisation mondiale de la Sante, Geneve, Suisse Y. Z. Ghendon, Laboratoire de Genetique et de Bio- chimie des Virus, Institut de Recherche sur les Preparations virales, Moscou, URSS A. P. Kendal, Directeur adjoint du Centre collabo- rateur OMS de Reference et de Recherche pour la Grippe, Centers for Disease Control, Atlanta, GA, Etats-Unis d'Amerique P. 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